水稻转基因检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及检测用品领域内的一种水稻转基因检测试剂盒，由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为6重双启动寡核苷酸引物组合，膜芯片为顺序固定在支持膜表面的6组探针序列和一组阳性对照探针序列，各探针的5’端做氨基标志；引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志的Tag引物。本发明克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，提供的水稻转基因检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉。
【专利说明】水稻转基因检测试剂盒
所属【技术领域】
[0001]本发明涉及检测用品领域，具体为一种水稻转基因检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]水稻是我国的主粮农作物，每年消费量近两亿吨。随着转基因技术在农业产业中的应用，多种抗虫基因(CrylAb，CrylAc, CrylAb/Ac等)和抗除草剂基因(BAR等)被用于转基因水稻的研发。1998年，我国育成了首例转基因抗虫水稻，之后多个转基因水稻品系相继被研发出来。在关注经济效益的同时，转基因水稻的环境和食品安全问题同样需要引起社会的高度重视。对于转基因产品的管理，各国已经相继制定并出台了相应的法律法规，对转基因作物的环境释放和产品销售采取严格的管理措施。我国于2001年5月23日发布了国务院第304号令《农业转基因生物安全管理条例》，实现了对转基因生物的规范管理。因此，快速、准确、灵敏、廉价和相应通量的转基因产品检测技术是非常关键的。转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫试纸条和Western杂交等方法是目前主要的基于蛋白的检测方法，其共同特点是需要通过一定的处理步骤从样品中释放出目标蛋白(抗原)，然后利用抗体特异性的结合抗原蛋白，最后通过酶标或金属标偶联抗体与抗原抗体复合物结合，从而产生可检测的信号，该类方法的缺点是检测灵敏度相对较低，并且需要制备高特异性抗体，同时检测容易受到多种因素的影响，出现假阳性。而基于核酸的检测方法是目前最普遍、最准确的转基因检测技术，检测方法主要包括PCR (聚合酶链式反应)技术和基于分子杂交的基因芯片技术。目前仍以PCR技术应用最为广泛，其常用的技术方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、荧光定量PCR等方法。普通定性PCR方法检测效率低，尤其检测多基因对象时更加费时费力；巢式PCR虽然提高了检测的灵敏度，但同样存在检测效率低的问题；多重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因，但常规的电泳检测结果很难判断，容易出现假阳性和假阴性结果；荧光定量PCR方法灵敏度`高，但其成本高，并且需要特殊检测仪器。基因芯片也是常用的转基因产品检测技术，目前一般采用玻璃片作为固相支持物，实验过程需要相应的点样仪和芯片识读仪，同样成本较高。因此研发一种快速、方便、灵敏、廉价、可视化和高通量的检测方法将具有非常好的应用前景。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是为了克服现有技术费时费力成本高的缺陷，提供一种操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉的水稻转基因检测试剂盒。
[0004]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
本发明的水稻转基因检测试剂盒由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为6重双启动寡核苷酸引物(DPO)组合，各对引物的碱基序列5’ -3’如下，其中碱基I为次黄嘌呤核苷酸:
CrylAb:正向引物:ATTCAATTCAACGACATGAAIIIIICCTTGAC反向引物:TTGTAACGGCTATTGATGGTIIIIICATCGAA ；
CrylAc:正向引物:TTCAGGACCAGGATTCACTGIIIIIGACCTCG 反向引物:AGGTGAATAGGGGTCACAGAIIIIIACCTCAC ；
BAR:正向引物:GACGACCTCGTCCGTCTGCGI 111 IGCTATCC 反向引物:CAGCAGGTGGGTGTAGAGCGIIIIICCCAGTC ；
CaMV35S:正向引物:GATAAAGGAAAGGCCATCGTIIIIIATGCCTC 反向引物:TGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGA ；
NOS 3’:正向引物:TTAAGATTGAATCCTGTTGCIIIIITTGCGAT 反向引物:CGCGCGCGATAATTTATCCTIIIIIGCGCGCT ； gos9:正向引物:ACAGATATATAGGGCAGAAAIIIIIGCTACAA 反向引物:CGTCACGTTCTTCAGGCTATIIIIIGGTACAG ；
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的6组探针序列和一组阳性对照(Positive)探针序列，6组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’ -3’如下，各探针的5’端做氨基标志(NH2):
CrylAb 探针:NH2_5’ -GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTA GCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGG-3’ ；
CrylAc 探针:NH2_5’ -TAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCA CATCTACCAGATATAGAGTTC-3’ ；
BAR 探针:NH2-5’ -cgcaacgcctacgactgg`acggccgagtcgaccgtgta
CGTCTCCCCCCGCCACCAGCG-3’ ；
CaMV35S 探针:NH2_5’ -AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCA CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG-3’ ；
NOS 3’ 探针:NH2-5’ -atgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattata
CATTTAATACGCGATAGAAAA-3’ ；
gos9 探针:NH2-5’ -gcacaaagcttgttaagattggtccatggggtggaaat GGAGGAGGTTCTGTAGACATA-3’ ；
Positive 探针:NH2_5，-TAGCAAGGATGAGTATTCGAACAGTTAGAGGCAGT CAGGGAGAATCACTACGTACAAGC-3’。
[0005]上述方案中，所述引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志(biotin)的Tag引物，其碱基顺序如下所示:
Tag 引物:biotin-5，- GACGGACACCTACCCATATCACCCTTGACG -3，。
[0006]上述方案中，所述水稻转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、EX_Taq聚合酶(Polymerase)和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为biotin-5’ - GCTTGTACGTAGTGATTCTCCCTGACTGCCTCTAACTGTTCGAATACTCATCCTTGCTA-3’。
[0007]上述方案中，所述水稻转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10XPCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺(TMB )显色液。
[0008]上述方案中，所述预杂交液为5XSSC (0.75M氯化钠，0.075M柠檬酸钠)，0.1%重量百分比SDS (十二烷基磺酸钠)和lOXDenhardt’ S液(1% Ficoll聚蔗糖，1%polyvinylpyrrolidone聚乙烯吡咯烧酮，1% BSA牛血清白蛋白)；杂交液为5XSSC,0.1%重量百分比SDS，5XDenhardt’ S，50%重量百分比去离子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA ；洗液分别为洗液1:2XSSC和0.1%重量百分比SDS，洗液2:0.5XSSC和0.1%重量百分比305，洗液3:100 mM (毫摩尔/升)Tris-HCl，ρΗ7.5，150 mM NaCl，洗液4:100 mM Tris-HCl,pH9.5,100 mM NaCl和100 mM MgCl2 ;封闭液为3%重量百分比BSA (牛血清白蛋白)，100mM Tris-HCl, pH7.5,150 mM NaCl ;四甲基联苯胺显色液分别为四甲基联苯胺显色液A液:200mM柠檬酸钠，pH5.4,0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液:3%重量百分比的H2O2用800体积的双蒸水稀释液，使用前A液B液等量混合配成四甲基联苯胺显色液。
[0009]上述方案中，所述支持膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
[0010]本发明的水稻转基因检测试剂盒采用多重PCR扩增的方法扩增目标序列。多重PCR扩增技术原理是将多对引物放到同一个反应管中进行PCR扩增，达到同时扩增2种或两种以上目标DNA序列的目的。本发明采用了 6重PCR扩增体系扩增目标序列，包括三种常见转基因序列CrylAb、CrylAc, BAR, 一个外源启动子序列CaMV35S，一个外源终止子序列NOS 3’和水稻内源基因序列gos9。
[0011]本发明设计采用DPO引物(Dual Priming Oligonucleotide,双启动寡核苷酸引物)进行目标序列扩增。本发明的DPO引物的碱基序列，是经过精心研究和大量实验得到的，其特点是引物之间不易形成二级结构，多重扩增的特异性强，与模板的错配概率小，只要有3个碱基以上的错配就不会成功扩增，既可以显著提高多重PCR扩增的特异性，又可以提高目标序列的扩增效率。
[0012]本发明采用5’端带氨基(NH2)修饰的探针进行目标序列杂交检测。氨基修饰的探针与膜结合更牢固，并且探针与膜的结合具有方向性，更利于探针与目标区域的杂交，从而提高检测的灵敏度。
[0013]本发明采用非对称PCR扩增技术(asymmetric PCR)用以提高检测灵敏度。非对称PCR扩增技术原理是在PCR扩增过程中采用不等量的正向引物和反向引物(或是扩增延伸条件不同的正向引物和反向引物)，PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的探针杂交，从而提高检测灵敏度。
[0014]本发明在多重PCR扩增同时进行非对称PCR扩增，采用的技术方案是在多重PCR反向引物的5’端添加5’端带生物素标志的Tag序列，同时在PCR反应体系中添加过量的5’端带生物素标志的Tag引物，Tag引物的喊基顺序与上述Tag序列的喊基顺序相同，该Tag引物Tm值(解链温度)比多重PCR正向引物Tm值高l(Tl5°C，用于非对称PCR阶段扩增单链DNA。在整个PCR扩增过程中，首先采用低退火温度(55飞(TC)进行多重PCR反应，其扩增产物主要是双链DNA，之后提高退火温度(65飞8°C)，使正向引物不能结合到模板上，只有Tag引物和反向引物可以结合到模板上并延伸扩增，从而产生大量5’端带生物素标志的单链DNA，该单链DNA用于接下来的膜芯片杂交检测。 [0015]本发明采用基于反向斑点杂交的可视化膜芯片技术进行转基因的分子杂交检测，其工作原理是首先将针对各个转基因序列的单链探针按顺序排列固定于支持膜表面的特定区域，再将待测的多重PCR产物与其杂交，这样PCR产物中的转基因序列单链DNA就会和支持膜上的探针杂交，经洗涤去除未结合的DNA样品，由于待测PCR产物的DNA上带有生物素标志，结合了待测DNA的探针点就偶联上了生物素标志物，再经过相应的显色反应就能读取对应的杂交信号，这样一张膜芯片上就可以同时检测多个转基因目标序列。本发明的水稻转基因检测试剂盒的检测探针为59碱基的寡核苷酸探针，其顺序排列于支持膜表面的特殊区域，形成低密度探针阵列。膜芯片同待测样本杂交后经底物显色可形成肉眼可视化的检测结果。
[0016]本发明提供一种多指标检测水稻转基因的可视化膜芯片试剂盒，其中待检测的目标序列包括常见的水稻转基因序列CrylAb、CrylAc, BAR,外源启动子序列CaMV35S，外源终止子序列NOS 3’和水稻内源基因gos9。通过该试剂盒的检测，可以快速准确的判断待检水稻产品中是否含有上述转基因序列，适合于转基因水稻产品的大规模筛查。
[0017]本发明的有益效果是:1)操作简单，经过一次样本前处理，单管PCR扩增，单芯片杂交就可以同步检测样本中多种转基因序列，具有平行分析和多重判断的特点；2)检验对象完备，包含了当前常见的转基因序列，并且可以很方便的加入新的检测序列；3)系统在多重PCR扩增过程同时进行了非对称PCR扩增，提高了系统的灵敏度和准确性；4)试剂盒采用了可视化膜芯片的检测方式，提高了系统的检测通量，并且检测结果可以直接用肉眼判断，方便，快捷；5)试剂盒操作简单，经济，无需特殊的昂贵仪器，适用于转基因水稻的大规模检测。
[0018]综上所述，本发明克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，提供的水稻转基因检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明用于检测转基因水稻品系LLRICE62的杂交结果图，其中图1A为芯片结果模式图，图1B为转基因水稻LLRICE62的检测结果图。
[0020]图2为本发明用于检测转基因水稻品系GM Shanyou 63的杂交结果图，其中图2A为芯片结果模式图，图2B为转基因水稻GM Shanyou 63的检测结果图。
[0021]图3为本发明用于检测非转基因水稻野生品系Norin 8的杂交结果图，其中图3A为芯片结果模式图，图3B为非转基因水稻野生品系Norin 8的检测结果图。
[0022]附图中，CrylAb:(苏云金芽孢杆菌CrylAb杀虫晶体蛋白基因)，CrylAc:(苏云金芽孢杆菌CrylAc杀虫晶体蛋白基因)，BAR:(草丁膦乙酰转移酶基因)，CaMV35S:(花椰菜花叶病毒35S启动子)，NOS 3’:(胭脂碱合成酶基因终止子)，gos9:(水稻根部表达的内源标准基因)，Positive:(阳性对照)，Barcode:(膜芯片条码)。
具体实施例
[0023]下面结合附图及实施例进一步详述本发明，但本发明不仅限于所述实施例。
[0024]实施例一
本例的水稻转基因检测试剂盒由引物组合和膜芯片组成，引物组合为6重DPO引物(Dual Priming Oligonucleotide,双启动寡核苷酸引物)组合，各对引物的碱基序列5’ -3’如下，其中碱基I为次黄嘌呤核苷酸:
CrylAb:正向引物:ATTCAATTCAACGACATGAAIIIIICCTTGAC 反向引物:TTGTAACGGCTATTGATGGTIIIIICATCGAA ；CrylAc:正向引物:TTCAGGACCAGGATTCACTGIIIIIGACCTCG 反向引物:AGGTGAATAGGGGTCACAGAIIIIIACCTCAC ；
BAR:正向引物:GACGACCTCGTCCGTCTGCGI111IGCTATCC 反向引物:CAGCAGGTGGGTGTAGAGCGIIIIICCCAGTC ；
CaMV35S:正向引物:GATAAAGGAAAGGCCATCGTIIIIIATGCCTC 反向引物:TGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGA ；
NOS 3’:正向引物:TTAAGATTGAATCCTGTTGCIIIIITTGCGAT 反向引物:CGCGCGCGATAATTTATCCTIIIIIGCGCGCT ； gos9:正向引物:ACAGATATATAGGGCAGAAAIIIIIGCTACAA 反向引物:CGTCACGTTCTTCAGGCTATIIIIIGGTACAG ； 本例的水稻转基因检测试剂盒的引物组合中同时包含非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志(biotin)的Tag引物，其碱基顺序如下所示:
Tag 引物:biotin-5，- GACGGACACCTACCCATATCACCCTTGACG -3，。
[0025]膜芯片为顺序固定在支持膜表面的6组探针序列和一组阳性对照(Positive)探针序列，6组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’ -3’如下:
CrylAb 探针:NH2_5’ -GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTA GCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGG-3’ ；
CrylAc 探针:NH2_5’ -TAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCA CATCTACCAGATATAGAGTTC-3’ ；
BAR 探针:NH2-5’ -cgcaacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgta
CGTCTCCCCCCGCCACCAGCG-3’ ；
CaMV35S 探针:NH2_5’ -AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCA CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG-3’ ；
NOS 3’ 探针:NH2-5’ -atgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattata
CATTTAATACGCGATAGAAAA-3’ ；
gos9 探针:NH2-5’ -gcacaaagcttgttaagattggtccatggggtggaaat GGAGGAGGTTCTGTAGACATA-3’ ；
Positive 探针:NH2_5，-TAGCAAGGATGAGTATTCGAACAGTTAGAGGCAGT CAGGGAGAATCACTACGTACAAGC-3’ ；
支持膜为硝酸纤维素膜。
[0026]通过相应的多重PCR引物设计，采用固相亚磷酰胺三酯法合成得到上述6重PCR组合引物和Tag引物。根据多重PCR扩增产物设计检测探针，采用固相亚磷酰胺三酯法合成探针，探针合成时同时合成阳性探针(positive probe)和对应的5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸(positive oligo)单链DNA, 5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的喊基顺序为:
biotin-5’- GCTTGTACGTAGTGATTCTCCCTGACTGCCTCTAACTGTTCGAATAC
TCATCCTTGCTA -3’。
[0027]将支持膜裁成1.2cmX 1.8cm的膜条，裁好的膜于双蒸水中浸泡15min,再用15 X SSC浸泡15min，取出，置于滤纸上，60°C烘1.5小时，膜条降温到室温后，将探针(5uM)顺序点在膜上，每个探针重复点样两次，以验证检测结果的可重复性，点样样式见图1A，膜条晾干后80°C烘2小时以固定探针，处理好的膜芯片室温保存。
[0028]按照北京康为世纪生物科技有限公司新型植物基因组DNA提取试剂盒(NuCleanPlantGen DNA Kit，CW0531)的说明提取转基因水稻品系LLRICE62的水稻基因组DNA,每30mg初始样本经抽提后用50ul ddH20 (双蒸水)溶解基因组DNA，并用紫外分光光度计将DNA溶液稀释至同一质量浓度(50ng/ul)。
[0029]PCR扩增的反应体系如下所示: ddH20:加至总体积50ul 10XPCR Buffer: 5ul
dNTP (2.5mM each): 5ul
PCR 引物(20 μ M): 0.5ul each
Tag primer (20 μ M): 3.5ul
EX-Taq Polymerase (Takara, 5U/ul): 0.5ul
提取的水稻基因组DNA (约50ng/ul): 2ul
对上述反应体系进行PCR循环扩增，PCR循环条件如下所示，反应过程由预变性、多重PCR循环I和非对称PCR循环2组成，条件分别为:
预变性:温度95°C，时间10分钟。
`[0030]多重PCR循环1:30个循环组成:
变性:温度95°C，时间45秒。
[0031 ] 退火:温度55 °C，时间30秒。
[0032]延伸:温度72 °C，时间30秒。
[0033]非对称PCR循环2:25个循环组成:
变性:温度95°C，时间45秒。
[0034]退火:温度65 °C，时间30秒。
[0035]延伸:温度72 °C，时间30秒。
[0036]最后延伸:温度72°C，时间10分钟。
[0037]然后进行膜芯片斑点杂交检测，膜条于42°C预杂交液(5XSSC，0.1% SDS’10XDenhardt’ S)中预杂交I小时，之后将膜条放于2ml杂交液(5XSSC，0.1% SDS,5 XDenhardt’s，50% 去离子甲酰胺，100ug/ml 酵母 tRNA)中 42°C，I 小时。取 40ul 多重 PCR产物加入Iul阳性寡核苷酸单链DNA(IOuM)，10(TC水浴变性5分钟后置于冰上，之后加入2ml 杂交液中，42°C杂交 16 小时。洗液 1(2XSSC，0.1% SDS)、洗液 2(0.5XSSC,0.1% SDS)42°C各洗膜条两次，每次10分钟。将膜条置于封闭液(3%BSA，100 mMTris-HCl, pH7.5，150mMNaCl)中37°C封闭30分钟，之后将膜条放到酶联液(用封闭液1:5000稀释链酶亲和素标记辣根过氧化物酶)中37°C，30分钟。用洗液3 (100 mM Tris-HCl, ρΗ7.5，150 mMNaCl)、洗液 4 (100 mM Tris-HCl，pH9.5，100 mMNaCl, 100 mMMgCl2)各漂洗膜条 3 次，每次 5 分钟，之后将膜条放入TMB显色液(IOOmM柠檬酸钠ρΗ5.4，0.lmg/ml四甲基联苯胺TMB，1:1600体积比的H202 (3%))中，避光显色10-15分钟，依照杂交点的显色情况判定结果。
[0038]本例中所用辅料和配液为外购或自配，百分比为重量百分比。
[0039]本例中提取的水稻基因组DNA为转基因水稻品系LLRICE62，检测结果如图1B所/Jn ο
[0040]实施例二
本例的水稻转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10XPCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺(TMB)显色液，其中，预杂交液为5XSSC,0.1% SDS和10XDenhardtJ s ;杂交液为5XSSC,0.1% SDS，5XDenhardt’ S，50%去离子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA ;洗液分别为洗液I:2 X SSC 和 0.1% 505，洗液2:0.5父55(:和0.1% 505，洗液3:100 mM Tris-HCl，ρΗ7.5，150mM NaCl，洗液 4:100 mM Tris-HCl，ρΗ9.5，100 mM NaCl 和 100 mM MgCl2 ;封闭液为 3% BSA,100 mM Tris-HCl，pH7.5，150 mM NaCl ;四甲基联苯胺显色液分别为四甲基联苯胺显色液A液:200mM柠檬酸钠pH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液:3% H2O2用800体积的双蒸水稀释液，使用前A液B液等量混合配成四甲基联苯胺显色液。
[0041]支持膜为硝酸纤维素膜。
[0042]提取的水稻基因组DNA为转基因水稻品系GM Shanyou 63，检测结果如图2B所示。
[0043]其余同实施例一。
[0044]实施例三
本例的水稻转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，其中，多重PCR扩增试剂一管600ul，每48ul试剂可检测一个DNA样本，每48ul扩增体系构成如下:10XPCR Buffer(Takara) 5ul，dNTP (2.5mM each) 5ul，6 对多重 PCR 引物(20 μ Μ) 0.5uleach, Tag primer(20 μ M) 3.5ul, EX-Taq Polymerase(Takara, 5U/ul) 0.5ul,ddH20加至48ul。每一样本检测需要吸取48ul扩增试剂，加入2ul待检测基因组DNA (约50ng/ul) ο
[0045]阳性寡核苷酸单链DNA (IOuM) —管15ul。
[0046]预杂交液(5XSSC，0.1% SDS，lOXDenhardt’s)—瓶 30ml。杂交液(5XSSC,0.1%SDS, 5 XDenhardt’ s, 50% 去离子甲酸胺，100ug/ml 酵母 tRNA) 一瓶 30ml。
[0047]洗液I (2X SSC, 0.1% SDS) 10 倍浓缩液一瓶 12ml，使用前加 108ml ddH20。洗液2 (0.5XSSC, 0.1% SDS) 10 倍浓缩液一瓶 12ml，使用前加 108ml ddH20。
[0048]封闭液/ 酶联液(3%BSA，100 mM Tris-HCl, ρΗ7.5，150 mMNaCl) 一瓶 60ml。链酶亲和素标记辣根过氧化物酶(lmg/ml) —管5ul，使用前用封闭液1:5000稀释成酶联液。
[0049]洗液3 (100 mM Tris-HCl, ρΗ7.5，150 mMNaCl) 10 倍浓缩液一瓶 18ml，使用前加162ml ddH20。洗液 4 (100 mM Tris-HCl, pH9.5,100 mMNaCl, 100 mM MgCl2) 10 倍浓缩液一瓶 18ml，使用前加 162ml ddH20。
[0050]TMB显色液A液(200mM柠檬酸钠pH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺TMB)—瓶15ml。TMB显色液B液(1:800体积比的H2O2 (3%)) 一瓶15ml。使用前A液B液等量混合配成TMB显色液。
[0051]提取的水稻基因组DNA为非转基因水稻野生品系Norin 8，检测结果如图3B所示。
[0052]其余同实施例二。
【权利要求】
1.一种水稻转基因检测试剂盒由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为6重双启动寡核苷酸引物组合，各对引物的碱基序列5’ -3’如下，其中碱基I为次黄嘌呤核苷酸: CrylAb:正向引物:ATTCAATTCAACGACATGAAI11IICCTTGAC 反向引物:TTGTAACGGCTATTGATGGTIIIIICATCGAA ； CrylAc:正向引物:TTCAGGACCAGGATTCACTGIIIIIGACCTCG 反向引物:AGGTGAATAGGGGTCACAGAIIIIIACCTCAC ； BAR:正向引物:GACGACCTCGTCCGTCTGCGI 111 IGCTATCC 反向引物:CAGCAGGTGGGTGTAGAGCGIIIIICCCAGTC ； CaMV35S:正向引物:GATAAAGGAAAGGCCATCGTIIIIIATGCCTC 反向引物:TGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGA ； NOS 3’:正向引物:TTAAGATTGAATCCTGTTGCIIIIITTGCGAT 反向引物:CGCGCGCGATAATTTATCCTIIIIIGCGCGCT ； gos9:正向引物:ACAGATATATAGGGCAGAAAIIIIIGCTACAA 反向引物:CGTCACGTTCTTCAGGCTATIIIIIGGTACAG ； 膜芯片为顺序固定在支 持膜表面的6组探针序列和一组阳性对照(Positive)探针序列，6组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’ -3’如下，各探针的5’端做氨基标志:CrylAb 探针:NH2_5’ -GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGG-3’ ；
CrylAc 探针:NH2_5’ -TAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCA
CATCTACCAGATATAGAGTTC-3’ ；
BAR 探针:NH2-5’ -cgcaacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgta
CGTCTCCCCCCGCCACCAGCG-3’ ；
CaMV35S 探针:NH2_5’ -AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCA
CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG-3’ ；
NOS 3’ 探针:NH2-5’ -atgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattata
CATTTAATACGCGATAGAAAA-3’ ；
gos9 探针:NH2-5’ -gcacaaagcttgttaagattggtccatggggtggaaat
GGAGGAGGTTCTGTAGACATA-3’ ； Positive 探针:NH2_5，-TAGCAAGGATGAGTATTCGAACAGTTAGAGGCAGT CAGGGAGAATCACTACGTACAAGC-3’。
2.根据权利要求1所述的水稻转基因检测试剂盒，其特征在于所述引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志的Tag引物，其碱基顺序如下所示:
Tag 引物:biotin-5，- GACGGACACCTACCCATATCACCCTTGACG -3，。
3.根据权利要求1所述的水稻转基因检测试剂盒，其特征在于所述水稻转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为脱氧核糖核苷三磷酸、EX-Taq聚合酶和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为 biotin-5’ - GCTTGTACGTAGTGATTCTCCCTGACTGCCTCTAACTGTTCGAATACTCATCCTTGCTA-3，。
4.根据权利要求1所述的水稻转基因检测试剂盒，其特征在于所述水稻转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为IOXPCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺显色液。
5.根据权利要求4所述的水稻转基因检测试剂盒，其特征在于所述预杂交液为5X SSC, 0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠和lOXDenhardt’s液；杂交液为5X SSC，0.1%重量百分比SDS，5XDenhardt’ S，50%重量百分比去离子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA ;洗液分别为洗液1:2XSSC和0.1%重量百分比SDS，洗液2:0.5XSSC和0.1%重量百分比SDS，洗液 3:100 mM Tris-HCl，ρΗ7.5，150 mM NaCl，洗液 4:100 mM Tris-HCl，ρΗ9.5，100 mMNaCl和100 mM MgCl2 ;封闭液为3%重量百分比牛血清白蛋白，100 mM Tris-HCl,pH7.5,150mM NaCl ;四甲基联苯胺显色液分别为四甲基联苯胺显色液A液:200mM柠檬酸钠，pH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液:3%重量百分比的H2O2用800体积的双蒸水稀释液，使用前A液B液等量混合配成四甲基联苯胺显色液。
6.根据权利要求1所述的水稻转基因检测试剂盒，其特征在于所述支持膜为硝酸纤维素膜或尼龙 膜。
【文档编号】C12Q1/68GK103757128SQ201410044478
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年2月5日 优先权日:2014年2月5日
【发明者】黄广平, 秦子苏, 王勇强 申请人:黄广平