一种提高生物指示剂菌片指示菌回收率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高生物指示剂菌片指示菌回收率的方法。本发明所提供的方法，包括如下步骤：1）将生物指示剂菌片置于装有洗脱液的离心管中，并加入不锈钢珠，用组织破碎仪进行破碎处理，得到破碎后样品；2）将所述破碎后样品进行涡旋震荡，振荡后用所述洗脱液进行稀释，得到稀释后样品；3）将所述稀释后样品用100-400目细胞筛过滤，除去菌片碎屑，所得滤液为从所述生物指示剂菌片中获得的指示菌的菌悬液。实验证明，本发明方法指示菌回收率高达83.2%，且平板间和稀释度间的误差率均小于10%，结果稳定、重复性好，完全符合《消毒技术规范》的相关要求；且该方法简便、可靠、易行。本发明为正确评价和判断消毒灭菌效果提供了可靠且实用的解决方案。
【专利说明】一种提高生物指示剂菌片指示菌回收率的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物领域，涉及一种提高生物指示剂菌片指示菌回收率的方法。
【背景技术】
[0002]目前国内外公认，消毒灭菌有效性的验证方法应能证明残留的污染微生物的概率和可能性应低于 ICT6 [United States Environmental Protection Agency.Assessment of Liquid and Physical Decontamination Methods for EnvironmentalSurfaces Contaminated with Bacterial Spores Development and Evaluation of theDecontamination Procedural Steps [S].EPAj 2012.]，利用生物指不剂验证消毒灭菌效果是国际公认的方法。
[0003]生物指示剂(bio-1ndicator, BI)是将适当载体染以一定量的特定微生物,用于指示消毒或灭菌效果的制品。我国卫生部2002年颁布的《消毒技术规范》规定，在进行消毒灭菌效果验证或生物指示剂自身评价时，生物指示剂菌片的载菌量应为IX IO6~5 X IO6Cfu/片，回收菌数应在5X105~5X IO6Cfu/片，即要求BI菌片指示菌的回收率在50%~100%[卫生部卫生法治与监督司.消毒技术规范[S].中华人民共和国卫生部，2002.]。但是，采用该规范推荐的震荡洗脱方法，在实际工作中对生物指示剂菌片上指示菌的洗脱效果较差，回收率远达不到50%~100%。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种提高生物指示剂菌片指示菌回收率的方法。
[0005]本发明所提供的提闻生物指不剂菌片指不菌回收率的方法(或者为:从生物指不剂菌片中回收指示菌的方法)，具体可包括如下步骤:
[0006](I)将生物指示剂菌片置于装有洗脱液的离心管中，并加入不锈钢珠，用组织破碎仪进行破碎处理，得到破碎后样品；
[0007](2)将所述破碎后样品进行涡旋震荡，振荡后用所述洗脱液进行稀释，得到稀释后样品；
[0008](3)将所述稀释后样品用100-400目(如200目)细胞筛过滤，除去菌片碎屑，所得滤液为从所述生物指示剂菌片中获得的指示菌的菌悬液。
[0009]在步骤(1)中，所述进行破碎处理可为于10-30HZ (如30Hz)下震荡2_5min (如5min)。
[0010]在步骤(1)中，所述生物指示剂菌片与所述洗脱液的配比可为I片:(1-1.5ml)，如
I片:1ml。
[0011]在步骤(1)中，所述不锈钢珠的直径为所述离心管管口直径的25%-58% (如41.7%) ο
[0012]在步骤(1)中，向所述离心管中加入的所述不锈钢珠的个数为I个。
[0013]在本发明中，步骤(1)中所述的组织破碎仪具体为德国QIAGEN公司生产的Tissuelyser II型组织破碎仪。
[0014]在本发明中，步骤(1)中所述的离心管为2ml PE圆底离心管，其管口直径为12mm，管长为40mm ;对应采用的所述不锈钢珠的直径为3-7mm (如5mm)。
[0015]在步骤(1)中，在所述“将生物指示剂菌片置于装有洗脱液的离心管中，并加入不锈钢珠”后还包括将所述离心管加盖后用封口膜将封闭管口的步骤。
[0016]在步骤(2)中，所述进行涡旋震荡可为于1000-2500rpm (如25rpm)涡旋震荡l_3min (如 2min)。
[0017]在步骤(2)中，振荡后用所述洗脱液进行稀释，为用所述洗脱液进行5-20倍(如10倍)稀释。
[0018]进一步，所述洗脱液的溶剂为0.03mol/L磷酸盐缓冲液，溶质及浓度如下:硫代硫酸钠10g/L、吐温-801.0g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠8.5g/L。
[0019]其中，所述0.03mol/L磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下:无水磷酸氢二钠 2.83g/L ;磷酸二氢钾 1.36g/L，ρΗ7.2-7.4。
[0020]在本发明中，步骤(2)中所述进行涡旋振荡时采用的震荡器为德国IKA公司生产的Vortex GENIUS3型涡旋震荡器。
[0021 ] 在上述方法中，所述生物指示剂菌片的载菌介质为滤纸。
[0022]更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述生物指示剂菌片为美国SGM BiotechInc.公司生产的二氧化氯气体灭菌专用生物指示剂，其产品目录号为SGMG/6 ;或北京四环卫生药械厂有限公司生产的四环牌生物指示剂。以上两生物指示剂菌片的指示菌均为枯草芽孢杆菌黑色变种(ATCC9372)`。
[0023]组织破碎仪在提高生物指示剂菌片指示菌回收率中的应用也属于本发明的保护范围。
[0024]在本发明中，所述组织破碎仪具体为德国QIAGEN公司生产的Tissuelyser II型组织破碎仪。
[0025]在上述方法中，所述生物指示剂菌片的载菌介质为滤纸。
[0026]更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述生物指示剂菌片为美国SGM BiotechInc.公司生产的二氧化氯气体灭菌专用生物指示剂，其产品目录号为SGMG/6 ;或北京四环卫生药械厂有限公司生产的四环牌生物指示剂。以上两生物指示剂菌片的指示菌均为枯草芽孢杆菌黑色变种(ATCC9372)。
[0027]实验证明，本发明采用QIAGEN组织破碎仪，利用不锈钢珠在离心管中的高速震荡使生物指示剂菌片完全破碎，结果获得高达83.2%的指示菌回收率，远高于传统震荡法指示菌的平均< 1.0%的回收率，且本发明方法平板间和稀释度间的误差率均小于10%，结果稳定、重复性好，完全符合《消毒技术规范》的相关要求。这说明本发明所建立的菌片破碎法简便、可靠、易行。由于采取了破碎菌片的新思路，可以适用于所有以滤纸为载体的生物指示剂菌片，为正确评价和判断消毒灭菌效果提供了可靠且实用的解决方案，对于不断提高和完善我国的消毒技术规范具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为采用本发明菌片破碎法(实验组)指示菌的回收率。其中，SGM-U SGM-2和SGM-3为3个以进口 SGM生物指示剂菌片为供试生物指示剂菌片的平行样本。
[0029]图2为活菌培养计数操作计算误差率。其中，SGM-U SGM-2和SGM-3为3个以进口 SGM生物指示剂菌片为供试生物指示剂菌片的平行样本。
[0030]图3为3种方法对指示菌回收率的影响。其中，CSV代表菌片破碎法(实验组)；SV代表浸泡加涡旋震荡法(对照组I) ;v代表仅涡旋震荡法(对照组2)。
【具体实施方式】
[0031 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]组织破碎仪:德国QIAGEN公司生产的Tissuelyser II型组织破碎仪。
[0034]涡旋震荡器:德国IKA公司生产的Vortex GENIUS3型涡旋震荡器。
[0035]洗脱液:溶剂为0.03mol/L磷酸盐缓冲液，溶质及浓度如下:硫代硫酸钠10g/L、吐温-801.0g/L、蛋白胨 10g/L、氯化钠 8.5g/L。
[0036]其中，所述0.03mol/L磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下:无水磷酸氢二钠 2.83g/L ;磷酸二氢钾 1.36g/L，ρΗ7.2-7.4。
[0037]胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA):溶剂为水，溶质及浓度如下:胰蛋白胨
1.5%(1.5g/100ml)、大豆蛋白胨 0.5%(0.5g/100ml)、氯化钠 0.5%(0.5g/100ml)、琼脂
1.6%(1.6g/100ml)，ρΗ7.2±0.2。
[0038]实施例1、本发明菌片破碎法提高生物指示剂菌片指示菌回收率
[0039]一、实验材料与方法
[0040]供试生物指示剂菌片:美国SGM Biotech Inc.公司生产的二氧化氯气体灭菌专用生物指示剂(产品目录号为SGMG/6)，指示菌为枯草芽孢杆菌黑色变种(ATCC9372)，载菌量为1.6 X IO6Cfu/片。生物指示剂均在有效期内。
[0041]1、本发明菌片破碎法(实验组)
[0042]( I)破碎处理
[0043]取3片(即3个平行样本)供试生物指示剂菌片，将每片分别置于含有Iml洗脱液的2ml PE圆底离心管(管口直径为12mm，管长为40mm)中，同时放入I颗灭菌的不锈钢珠(直径为5mm)，加盖后用封口膜封闭管口。将离心管装在组织破碎仪上，于30Hz下震荡5min，然后在涡旋振荡器上于2500rpm下涡旋震荡2min。
[0044](2)稀释、过滤及检测
[0045]将涡旋震荡后离心管内菌片破碎混悬液移至50ml离心管中，用洗脱液作10倍稀释；然后用200目细胞筛过滤除去菌片碎屑。将经过滤的菌悬液用洗脱液作梯度稀释(稀释度分别为:1.7X 10_3、3.3X 10_3、6.6X 10_3)，每样品分别取3个稀释度的菌悬液涂板(250 μ I/板，TSA固体培养基)，每样品每稀释度做6个重复。置37°C培养箱中培养12-18h后进行菌落计数并计算指示菌的回收菌数、回收率和误差率(平板间误差率和稀释度间误差率)。
[0046]其中，
[0047]
【权利要求】
1.一种提高生物指示剂菌片指示菌回收率的方法，包括如下步骤: (1)将生物指示剂菌片置于装有洗脱液的离心管中，并加入不锈钢珠，用组织破碎仪进行破碎处理，得到破碎后样品； (2)将所述破碎后样品进行涡旋震荡，振荡后用所述洗脱液进行稀释，得到稀释后样品; (3)将所述稀释后样品用100-400目细胞筛过滤，除去菌片碎屑，所得滤液为从所述生物指不剂菌片中获得的指不菌的菌悬液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，所述进行破碎处理为于10-30Hz 下震荡 2-5min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，所述生物指示剂菌片与所述洗脱液的配比为I片:(1-1.5ml)。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，所述不锈钢珠的直径为所述离心管管口直径的25%-58%。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述进行涡旋震荡为于 1000-2500rpm 涡旋震荡 l_3min。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，振荡后用所述洗脱液进行稀释，为用所述洗脱液进行5-20倍稀释。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:所述洗脱液的溶剂为0.03mol/L磷酸盐缓冲液,溶质及浓度如下:硫代硫酸钠10g/L、吐温-801.0g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠 8.5g/L。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述生物指示剂菌片的载菌介质为滤纸。
9.组织破碎仪在提高生物指示剂菌片指示菌回收率中的应用。
10.根据权利要求9所述 的应用，其特征在于:所述生物指示剂菌片的载菌介质为滤纸。
【文档编号】C12N1/20GK103865848SQ201410080507
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】朱以萍, 张瑞丰, 谢清, 黄力勤, 陆兵, 吕京 申请人:中国科学院微生物研究所