检测恩拉霉素产生菌效价的方法
【专利摘要】本发明提供一种检测恩拉霉素产生菌效价的方法，其是以保藏编号为CGMCC?No.63501的枯草芽孢杆菌作为指示菌，向枯草芽孢杆菌的菌悬液中加入待测恩拉霉素产生菌发酵醪液经均质后的上清液，置于37℃培养12h后，根据OD660nm值确定待测恩拉霉素产生菌的效价。本方法可用于高产恩拉霉素菌株的筛选，具有操作简单，指示明确等优点。
【专利说明】检测恩拉霉素产生菌效价的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物学领域，具体地说，涉及一种检测恩拉霉素产生菌效价的方法。【背景技术】
[0002]恩拉霉素，又名恩来霉素、恩霉素、安来霉素、持久霉素，是由土壤放线菌(Streptomyces fungicidious ATCC21013)发酵产生的一种多肽类抗生素。恩拉霉素对梭状芽抱杆菌、链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌等革兰氏阳性菌具有强力的抗菌活性和优良的促生长及改善饲料利用率的作用，常作为禽、猪、鱼的抗生素促生长剂。恩拉霉素具有很高的稳定性，在制成颗粒料过程及与饲料混合后在室温下长期储藏效价下降甚微。恩拉霉素在肠道内不被降解，能够保持原有的抗菌活性。未吸收的抗生素主要随粪便排出体外，故口服恩拉霉素药物残留很少。恩拉霉素为肽类抗生素，其排放到环境中，容易被环境微生物所降解，从而对环境的污染程度小。实践证明，恩拉霉素是一种优良的兽用抗生素，具有用量低、低残留，不易产生抗药性及环境友好等特点。恩拉霉素为十七个氨基酸缩合的环肽，依据其连接的脂肪酸侧链的长度不同可分为A、B两个不同组分。对菌种的研究表明，恩拉霉素生物合成基因簇包括四个非核糖体肽合酶(NRPS)基因及其它相关基因。
[0003]目前恩拉霉素菌种筛选主要采用平板分离-摇瓶发酵-液相测效价的流程进行筛选。在平板分离时，主要以菌落相对较大(约直径为2-5mm)，菌落边缘圆，正面孢子呈灰色，扎根较深的菌落为筛选标准，以目测为标准。而进行摇瓶发酵测效价时存在的主要矛盾为液相检测时间较长，预处理较复杂，同时由于发酵醪液成分容易堵塞高效液相色谱柱，检测恩拉霉素的高效液相色谱柱寿命较短。为解决检测限制的矛盾，恩拉霉素菌种在筛选过程中，一批分离一般只选取5个菌落。
[0004]在恩拉霉素的企标及国家标准中，恩拉霉素的生物效价为其销售标准:以枯草芽孢杆菌为指示菌，检测抑菌圈的大小，经过计算为其产品效价。因此利用检测生物效价的方法用于恩拉霉素菌种的筛选，一方面可以扩大菌种筛选范围，另一方面可以有效降低检测成本。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种检测恩拉霉素产生菌效价的方法。
[0006]为了实现本发明目的，本发明的一种检测恩拉霉素产生菌效价的方法，其是以保藏编号为CGMCC N0.63501的枯草芽孢杆菌作为指示菌，向枯草芽孢杆菌的菌悬液中加入待测恩拉霉素产生菌发酵醪液经均质后的上清液，置于37°C培养12h后，根据OD66tol值确定待测恩拉霉素产生菌的效价。
[0007]其中，所述枯草芽孢杆菌的菌悬液的制备方法为:取枯草芽孢杆菌(CGMCCN0.63501)的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的试管中，于35~37°C培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用5mL灭菌水将芽孢洗下，在65°C加热30min。待菌液降至室温后，于4°C冰箱保藏备用。[0008]营养琼脂斜面培养基的配方为:蛋白胨10g/L、牛肉膏粉3g/L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L,蒸馏水 1000mL, pH 值 7.2 ~7.4。
[0009]所得菌悬液的CFU值为4.5 X 108~6.7 X 108个/mL。
[0010]恩拉霉素产生菌发酵醪液的制备方法为:向恩拉霉素发酵培养基100mL中接入一环恩拉霉素产生菌孢子，以400r/min，28°C进行发酵培养；培养7天后得发酵醪液。
[0011]所述恩拉霉素发酵培养基的配方为:葡萄糖4%，玉米淀粉1.5%，玉米蛋白粉2.8%，棉籽饼粉1.5%，尿素0.2%，磷酸二氢钾0.02%,氯化钠0.5%，碳酸钙0.5%，以水配制，pH值6.5~7.00
[0012]恩拉霉素产生菌发酵醪液经高压均质后，所得均质液经5000转/分钟离心30min后得上清液。
[0013]所述枯草芽孢杆菌的菌悬液与待测恩拉霉素产生菌发酵醪液经均质后的上清液按1:1的体积比混合。
[0014]本发明中涉及的恩拉霉素产生菌包括但不限于土壤放线菌等。
[0015]具体地，本发明的主要技术路线如下:
[0016](1)将培养成熟的恩拉霉素生产菌孢子进行梯度稀释，取稀释液涂分离平板，选取菌落相对较大(约直径为2-5mm)，菌落边缘圆，正面孢子呈灰色，扎根较深的菌落进入试管进行传代培养；
[0017](2)配制恩拉霉素发酵摇瓶，接入一环孢子，在摇床上进行发酵培养。培养结束后取发酵醪液进行高压均质，均质液离心取上清液低温(4°C)保藏；
[0018](3)配制枯草芽孢杆菌液体培养基，每个摇管中接入5毫升，高温灭菌。在每个摇管中接入100微升芽孢杆菌菌悬液及100微升恩拉霉素均质后上清液；
[0019](4)摇管培养后测定OD值，取OD值低的菌号的试管进行复筛。
[0020]本发明提供的一种检测恩拉霉素产生菌效价的方法，可用于高产恩拉霉素菌株的筛选。采用本方法进行恩拉霉素菌株的筛选，操作简单，指示明确。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0022]实施例1指示菌的培养
[0023]取枯草芽孢杆菌(CGMCC N0.63501)的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的试管中，在35~37°C培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65°C加热30min。菌液降至室温后，置4°C冰箱保藏备用。
[0024]营养琼脂斜面培养基的配方为:蛋白胨10g/L、牛肉膏粉3g/L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L,蒸馏水 1000mL, pH 值 7.2 ~7.4。
[0025]所得菌悬液的CFU值为4.5 X 108~6.7 X 108个/mL。
[0026]实施例2恩拉霉素生产菌发酵醪液上清液的制备
[0027]将培养成熟的恩拉霉素生产菌孢子接入带玻璃珠摇瓶中，震荡打散。将孢子悬液按无菌操作进行梯度稀释，取稀释液涂分离平板，控制每平板长成的菌落数在10-20个之间。选取菌落相对较大(约直径为2-5mm)，菌落边缘圆，正面孢子呈灰色，扎根较深的菌落进入试管进行斜面传代培养。
[0028]配制恩拉霉素发酵摇瓶IOOmL,接入一环孢子，在摇床上以400r/min，28°C进行发酵培养7天。培养结束后，取发酵醪液进行高压均质。高压均质的条件为pH值6.5~7.5，压力850~900bar，温度50°C。均质液经5000转/分钟离心30min后取上清液置4°C冰箱保减备用。
[0029]其中，恩拉霉素发酵培养基的配方为:葡萄糖4%，玉米淀粉1.5%，玉米蛋白粉
2.8%，棉籽饼粉1.5%，尿素0.2%，磷酸二氢钾0.02%,氯化钠0.5%，碳酸钙0.5%，以水配制，pH 值 6.5-7.0。
[0030]实施例3恩拉霉素产生菌效价的检测
[0031]配制枯草芽孢杆菌液体培养基，每个摇管中接入5毫升液体培养基，121°C高温灭菌。冷置室温后在无菌条件下在每个摇管中接入100微升实施例1中制备的芽孢杆菌菌悬液及实施例2中制备的100微升恩拉霉素均质后上清液。摇管37培养后12小时后，于660nm测定摇管的OD值，取OD值低的菌号的试管进行复筛。结果如表1所示。
[0032]表1摇管培养后的OD值与液相色谱测定的效价
[0033]
【权利要求】
1.一种检测恩拉霉素产生菌效价的方法，其特征在于，以保藏编号为CGMCC N0.63501的枯草芽孢杆菌作为指示菌，向枯草芽孢杆菌的菌悬液中加入待测恩拉霉素产生菌发酵醪液经均质后的上清液，置于37°C培养12h后，根据OD66tol值确定待测恩拉霉素产生菌的效价。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的菌悬液，其CFU值为4.5 X IO8 ~6.7 X IO8 个/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，恩拉霉素产生菌发酵醪液的制备方法为:向恩拉霉素发酵培养基IOOmL中接入一环恩拉霉素产生菌孢子，以400r/min，28°C进行发酵培养；培养7天后得发酵醪液； 所述恩拉霉素发酵培养基的配方为:葡萄糖4%，玉米淀粉1.5%，玉米蛋白粉2.8%，棉籽饼粉1.5%，尿素0.2%，磷酸二氢钾0.02%,氯化钠0.5%，碳酸钙0.5%，以水配制，pH值6.5~7.00
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，恩拉霉素产生菌发酵醪液经高压均质后，所得均质液经5000转/分钟离心30min后得上清液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的菌悬液与待测恩拉霉素产生菌发酵醪液经均质后的上清液按1:1的体积比混合。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恩拉霉素产生菌包括但不限于土壤放线菌。`
【文档编号】C12Q1/02GK103882090SQ201410105471
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】李荣杰, 杨为华, 邓远德, 徐斌, 穆晓玲 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司