一种β-淀粉酶的检测方法
【专利摘要】本发明涉及检测【技术领域】，公开了一种β-淀粉酶的检测方法，包括β-淀粉酶分子量的检测方法和β-淀粉酶活力的检测方法。本发明使用SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色的方法检测β-淀粉酶的分子量，从而确定β-淀粉酶的存在，该方法简单易操作。本发明使用硫代硫酸钠滴定代替传统的淀粉-碘滴定，根据使用的硫代硫酸钠的量计算一定时间内可溶性淀粉在β-淀粉酶催化作用下消耗的淀粉的量，以酶的催化速率来代表酶的活力单位。本发明的检测方法滴定终点容易判断，准确性和稳定性高。本发明又以碘化钾和碘酸钾在酸性条件下生成碘的方式来代替传统的直接使用碘溶液滴定的方式，避免了碘溶液易挥发造成的滴定终点判断失误的发生，进一步提高了检测结果的准确性，同时本发明检测β-淀粉酶活力的方法测定线性范围广，重复性好，适合工业和临床应用。
【专利说明】—种β-淀粉酶的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及检验测定【技术领域】，具体而言涉及β-淀粉酶的检测方法，更具体而言，本发明涉及β-淀粉酶分子量的检测方法和β-淀粉酶活力的检测方法。【背景技术】
[0002]淀粉酶是一种水解酶，是目前发酵工业上应用最广泛的一类酶。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等α-1，4-葡聚糖，水解α-1，4_糖苷键的酶，根据作用的方式可分为α-淀粉酶与β-淀粉酶。
[0003]α -淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山嵛菜)及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1，4_链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖外，还生成分支部分具有α-1，6_键的α-极限糊精。
[0004]β -淀粉酶与α -淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1，4_葡聚糖链。主要见于高等植物中(大麦、小麦、甘薯、大豆等)，但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于像直链淀粉，如可溶性淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1，6_键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。
[0005]SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法是常见的蛋白质分离方法。但是使用该方法来检测β -淀粉酶的分子量，还未见报道。
[0006]现在已有的检测β_淀粉酶活力的方法主要包括:黏度测定法、比浊法、糖化法、淀粉-碘比色法、酶速率法与染料释放法等。其中，黏度测定法和比浊法由于影响因素较多，缺乏特异性和灵敏度，己被淘汰。糖化法虽然可以直接测定酶活性，但是操作复杂。目前应用较为广泛的是碘量法、酶速率法和染料释放法。其中，淀粉-碘法因具有成本低、检测不需要昂贵仪器、试剂稳定、操作简便、结果可靠，所以应用范围最广。
[0007]淀粉-碘比色法测定β -淀粉酶的基本原理是:淀粉在β -淀粉酶的作用下生成部分糊精，淀粉与碘结合生成紫蓝色的络合物，而糊精与碘结合生成红棕色络合物，测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以红色糊精与碘反应的颜色作为终点指示(所给定的淀粉都已转化为糊精的时间)，用此方法的酶活力定义:60°C I小时内将Ig淀粉转化为糊精的酶量为一个酶活力单位:
[0008]酶活力单位=60/t*20*2%*Ν/0.5 = 48N/t (U/ml)
[0009]t为反应达到终点所需要的时间；
[0010]N为酶的稀释倍数
[0011]但是淀粉-碘比色法测定β -淀粉酶活力存在以下缺点:红棕色滴定终点的观察因人而异，滴定终点不明显，存在误差较大，并且在碘滴定的过程中，由于碘液易升华挥发造成成分减少影响显色反应，致使检测结果准确性降低。
【发明内容】
[0012]本发明的目的在于提供一种检测β -淀粉酶分子量的方法。
[0013]本发明的另一目的在于提供一种稳定性高，准确性高的检测β -淀粉酶活力的方法。
[0014]为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案:
[0015]检测β -淀粉酶分子量的方法，包括:
[0016]步骤1、标准蛋白溶液的制备取分子量测定用标准蛋白(分子量范围30~66kD)适量，加蛋白上样缓冲液[取水4.8ml，浓缩胶缓冲液1.2ml，甘油1.0ml, 10%十二烷基硫酸钠溶液2.0ml, 0.5% (W/V)溴酚蓝溶液0.5ml, β -巯基乙醇0.5ml，混匀]制成每I μ I中含10μ g蛋白的溶液。临用前置水浴中5分钟，冷却。
[0017]步骤2、待测样品溶液的制备取待测样品适量(按蛋白含量计算)，加所述蛋白上样缓冲液制成每? μ I中含?ο μ g蛋白的溶液，临用前置水浴中5分钟，冷却。
[0018]步骤3、电泳分离照SDS-PAGE实验方法，采用垂直板电泳，各孔加10 μ I的所述待测样品溶液或所述标准蛋白溶液，电泳分离蛋白。
[0019]步骤4、染色步骤3结束后，将电泳胶放到染色液中(含0.2% (W/V)考马斯亮蓝G-250,45% (W/V)的乙醇或甲醇和10% (W/V)乙酸)，加热煮沸染色2分钟。
[0020]步骤5、脱色步骤4结束后，将电泳胶放入脱色液中(含7.5%乙酸和5%甲醇)，加热煮沸脱色10分钟。
[0021]步骤6、计算分子量以标准蛋白分子量的对数为纵座标，以迁移率为横座标，进行线性回归，由标准曲线上求得待测样品的分子量。
[0022]检测β -淀粉酶活力的方法，包括:
[0023]步骤1、在ΡΗ5.5的缓冲液中，待测样品与可溶性淀粉混合得到混合液，反应适当时间后使用lmol/L盐酸终止反应。
[0024]步骤2、加入麦芽糖酶与上述混合液反应(足以使可溶性淀粉在β -淀粉酶作用下生成的麦芽糖完全分解成葡萄糖)，使用2.6mol/L碳酸钠终止反应。
[0025]步骤3、碘化钾与酸性碘酸钾混合加入到步骤2所得的混合液中。
[0026]步骤4、在步骤3所得的混合液中加入氢氧化钠暗处放置，再加入硫酸，用硫代硫酸钠滴定。
[0027]步骤5、设置空白对照(在步骤I中不加待测样品，只加入同体积的缓冲液)。每Iml碘滴定液(0.05mol/L)相当于9.008mg无水葡萄糖。按下式计算β _淀粉酶的活力。
[0028]每Ig 含淀粉酶活力单位=(B-A) F/10* (9.008*1000/180.16*(n/ff))
[0029]式中
[0030]A为供试品消耗硫代硫酸钠滴定液的容积，ml ；
[0031]B为空白消耗硫代硫酸钠滴定液的容积，ml ；
[0032]F为硫代硫酸钠滴定液的浓度换算值，mol/L ；
[0033]W为供试品取样量，g ；
[0034]η为供试品稀释倍数，200。
[0035]在上述条件下，每分钟水解160 μ g淀粉(相当于最终生成I μ mol葡萄糖)的酶量，为I个β -淀粉酶活力的单位。
[0036]待测样品处理:取本品0.3g，精密称定，置研钵中，加冷至5°C以下的磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾13.61g与磷酸氢二钠35.80g，加水使溶解成1000ml，调节pH值至5.5)少量，研磨均匀，加上述磷酸盐缓冲液定量稀释制成每Iml中含淀粉酶10-20单位的溶液。
[0037]优选地，碘酸钾与碘化钾的摩尔比是1:4-1:6。
[0038]优选地，酸性碘酸钾浓度为5-8mmol/L (pH2.0)。
[0039]本发明检测方法提供了一个适宜的酸性环境，待测样品与可溶性淀粉在pH5.5的缓冲液中混合。PH5.5的缓冲液包括:磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液和磷酸盐缓冲液。作为优选，本发明检测方法中PH5.5的缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。
[0040]优选地，可溶性淀粉为I %可溶性淀粉溶液。
[0041]1 %可溶性淀粉溶液处理:取经105°C干燥2小时的可溶性淀粉1.0g，加水10ml，搅匀后，边搅拌边添加lOmol/LNaOH溶液0.2ml，使之完全溶解，加入2mol/L盐酸使溶液的pH值为5.5，加水稀释至100ml。
[0042]本发明技术方案的优点和有益效果如下:(I)本发明首次将SDS-PAGE考马斯亮蓝染色的方法用于检测β_淀粉酶的分子量，该实验方案具有创新性；(2)本发明以硫代硫酸钠滴定代替传统的淀粉-碘滴定检测β -淀粉酶活力，克服了淀粉-碘滴定法滴定终点颜色判断困难的缺点，使实验结果更准确；(3)本发明以碘化钾和酸性碘化钾作为显色液，碘化钾和碘酸钾在酸性条件下生成碘，与未反应的可溶性淀粉结合的形成蓝色复合物，避免直接使用碘液易升华挥发造成成分减少变淡影响反应显色，进一步提高了检测结果的准确性；(4)本发明提供了一种使用NaOH室温溶解可溶性淀粉的方法。该方法比以加热煮沸的方式来实现可溶性淀粉溶解的方法更省时，更安全；(5)利用本发明检测β_淀粉酶活力的方法测定的β_淀粉酶活力值更接近使用HPLC测定的β_淀粉酶活力值，因此本发明的检测方法具有很高的准确性；(6)根据本发明的实施方案，本发明β_淀粉酶活力的检测方法可测定的线性范围广(高达1600U/g)，同时具有很好的重复性。使用硫代硫酸钠滴定法检测大麦芽中提取的β -淀粉酶活力还未见相关报道，因此本发明的检测方法具有创新性。
【具体实施方式】
[0043]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限实施例表示的范围。
[0044]实施例1SDS-PAGE检测β -淀粉酶的分子量
[0045]标准蛋白溶液的制备:取分子量测定用标准蛋白(分子量范围30kD~66kD)适量，加蛋白上样缓冲液[取水4.8ml，浓缩胶缓冲液1.2ml，甘油1.0ml, 10%十二烷基硫酸钠溶液2.0ml,0.5% (W/V)溴酚蓝溶液0.5ml, β -巯基乙醇0.5ml，混匀]制成每I μ I中含10 μ g蛋白的溶液。临用前置水浴中5分钟，冷却。
[0046]待测样品溶液的制备:取待测样品适量(按蛋白含量计算)，加所述蛋白上样缓冲液制成每? μ I中含?ο μ g蛋白的溶液，临用前置水浴中5分钟，冷却。
[0047]电泳分离:照SDS-PAGE实验方法，采用垂直板电泳，各孔加10 μ I的所述待测样品溶液或所述标准蛋白溶液，电泳分离蛋白。[0048]染色:将电泳胶放到染色液中(含0.2% (W/V)考马斯亮蓝G-250，45% (W/V)的乙醇或甲醇和10% (W/V)乙酸)，加热煮沸染色2分钟。
[0049]脱色:将染色后的电泳胶放入脱色液中(含7.5%乙酸和5%甲醇)，加热煮沸脱色10分钟。
[0050]计算分子量:以标准蛋白分子量的对数为纵座标，以迁移率为横座标，进行线性回归，由标准曲线上求得待测样品的分子量。
[0051]结果分析:待测样品经SDS-PAGE凝胶电泳，染色后可检测到高分子量的谱带一条(数据未显示)，与标准蛋白质相比较，得出β_淀粉酶的分子量(表1)。由表可以看出，蛋白条带的分子量是54.26kD，这与文献报道的β -淀粉酶的分子量约60kD的结果是一致的。
[0052]表1 β -淀粉酶的分子量测定结果
[0053]
【权利要求】
1.β-淀粉酶的检测方法，其特征在于，所述方法包括β-淀粉酶分子量的检测方法和β-淀粉酶活力的检测方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β_淀粉酶分子量的检测方法包括以下步骤: 步骤1、标准蛋白溶液的制备取分子量测定用标准蛋白，分子量范围30kD-66kD，适量，加蛋白上样缓冲液，所述上样缓冲液配制方法为:取水4.8ml，浓缩胶缓冲液1.2ml，甘油1.0ml, 10%十二烷基硫酸钠溶液2.0ml, 0.5% (W/V)溴酚蓝溶液0.5ml, β -巯基乙醇0.5ml，混匀制成每1μ I中含IOyg蛋白的溶液，临用前置水浴中5分钟，冷却； 步骤2、待测样品溶液的制备取待测样品适量，按蛋白含量计算，加所述蛋白上样缓冲液制成每? μ I中含?ο μ g蛋白的溶液，临用前置水浴中5分钟，冷却； 步骤3、电泳分离照SDS-PAGE实验方法，采用垂直板电泳，各孔加10 μ I的所述待测样品溶液或所述标准蛋白溶液，电泳分离蛋白； 步骤4、染色步骤3结束后，将电泳胶放到染色液中，所述染色液配方为:0.2% (W/V考马斯亮蓝G-250，45% (W/V)的乙醇或甲醇和10% (W/V)乙酸，然后加热煮沸染色2分钟；步骤5、脱 色步骤4结束后，将电泳胶放入脱色液中，所述脱色液配方为:7.5%乙酸和5%甲醇，然后加热煮沸脱色10分钟； 步骤6、计算分子量以标准蛋白分子量的对数为纵座标，以迁移率为横座标，进行线性回归，由标准曲线上求得待测样品的分子量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β_淀粉酶活力的检测方法包括以下步骤: 步骤1、在ρΗ5.5的缓冲液中，待测样品与可溶性淀粉混合得到混合液，反应适当时间后使用lmol/L盐酸终止反应并将混合液pH调到6.5 ； 步骤2、加入麦芽糖酶与上述混合液反应，其中，加入的麦芽糖酶足以使可溶性淀粉在β -淀粉酶作用下生成的麦芽糖完全分解成葡萄糖，然后使用2.6mol/L碳酸钠终止反应；步骤3、碘化钾与酸性碘酸钾混合加入到步骤2所述的混合液中； 步骤4、在步骤3所述的混合液中加入氢氧化钠暗处放置，再加入硫酸，用硫代硫酸钠滴定； 步骤5、设置空白对照:在步骤I中不加所述待测样品，只加入同体积的所述缓冲液，每Iml浓度为0.05mol/L的碘滴定液相当于9.008mg无水葡萄糖,按下式计算β -淀粉酶的活力: 每 Ig 含淀粉酶活力单位=(B-A) F/10* (9.008*1000/180.16*(n/ff)) 式中 A为供试品消耗硫代硫酸钠滴定液的容积，ml ； B为空白消耗硫代硫酸钠滴定液的容积，ml ； F为硫代硫酸钠滴定液的浓度换算值，mol/L ； W为供试品取样量，g ； η为供试品稀释倍数，200， 在上述条件下，每分钟水解160 μ g可溶性淀粉，相当于最终生成I μ mol葡萄糖的酶量，为I个β -淀粉酶活力的单位。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述pH5.5缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述待测样品处理如下:取酶制剂0.3g，精密称定，置研钵中，加冷至5°C以下的pH5.5的缓冲液中磷酸盐缓冲液少量，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为:取磷酸二氢钾13.61g与磷酸氢二钠35.80g，加水使溶解成1000ml，调节pH值至5.5，然后研磨均匀，加上述磷酸盐缓冲液定量稀释制成每Iml中含淀粉酶10-20单位的溶液。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述可溶性淀粉为I%的可溶性淀粉溶液，处理如下:取经105°C干燥2小时的可溶性淀粉1.0g，加水10ml，搅匀后，边搅拌边添加lOmol/L NaOH溶液0.2ml，使之完全溶解，加入2mol/L盐酸使溶液pH值为5.5，加水稀释至100ml。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述碘酸钾与所述碘化钾的摩尔比是1:4-1:6。
8.根据权利要求3所述的方法，所述酸性碘酸钾浓度为5mm0l/L-8mm0l/L，pH为2.0。
9.根据权利要求3所述的方法，所述麦芽糖酶加入量为150U-200U麦芽糖酶/g淀粉。
【文档编号】C12Q1/40GK103789400SQ201410070480
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】王发善, 韩振远, 褚弘斌, 陈玉忠 申请人:多多药业有限公司