提高水稻苗期耐冷性的基因Os09g0410300及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高水稻苗期耐冷性的基因Os09g0410300及其应用。水稻苗期耐冷性的基因Os09g0410300的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明首次证明了水稻基因Os09g0410300是水稻苗期耐冷功能基因。前人报道该基因是BR信号途径中的基因。该基因的克隆和生物学功能验证对于水稻苗期耐冷的分子机制研究，以及BR信号途径在水稻耐冷中发挥的作用的研究有重要的参考意义。
【专利说明】提高水稻苗期耐冷性的基因0s09g0410300及其应用
【技术领域】:
[0001]本发明属于基因领域，具体涉及一种提高水稻苗期耐冷性的基因0s09g0410300
及其应用。
【背景技术】:
[0002]水稻是重要的粮食作物，是我国第一大粮食作物。水稻起源于热带、亚热带，是喜温植物，因此对低温冷害非常敏感。水稻冷害是目前世界水稻栽培中一个严重而又普遍的问题，每年全世界因冷害减产的稻谷达30-50亿公斤。同时，水稻的耐冷性差严重影响了水稻在全球的种植面积，限制了水稻在高纬度地区和高海拔地区的种植。
[0003]在我国南方地区，水稻的冷害问题同样非常严重。在我国南方的双季稻产区，每年3-4月都有可能出现的低温阴雨天气，是我国南方地区早稻播种育秧期的主要灾害天气。苗期的低温会严重影响秧苗的生长，造成秧苗生长缓慢，甚至造成烂秧。根据广东省气候与农业气象中心的资料，广东春季低温阴雨平均每年出现1-3次，常造成早稻大面积烂秧死苗，不但损失大量种子，而且延误播种季节，使早稻成熟期延迟，影响晚稻播种，使晚稻在抽穗扬花期延迟而可能受到9-10月的寒露风影响。近年来随着全球气候变化，极端和异常天气出现的频率增加，对水稻冷害的防治显得更加重要。可见，水稻苗期的耐冷性问题是华南双季稻地区急待解决的问题。因此，研究解决水稻苗期耐冷性问题对促进水稻生产、确保我国的粮食安全有重大意义。
[0004]前通过资源筛选机遗传分析，已经定位了大量水稻苗期耐冷数量性状位点(QTL)，但只有少数几个被克隆。因此能应用于实际生产的基因非常少，目前尚未见这些QTL应用于分子育种改良水稻耐冷性的报道。另一方面，通过分子生物学及反向遗传学的方法，目前已经鉴定了大量水稻耐冷相关的基因及其分子机制。如水稻中的DREB(dehydration-responsive element binding)基因家族，能够通过结合下游基因启动子中的DRE顺式元件，激活下游耐冷相`关基因的表达，是水稻耐冷信号途径的上游信号基因。实验证明，在水稻中过表达OsDREBI可以明显提高水稻的耐冷性(Functional Analysisof Rice DREBl/CBF-type Transcription Factors Involved in Cold-responsive GeneExpression in Transgenic Rice)。过表达某些冷胁迫响应的转录因子，如0sNAC5等，也被证明能够通过提高下游冷响应信号途径的基因表达而提高水稻的耐冷性。其他通过转基因技术提供水稻耐冷性的基因包括糖代谢途径过程的酶(Overexpression of thetrehalose-6-phosphate synthase gene OsTPSlenhances abiotic stress tolerancein rice)，自由基清除的酶(Enhanced chilling tolerance at the booting stage inrice by transgenic overexpression of the ascorbate peroxidase gene，OsAPXa)，月旨肪酸合成途径的基因(A rice microsomal delta~12fatty acid desaturase canenhanceresistance to cold stress in yeast and Oryza sativa)等等。因此，通过转基因的技术能够快速的改良水稻的耐冷性。但是很多这些通过反向遗传学得到的耐冷功能基因，由于很多是信号途径上游的基因，因此转这些基因的转基因水稻很多都表现出不正常的生长表型或不好的农艺性状，因此不能应用于实际生产中。
[0005]油菜素类固醇(BR)是一种多功能的植物激素，在植物生长、发育以及胁迫响应中起重要作用。外源使用BR能够提高水稻对多种非生物胁迫的抗性，包括冷胁迫，干旱胁迫，盐胁迫等(Brassinosteroid signaling network:1mplications on yield and stresstolerance)。虽然目前包括拟南芥和水稻等植物的BR合成及信号传导途径已经比较清楚，但是对BR在植物胁迫响应中起作用的分子机理了解得还非常少。
【发明内容】
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[0006]本发明的第一个目的是提供一种水稻苗期耐冷性基因0s09g0410300。
[0007]本发明的水稻苗期耐冷性基因0s09g0410300，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.1 所示。
[0008]本发明的第二个目的是提供一种水稻苗期耐冷性蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]所述的编码水稻苗期耐冷性蛋白的基因的核苷酸序列优选如SEQ ID N0.1所示。
[0010]本发明通过试验证明，将本发明的基因0s09g0410300转入水稻中，获得的转基因株系相比于野生型植株，其耐冷性明显提高，由此说明，本发明的基因0s09g0410300是水稻苗期耐冷性功能基因。
[0011]因此，本发明的第三个目的是提供基因0s09g0410300在提高水稻苗期耐冷性中的应用。
[0012]本发明相比于现有技 术，其有益效果如下:
[0013]1.本发明首次证明了水稻基因0s09g0410300是水稻苗期耐冷功能基因。前人报道该基因是BR信号途径中的基因。该基因的克隆和生物学功能验证对于水稻苗期耐冷的分子机制研究，以及BR信号途径在水稻耐冷中发挥的作用的研究有重要的参考意义。
[0014]2.本发明提供了利用Camv35S启动子过表达基因0s09g0410300的水稻转化载体。该载体转化水稻后能大幅提高基因0s09g0410300的表达量，伴随着表达量的提高，转化植株的苗期耐冷性有明显的提高，并且转基因植株在生长状态及农艺性状上没有明显的改变。因此，本发明通过Camv35S启动子过表达基因0s09g0410300的技术可以应用于水稻的基因遗传工程育种，并能够应用于生产实践中，改良水稻的苗期耐冷性，从而保障目前极端气候现象频发的气候条件下的水稻生产安全。
【专利附图】
【附图说明】:
[0015]图1是pHQSN载体的载体图；
[0016]图2是基因0s09g0410300的表达水平图，其中CK为野生型植株，Tl、T2和T3为
转基因纯合株系；
[0017]图3是幼苗存活率图，其中CK为野生型植株，Tl、T2和T3为转基因纯合株系。【具体实施方式】:
[0018]以下实施例是对本发明进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0019]实施例1:[0020]1.基因0s09g0410300的克隆，过表达载体构建
[0021]取水稻品种日本晴的幼苗叶片部位，用TriZol Reagent (Invitrogen公司，其货号为:15596026)提取叶片总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取I P g的总RNA做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为PrimeScript (TAKARA公司)，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物为模板，采用引物(引物F:5’ aaaagtcgacATGTCAGTGGATGCACCTATGA，R:5’ aaaagaattcTTATCTTTGCAGAGGCTTGAC):进行PCR扩增，PCR所用的聚合酶为KOD FX (Toyobo公司)。反应体系为50uL，按照KOD FX的说明书配制PCR反应体系。反应条件为:94°C 5min ；94°C 30sec，60°C 30sec，68°C 90sec,35个循环；68°C IOmin0 PCR扩增获得约675bp的片段。
[0022]采用琼脂糖凝胶电泳回收该片段后，用Sal I和Ecor I对片段和pHQSN载体(载体图如图1所示)(载体PHQSN是由表达载体pCAMBIA1390改造而来的，该载体由华南师范大学李洪清教授改造而来，载体PHQSN的文章详细出处:Improvement ofTorenia fournieri salinity tolerance by expression ofArabidopsis AtNHX5.Le-YiShi，Hong-Qing Li,Xiao-Ping Pan,Guo-Jiang Wu and Me1-RuL1.Functional PlantBiology, 2008-CSIR0.，公众可以参考该文献构建载体pHQSN，其载体图如图1所示。载体pHQSN的信息还可以参考专利《ATPase蛋白在植物耐逆性中的应用》，CN102952816A)分别进行双酶切，酶切后分别回收目标片段和载体片段，用T4连接酶(NEB公司)16°C连接16小时，连接体系为:T4连接酶luL，10XbufferluL，回收的PCR片段6ul (200ng)，pHQSN载体2uL(50ng)。取IuL连接产物，用电击法转化到大肠杆菌DH5a中，转化产物涂布卡那霉素抗性的LB固体培养基。37°C培养过夜，挑10个单克隆进行提取质粒，酶切鉴定。选择两个阳性克隆进行测序检测。测序结果表明，所插入的PCR产物的序列如SEQ ID N0.1所示，其含有675bp的碱基，该序列命名为基因0s09g0410300。其编码蛋白具有224个氨基酸残基，其序列如SEQ ID N0 .2所示。由此得到含有基因0s09g0410300的pHQSN载体。
[0023]2.米用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将过表达载体-含有基因0s09g0410300的pHQSN载体转入正常粳稻品种中花-11中。转化原代(TO代)通过PCR及定量PCR检测，从DNA水平和RNA水平鉴定阳性转化植株。阳性植株自交得到转基因I代(Tl代)株系，每个株系选择10株经PCR检测为阳性的植株繁种，得到T2代植株，T2代株系再进行PCR检测，找到来源于不同TO代植株的T2代纯合株系3个。
[0024]对3个转基因纯合株系的幼苗叶片进行荧光定量PCR，检测目标基因0s09g0410300的表达量，以野生型结果为对照。
[0025]荧光定量PCR鉴定基因0s09g0410300在转基因植株中过表达效果程序如下:
[0026]取PCR检测阳性的转基因植株三叶期幼苗叶片进行总RNA提取，采用的试剂为TriZol R eagent (Invitrogen公司，其货号为:15596026),根据该试剂的说明书的步骤进行，并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取I μ g的总RNA做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为PrimeScript (Takara公司)，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物为模板，利用定量PCR技术，采用引物064203F和064203R (064203F:5’ CTAGAAGTAGTCTCCACAAGCT,064203R:5’ ATCTACTGGCGTACCCACA)对检测基因0s09g0410300的表达情况，采用水稻持家基因EFla基因的EFlaF和EFlaR引物(EFla F5’ TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT ；EFla R5’ GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA)对检测水稻EFla基因的表达作为内参，定量PCR试剂为SYBRk Premix Ex Ta a TM (TAKARA.)，定量PCR仪器为CFX96 (BioRAD公司)表达水平如图2所示。
[0027]结果证明3个转基因纯合株系相对于野生型，基因0s09g0410300的表达量都大幅度提高30-100倍。
[0028]3.基因0s09g0410300过表达转基因纯合株系植株苗期耐冷性鉴定
[0029]把上述纯合的3个过表达转基因T2代株系(转基因0s09g0410300纯合株系)和野生型种子在中37°C萌发，7天后将幼苗分别移至装有泥土的塑料盘中播种，每个株系及野生型分别播种30粒，一个塑料盘包含3个转基因株系和野生型株系，3个生物学重复。生长条件为:12小时光照，12小时黑暗，光照强度为15000LUX，光照时温度28°C，黑暗时温度24°C，湿度70%。种子在塑料盘中生长到3叶期，转移到人工气候箱(Conviixm)中进行耐冷鉴定。耐冷鉴定条件为12小时光照，12小时黑暗，光照强度为15000LUX，光照时温度5°C，黑暗时温度5°C，湿度70%。冷处理6天后取出，转移到正常生长条件下恢复生长，生长条件为:12小时光照，12小时黑暗，光照强度为15000LUX，光照时温度28°C，黑暗时温度24°C，湿度70%。幼苗在正常生长条件下生长7天后以存活幼苗数量除以总幼苗数量计算幼苗存活率。结果如图3所示:
[0030]由图3可以看出，野生型幼苗冷处理后全部死亡，3个转基因株系幼苗有30-50%存活率，证明基因0s09g0410300过表达的转基因植株苗期耐冷性明显高于野生型。由此说明基因0s09g0410300能 提高水稻苗期耐冷性。
【权利要求】
1.一种水稻苗期耐冷性基因0s09g0410300，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种水稻苗期耐冷性蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.根据权利要求2所述的水稻苗期耐冷性蛋白，其特征在于，所述的编码水稻苗期耐冷性蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
4.权利要求1所述的水稻苗期耐冷性基因0s09g0410300在提高水稻苗期耐冷性中的应用。`
【文档编号】C12N15/29GK103820468SQ201410070190
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】赵均良, 刘斌, 张少红, 杨梯丰 申请人:广东省农业科学院水稻研究所