多肽的制作方法

多肽的制作方法【专利摘要】我们描述了一种可源自具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的亲本多肽的PS4变体多肽,其中所述PS4变体多肽参照如SEQIDNO:1所示嗜糖假单胞菌外切型淀粉酶序列的位置编号在选自：121,161,223,146,157,158,198,229,303,306,309,316,353,26,70,145,188,272,339的一个或多个位置上包含氨基酸突变。【专利说明】多化[0001]本申请是申请号为200580029996.8,申请日为2005年7月7日，发明名称为"多肤"的中国专利申请的分案申请。[0002]参考2003年7月7日提交的美国临时申请系列号60/485,413,60/485,539和60/485,616。还参考2004年7月7日提交并指定美国的国际申请PCT/US2004/021723和PCT/US2004/021739(申请人:=GenencorInternational,Inc)。还参考全都在2004年7月7日提交的美国实用新型申请系列号10/886,905和10/866,903。[0003]还参考US临时申请系列号60/608,919(2004年7月7日提交为美国实用新型申请系列号10/887,056,但在2004年9月15日转为临时申请）。还参考2004年9月22日提交的美国临时申请系列号60/612,407。[0004]另外参考2003年7月7日提交的美国申请系列号60/485,539。还参考2004年7月7日提交并指定美国的国际申请PCT/IB2004/002487(申请人:=DaniscoA/S)。还参考2004年7月7日提交的美国实用新型申请系列号10/886,023。[0005]还参考全部都在2004年7月7日提交的美国实用新型申请系列号10/886,505,10/886,527和10/886,504。还参考2004年9月22日提交的美国实用新型申请系列号10/947,612。[0006]特此将在前申请、在本申请和在前申请每一篇中引用或参考的每篇文件，包括在每个在前申请的审批过程期间（"申请和论文引用的文件"），W及在每一个在前申请和论文中和在任何申请和论文引用的文件中所引用或提及的任何生产商的说明书或产品目录并入本文作为参考。另外，特此将在本文中引用的所有文件，W及在本文中引用的文件中所有引用的文件或参考文献，W及在本文或在特此并入本文的任何文件中引用或提及的任何生产商的说明书或产品目录并入本文作为参考。可W将并入本文作为参考的文件或其中的任何教导用于本发明的实践中。通过参考并入本文的文件并被承认为现有技术。【
技术领域：
】[0007]本发明涉及多肤，特别是淀粉酶多肤和编码该些的核酸，W及它们作为非产麦芽糖外切型淀粉酶在生产食品产品中的用途。已经对本发明的淀粉酶进行了工程化设计W便具有更有益的品质。具体地，本发明的淀粉酶显示改变的外切特异性和/或改变的热稳定性。特别地，所述多肤源自具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性，特别地，葡聚糖l，4-a-麦芽糖四水解酶（glucanl,4-al地a-maltotetr址y化olase)巧C3.2.1.60)活性的多肤。【
背景技术：
】[0008]改进的淀粉酶可W改善在某些加工过程，如烘赔中固有的问题。烘赔后数天在淀粉颗粒中发生支链淀粉的结晶，其导致面包硬度提高并导致面包陈化（staling)。当面包陈化时，面包丧失面包也（crumb)软度和面包也水分。结果，面包也弹性变小，并且面包形成皮革似的面包皮（crust)。[0009]支链淀粉侧链的酶水解（例如，通过淀粉酶）可W减少结晶并提高抗陈化性。结晶依赖于支链淀粉侧链的长度：侧链越长，结晶越严重。大多数淀粉颗粒由两种聚合物的混合物组成：支链淀粉和直链淀粉，其中大约75%是支链淀粉。支链淀粉是极大的，分枝的分子，其由通过（1-4)连接连接的a-D-化喃葡糖巧基单位组成，其中通过a-D-(I-S)连接附着W形成分枝。直链淀粉是具有少数a-D-(l-6)分枝的（1-4)连接的a-D-化喃葡糖巧基单位的线性链。[0010]含淀粉的面包产品如白面包、由筛制的（bolted)黑麦粉和小麦粉（wheatflower)制得的面包和面包卷的烘赔通过在从18(TC到25(TC范围的烤箱温度烘赔面包生面团持续大约15到60分钟来实现。在烘赔过程中在外部生面团层上迅速升高（steep)的温度梯度(200-12(TC)占上风，在那里形成烘赔过的产品的面包皮。不过，由于蒸气，在烘赔过程结束时面包也中的温度只有大约l〇(TC。在大约85C的温度W上，可W发生酶失活并且酶将没有抗陈化的特性。因而，只有热稳定淀粉酶能够在烘赔过程中有效地改变淀粉。[0011]通过产生粘性的面包也，所述粘性的面包也由于分枝糊精聚集而带来，内淀粉酶活性可W负面影响最后面包产品的质量。优选外切型淀粉酶活性，因为它实现所需的淀粉修饰，所需的淀粉修饰导致陈化延迟，并伴随较少的与内淀粉酶活性相关联的负效应。内淀粉酶活性的减弱能够导致更大的外切特异性，所述外切特异性能够减少分枝的糊精并产生更高质量的面包。【
发明内容】[0012]根据本发明，我们提供如权利要求中所述的PS4变体多肤。我们进一步提供该种PS4变体多肤的用途，包括如权利要求中所述在食品添加剂、食品产品、面包产品、改良剂组合物、饲料产品包括动物饲料等中和作为该些的用途。我们提供在权利要求中所述的编码和涉及PS4变体多肤的核酸。在权利要求中还列出了生产该些PS4变体多肤的方法，W及本发明的其它方面。[0013]序列表[0014]SEQIDNO:1显不源自嗜糖假单胞菌（Pseudomonassaccharophila)麦芽糖四水解酶氨基酸序列的PS4参照序列。SEQIDN0:2显示PSac-D34序列；具有11个取代和缺失了淀粉结合结构域的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:3显示PSac-D20序列；具有13个取代和缺失了淀粉结合结构域的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:4显示PSac-DH序列；具有14个取代和缺失了淀粉结合结构域的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列.SEQIDN0:5显示嗜糖假单胞菌葡聚糖l，4-a-麦芽糖四水解酶前体巧C3.2.1.60)佑4-淀粉酶）（形成麦芽四糖(maltotetraose)的淀粉酶）（外切型麦芽糖四水解酶）（形成麦芽四糖的外切型淀粉酶）。SWISS-PR0T编号P22963。沈QIDN0:6显示编码麦芽四水解酶（EC号=3.2.1.60)的嗜糖假单胞菌mta基因。GenBank编号X16732。沈QIDN0:7显示源自施氏假单胞菌（PseudomonasS化tzeri)麦芽糖四水解酶氨基酸序列的PS4参照序列。SEQIDN0:8显示PS化-D34序列；具有9个取代的施氏假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:9显示PS化-D20序列；具有11个取代的施氏假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:10显示PS化-D14序列；具有12个取代的施氏假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。沈QIDNO:11显示施氏假单胞菌（全海假单胞菌Pseudomonaspe计ectomarina)葡聚糖1,4-a-麦芽糖四水解酶前体巧C3.2.I.60)佑4-淀粉酶）（形成麦芽四糖的淀粉酶）（外切型麦芽糖四水解酶）（形成麦芽四糖的外切型淀粉酶）。5胖155斗301'编号？13507。56910^:12显示施氏假单胞菌形成麦芽四糖的淀粉酶（amy巧基因，完整编码序列（cds)。GenBank编号124516。沈910側：13显示9]\?55序列；具有11个取代佑134氏4141?，115化，62234，册07LS334P，N33Y，D34N，L178F，A179T和G121巧的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。56910側：13显示9]\?55序列；具有11个取代佑134氏4141?，115化，62234，册0化，5334口，N33Y，D34N，L178F，A179T和G121巧和缺失淀粉结合结构域的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:14显示PMD96序列：在N33Y，D34N，G121F，G134R，A141P，I157LS161A，L178F，A179T，G223E，册0化和S334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:15显示SSM381序列：在33Y,34N,121F,134R,141P,146G,15化，161A，178F，179T，223E，30化和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。沈QIDNO:16显示SSM279B1序列：在33Y,：MN，121F,1：MR，141P,157M,161A,178F,179T，223E，30化和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:17显示SSM237P2序列：在33Y,：MN，121F,1：MR，141P,157L158T,161A,178F,179T,223E，30化和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:18显示在33Y，：MN，121F，1：MR，141P，157レ161A，178F，179T，198W，223E，30化和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:19显示SSM325F3序列：在33Y,34N,121F,134R,141P,15化，161A,178F,179T,223E,229P,30化和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:20显示PMD129序列：在33Y,：MN，121F,1：MR，141P,157L161A,178F,179T,198W,223E,229P,30化和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDNO:21显示SSM341A9序列：在33Y，34N,121F,134R,141P,15化，161A,178F,179T,223E,303E,30化和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:22显示SSM341G11序列：在33Y，34N，121F,134R,141P,15化，161A,178F,179T,223E,303D,30化和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:23显示SSM350B11序列：在33Y，34N，121F，134R,141P,15化，161A,178F,179T,223E,306T,30化和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:24显示SSM350C12序列：在33Y，34N，121F，134R，141P，15化，161A，178F，179T，223E，306G，30化和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:25显示SSM332Q4序列：在33Y,34N,121F,134R,141P,157L，161A，178F，179T，223E，309P，30化和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:26显示SSM365B4序列：在33Y,34N,121F,134R,141P,157L161A，178F，179T，223E，30化，316S，和334P上具有氨基酸突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。SEQIDN0:27显示SSM365F4:在33Y，34N,121F,134R,141P,157L161A,178F，179T，223E，307^316P和334P上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。沈QIDN0:28显示SSM360C7:在33Y,：MN，121F,1：MR，141P,157L161A,178F,179T,223E，307^334P和353T上具有突变的嗜糖假单胞菌麦芽糖四水解酶氨基酸序列。【具体实施方式】[0015]在下列描述和实施例中，除非上下文另外规定，PS4变体多肤的剂量W每百万面粉中的部分/(微克每克）来给出。例如，表2中所用的"1D34"表示基于重量/重量的每百万中的1部分pSac-D34。优选地，利用Rra壯ord(1976,Arapidandsensitivemethodforthequanti円cationofmicroorganismquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248-254)中所述的测定，基于作为W牛血清白蛋白（BSA)为标准测量的纯酶蛋白的等同物的活性测定来确定酶数量或量。[0016]在描述通过本文生产或预期为本文所包括的不同PS4变体多肤变体中，将采用下列命名法W易于参照：[0017](i)在取代包括数字和字母时，例如，141P，则该指[根据编号系统的位置/取代氨基酸]。因此，例如，在位置141上氨基酸取代成脯氨酸表示为141P;[0018](ii)当取代包括字母时，数字和字母，例如，A141P，则该指[最初氨基酸/根据编号系统的位置/取代氨基酸]。因此，例如，在位置141上W脯氨酸取代丙氨酸表示为A141P。[0019]在特定位置上可能有两种或多种取代物时，该将通过邻接的字母来表示，其可W任选地由斜线标记"/"来分隔，例如，G303邸或G303E/D。当在一定位置上的相关氨基酸能够由任何氨基酸取代时，该通过[根据编号系统的位置/X]来表示，例如，121X。[0020]多个突变可W通过由斜线标记V"分隔来表示，例如A141P/G223A代表在位置141和223上的突变，分别W脯氨酸取代丙氨酸和W丙氨酸取代甘氨酸。[0021]除非另外指定，本文所用的全部技术和科学术语都具有与本发明所属【
技术领域：
】普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton,等人,Dictionary日FMice日biologyANDM日LECULARBiology,2〇Ed.，JohnWileyandSons,NewYork(1994)，和Hale&Marham,成邸邸00化燃DictionaryOFBiology,HarperPerennial,NY(1991)向本领域技术人员提供本发明中所用到的许多术语的通用辞典。尽管可W将与本文所述那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料用于本发明的实践或测试中，还是描述了优选的方法和材料。数字范围包括定义范围的数字。除非另外指定，分别地，棱酸W5'到3'方向从左到右书写：氨基酸序列W氨基到簇基方向从左到右书写。[0022]除非另外指定，本发明的实践将采用，化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学常规技术，其在本领域普通技术人员的能力么内。这些技术在文献中得W解释。见，例如，J.Sambrook,E.F.F'ritsch,和T.Maniatis,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,Booksl-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress:AusubeI，F.M.等人(1995andperiodicsupplements：CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13,andl6,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.):B.民oe,J.Crabtree,andA.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencing!EssentialTechniques,JohnWiley&Sons：J.M.PolakandJamesD.McGee,1990,InSituHybridizationiPrinciplesandPractice：OxfordUniversityPress:M.J.Gait(Editor)，1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrlPress:D.M.J.LilleyandJ.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress：UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBNO-87969-544-7)：Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBNO-87969-314-2),1855,Lars-IngeLarsson''Immunocytochemistry:TheoryandPractice'，，CRCPressinc.,BacaRaton,Florida,1988,ISBNO-8493-6078-1,JohnD.Pound(ed);"ImmunochemicalProtocols,vol80",intheseries:"MethodinMolecularBiology",HumanaPress,Totowa,NewJersey,1998,ISBNO-89603-493-3,HandbookofDrugScreening,editedbyRamakrishnaseethala,PrabhavathiB.Fernandes(2001,NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN〇-8247-〇562-9);和LabRef:AHan化ookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,EditedJaneRoskamsandLindaRodgers,2002,ColdSpringHarborL油oratory,ISBNO-87969-630-3。将该些一般性文本的每一篇都并入本文作为参考。[0023]将本文中参考的所有专利和公开出版物，包括该些专利和公开出版物中公开的所有序列都并入本文作为参考。[0024]PS4变体多肤[0025]我们提供在一个或多个位置上具有取代的非产麦芽糖外切型淀粉酶，其带来相对于亲本酶的改变的特性，优选改变的外切特异性或改变的热稳定性，或二者都有。[0026]我们进一步提供组合物，包括含有具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的多肤的食品添加剂、食品、烘赔产品、改良剂组合物、饲料产品包括动物饲料等，W及制备和利用该些多肤和组合物的方法。我们提供该些组合物如在制备去污剂、作为甜味剂、糖浆等中的其它用途。所述组合物包括多肤与至少一种其它组分。特别地，我们提供包含所述多肤的食品或饲料添加剂。[0027]通过包括多个突变该些多肤和核酸区别于它们的亲本序列，并且为了方便称作"PS4变体多肤"。换句话说，PS4变体多肤或核酸的序列在多个位置或残基上有别于其亲本。在优选的实施方案中，突变包含氨基酸取代，即，一个氨基酸残基改变成另一个。PS4变体多肤在亲本序列的一个或多个位置上包含多个氨基酸残基性质的变化。[0028]本文所用的术语"变体"应当用来意指可源自亲本分子的分子。变体包括多肤W及核酸。变体包括在一个或多个位置上的取代、插入、颠换和倒位等等。变体还包括截短。变体包括亲本分子的同源和功能性衍生物。变体包括与能够杂交本文给出的核巧酸序列的序列互补的序列。[0029]PS4变体多肤的取代[0030]我们提供具有序列改变化的PS4变体多肤，所述多肤包含非产麦芽糖外切型淀粉酶序列中的氨基酸取代。相对于SEQIDN0:1中所示的嗜糖假单胞菌（Pseudomonassaccharophilia)外切型淀粉酶序列的位置编号，氨基酸取代可W是在位置26,70,121，145,146,157,158,161，188,198,223,229,272,303,306,309,316,339和353的其中一个或多个上。[0031]氨基酸突变可W是在选自下组的一个或多个位置上：（a)位置121，161,223;化）位置146,157,158,198,229,303,306,309,316,353;和（C)位置26,70,145,188,272,339;W及（a)、化）和（C)的任意组合。[0032]氨基酸取代可W包含对121F，121Y，121W，161A，223E，223K的改变。或者，或此外，氨基酸取代可W包含对146G,146M,157M,158T,158A,158S,198W,198F,229P,303E,303D,306T，306G，309P，316S，316P，31服，316Q，353T的改变。还或者，或此外，氨基酸取代可W包含对26E,70D,114抓，188S,188T,188H,272Q,339A,33犯的改变。[0033]该些变体多肤在本文中称为"PS4变体多肤"。还公开了编码该些变体多肤的核酸并且为了方便将称作"PS4变体核酸"。PS4变体多肤和核酸将在下面更详细地描述。[0034]"亲本"序列，即，PS4变体多肤和核酸W其为基础的序列，优选是具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的多肤。应当相应地解释术语"亲本酶"和"亲本多肤"，并用来意指PS4变体多肤W其为基础的酶和多肤。下面对它们作更详细地描述。[0035]在特别优选的实施方案中，亲本序列是非产麦芽糖外切型淀粉酶，优选细菌非产麦芽糖外切型淀粉酶。在高度优选的实施方案中，亲本序列包含葡聚糖1,4-a-麦芽糖四水解酶(麦芽糖四水解酶）巧C3.2.1.60)。优选地，亲本序列可源自假单胞菌属菌种，例如嗜糖假单胞菌或施氏假单胞菌。[0036]在一些实施方案中，亲本多肤包含，或与例如，来自假单胞菌属的种（SPP.)的野生型非产麦芽糖外切型淀粉酶序列同源。[0037]因而，亲本多肤可W包含具有如SEQIDNO:1所示序列的嗜糖假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶。在其它优选的实施方案中，亲本多肤包含具有如SEQIDNO:11所示序列的来自施氏假单胞菌的非产麦芽糖外切型淀粉酶，或具有SWISS-PR0T编号P13507的施氏假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶。[0038]在另一方面，亲本多肤可W是任何野生型序列的变体，也就是说，亲本多肤可W自身进行工程化改造，或包含PS4变体多肤。[0039]不过，对于熟练读者将会显而易见的是尽管PS4变体多肤可W通过突变已经突变过的序列而衍生，但有可能通过起始自野生型序列（或事实上任何合适的序列），鉴定起始序列与所需变体之间的差异，W及将需要的突变导入起始序列中W便获得所需的变体来构建该些变体多肤。[0040]涉及、优选与如SEQIDNO:1所示的嗜糖假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶序列或与如SEQIDNO:11所示序列的施氏假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶具有序列或功能同源性的蛋白质和核酸在本文中称作"PS4家族"成员。下面进一步详细地披露适用于生成PS4变体多肤和核酸的"PS4家族"非产麦芽糖外切型淀粉酶的例子。[0041]本文描述的PS4变体多肤优选保留亲本多肤的特征，并且另外优选具有其它有益特性，例如，增强的活性或热稳定性、或抑耐受性、或任意组合（优选全部）。下面对该进行更详细的描述。[0042]该里描述的PS4取代突变体可W用作任意合适的目的。它们可W优选用于适于亲本酶的目的。特定地，它们可W用于任何使用外切型麦芽糖四水解酶的应用中。在高度优选的实施方案中，它们具有较高热稳定性，或较高外切型淀粉酶活性或较高抑稳定性，或任意组合的额外优点。PS4变体多肤和核酸的适当用途的例子包括食品生产，特别是烘赔，W及食物生产；下面更详细地列出其它例子。[0043]除了上面给出的那些位置之外，PS4变体多肤可W包含一个或多个其它突变。除了已经给出那些的之外还可W有一个，两个，H个，四个，五个，六个，走个或更多的突变优选取代。还可W在一个或多个其它位置上包括其它突变，如缺失、插入、取代、颠换、转换和倒位。此外，PS4变体不必在列出的位置上具有全部取代。事实上，它们可W缺失一个，两个，H个，四个，或五个取代，即，野生型氨基酸残基存在于该些位置上。[0044]基于野生型序列的PS4变体多肤[0045]在亲本多肤包含野生型序列的实施方案中，PS4变体多肤可W包含野生型序列，但是在位置121，161和223,优选121F，121Y，121W，161A，223E或223K，更加优选G121F,G121Y,G121W,S161A,G223E或G223K的一个或多个上具有突变。[0046]PS4变体多肤可W包含野生型序列，或在前段落中给出的序列，但是在位置146,157,158,198,229,303,306,309,316或353,优选146G,146M,157M,158T,158A,158S,198W,198F,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P,316K,316Q或353T,更加优选146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T的一个或多个上具有突变。[0047]PS4变体多肤可W包含野生型序列，或在前两段中给出的序列，但是在位置26,70,145,188,272或339,优选26E,26D,70D,14抓，188S,188T,188H,272Q,339A或33犯，更加优选N26E,N26D,G70D,N14抓，G188S,G188T,G18細，肥72Q,W339A或W33犯的一个或多个上具有突变。[0048]通常，位置的任意组合，取代和特定突变可W任意方式和W任意数目组合W产生本文公开的PS4变体多肤。[0049]因而，我们公开了基于野生型PS4亲本序列的PS4变体多肤，优选地，具有如SEQIDN0:1所示序列的嗜糖假单胞菌非产麦芽糖外切型淀粉酶。因而，PS4变体多肤可W包含SEQIDNO:1中所示的序列，但是在上面给出的位置上具有任何一种或多种突变。PS4变体多肤还可W基于如下面SEQIDN0:7所示的野生型施氏假单胞菌非产麦芽糖酶序列，但是在上面给出的位置上具有任何一种或多种突变。[0050]尽管PS4变体多肤可W基于野生型PS4亲本序列，在优选的实施方案中PS4变体多肤是基于野生型PS4亲本序列的工程化改造(或突变的）版本。因而，在该些实施方案中，亲本序列包含已经突变的PS4序列。如下面更加详细地描述的，可W重新或通过一次或多次突变碱基序列制备该些序列。[0051]位置121，161和/或223[0052]PS4变体多肤可W包含野生型序列，或作为野生型序列变体的突变序列，如在又一个位置如121，161和223上具有取代的已经突变的序列。[0053]因而，在相应一个或多个位置上的一个或多个目标突变一般可W与位置121，161或223中的一个、两个或所有位置上的单个其它突变有益地组合。[0054]位置121取代，在存在时，优选选自下组：121F，121Y，121W，121H，121A，121M，121G,121S,121T,121D,121E,12比，12化和121V。优选地，位置121取代是121F,121Y或121W。位置161取代，在存在时，优选是161A，更加优选S161A。当位置161被突变时，在位置160上的其它突变也可W存在，优选160化更加优选E160D。[00巧]位置223取代，在存在时，优选选自下组：223K,223E,223V,223R,223A,223P和223D。更加优选地，223取代是223E或223K。在特别优选的实施方案中，其它一个或多个取代选自下组：G121F，G121Y，G121W,161A，223E和223K。[0056]在特别优选的实施方案中，PS4变体多肤至少包含H个下列的取代121F/Y/W，161A，223E/K。可W包括如下面所给出的其它突变。[0057]位置146,157,158,198,229,303,306,309,316和353[0058]PS4变体多肤可W包含野生型序列，或作为野生型序列变体的突变体序列，如已经突变了的序列-包括在位置121，161和223中的一个或多个上具有突变的PS4变体多肤。在另一个位置如位置146,157,158,198,229,303,306,309,316和353上具有取代。[0059]位置26,70,145,188,272和339[0060]PS4变体多肤可W包含野生型序列，或作为野生型序列变体的突变体序列，如已经突变了的序列一包括在位置121，161，223,146,157,158,198,229,303,306,309,316和353中的一个或多个上具有突变的PS4变体多肤…在另一个位置如26,70,145,188,272和339上具有取代。[0061]因而，在相应一个或多个位置上的一个或多个目标突变一般可W与位置26,70,145,188,272和339中的一个、两个或所有位置上的单个其它突变有益地组合。[0062]PS4变体多肤可W在位置26上包含取代，优选26E或26E。更加优选地，位置26取代包含N26E或N2抓。最优选地，位置26取代包含N26E。[0063]PS4变体多肤可W在位置70上包含取代，优选70D。更加优选地，位置26取代包含G70D。[0064]PS4变体多肤可W在位置145上包含取代，优选14抓。更加优选地，位置145取代包含N145D。[0065]PS4变体多肤可W在位置188上包含取代，优选188S，188T或188H。更加优选地，位置188取代包含G188S,G188T或G188H。最优选地，位置188取代包含G188S或G188H。[0066]PS4变体多肤可W在位置272上包含取代，优选272Q。更加优选地，位置272取代包含肥72Q。[0067]PS4变体多肤可W在位置W339A上包含取代，优选339A或33犯。更加优选地，位置339取代包含W339A或W33犯。[0068]基于变体序列的PS4变体多肤[0069]与位置33,34,121，134,141，157,178,179,223,307和/或334的组合[0070]在一些实施方案中，亲本序列在位置33,34,121，134,141，157,178,179,223,307和334中的一个或多个，优选全部位置上包含突变（因此PS4变体多肤也将包含有关相应的突变）。[0071]在该些实施方案中，突变优选为：N33Y,D：MN，G121D,G1：MR，A141P,1157^L178F,A179T，G223A，册0化和S334P中的一个或多个，优选全部。[0072]在该些实施方案中，PS4变体多肤可W便利地衍生自包含序列PSac-D34(SEQIDN0:2)的嗜糖假单胞菌非产麦芽糖酶序列。[0073]与位置33,34,121，134,141，157,178,179,223,307和334,121，161和/或223的组合[0074]PS4变体多肤可W进一步包含位置33,34,121，134,141，157,178,179,223,307和334中任一个上的突变，组合W位置121，161和/或223中任一个上的突变。因而，我们公开了包含W下的任意组合的PS4变体多肤：（a)在残基33,34,121，134,141，157,178,179，223,307和334上的任意一个或多个突变，优选N33Y,D34N,G121D,G134R,A141P,11571^，Ll78F，A179T，G223A，册O化和S334P;(b)在位置121，161或223上的任意一个或多个突变，优选121F,121Y,121W,161A,223E或223K,更加优选121F,161A或223E,和（C)在位置146,157,158,198,229,303,306,309,316或353上的任意一个或多个突变，优选146G,146M,157M,158T,158A,158S,198W,198F,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P,316K,316Q或353T,更加优选146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T。[0075]在一些优选的实施方案中，我们提供该样的PS4变体多肤，其包含上面（a)中给出的所有下列突变，组合W上面（C)中给出的一个或多个突变。在其它优选的实施方案中，我们提供该样的PS4变体多肤，其包含上面（a)中给出的所有下列突变，组合W上面化）中给出的所有突变，组合W上面（C)中给出的任一个或多个突变。[0076]基于pMD96的PS4变体多肤[0077]在包括所有（a)和化）中突变的实施方案中，PS4变体多肤可W便利地衍生自包含序列pMD96(SEQIDN0:14)的嗜糖假单胞菌非产麦芽糖酶序列。[0078]因而，我们具体地提供了实施例12到20中给出的PS4变体多肤，其具有序列SEQIDNO:15-28。如实施例中所示，与其亲本相比每一种该些多肤都具有一种或多种改进的特性。[007引其它组合[0080]另外，还可W使用在其它位置，例如，134,141，157,223,307和334中的任一个或多个上包含突变的亲本序列。任选地，该些可W包括位置33和34中的一个或两个上的突变。[0081]因而，亲本序列可W包含在选自下组：134,141，157,223,307,334的位置上的一个或多个突变，和任选地33和34(因此当然PS4变体多肤也将包含有关的相应突变）。[0082]在一些实施方案中，亲本多肤包含取代位置134上的精氨酸，位置141上的脯氨酸和位置334上的脯氨酸，例如，G134R，A141P和S334P。[0083]在另外的实施方案中，亲本多肤进一步包含位置121上的突变。亲本多肤可W进一步包含位置178上的突变。它可W进一步包含位置179上的突变。它还可W进一步包含位置87上的突变。各自特别优选的取代优选为121化更加优选G121化优选178F，更加优选L178F，优选179T，更加优选A179T和优选87S，更加优选G87S。[0084]该些位置上的残基可W被许多残基所取代，例如I157V或I157N或G22化或G223I或G223S或G223T或册071或册07V或D34G或D34A或D34S或D34T或A179V。不过，亲本多肤优选包含取代1157^G223A,册071^，L178F和A179T(任选地N33Y,D34N)。[0085]在高度优选的实施方案中，PS4变体多肤包含位置146,157,158,198,229,303,306,309,316和353中的任一个或多个位置上的取代，优选146G，157M，158T，198W，229P，303E,303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T,W及一个或多个下列取代：G134R,A141P,115TLG223A,册071^，S3：MP，N33Y和D34N,W及L178F和A179T中的一个或两个。[0086]基于PSac-D20的PS4变体多肤[0087]PS4变体可W基于嗜糖假单胞菌非产麦芽糖亲本酶序列PSac-D20(SEQIDNO:3)。[0088]在该种实施方案中，PS4变体多肤包含位置146,157,158,198,229,303,306,309，316和353中的任一个或多个位置上的取代，优选146G，157M，158T，198W，229P，303E，303D，306T,306G,309P,316S,316P或353T,W及一个或多个下列取代：G134R,A141P,115化，G223A,册O化，S334P,N33Y,D34N和G121D,W及L178F和A179T中的一个或两个。[0089]基于PSac-DH的PS4变体多肤[0090]PS4变体可W基于嗜糖假单胞菌非产麦芽糖亲本酶序列PSac-D14(SEQIDN0:4)。[0091]在该种实施方案中，因此PS4变体多肤包含位置146,157,158,198,229,303,306，309,316和353中的任一个或多个位置上的取代，优选146G,157M,158T,198W,229P,303E，303D,306T,306G,309P,316S,316P或353T,W及一个或多个下列取代：G134R,A141P,1157LG223A,册071^，S3：MP，N33Y,D：MN，G121D和G87S,W及L178F和A179T中的一个或两个。[0092]基于pMD55的PS4变体多肤[009引PS4变体可W基于嗜糖假单胞菌非产麦芽糖亲本酶序列PMD55(沈QIDNO:13).[0094]在该种实施方案中，PS4变体多肤包含位置146,157,158,198,229,303,306,309，316和353中的任一个或多个位置上的取代，优选146G,157M,158T,198W,229P,303E,303D，306T,306G,309P,316S,316P或353T,W及一个或多个下列取代：G134R,A141P,115化，G223A,册071^，S3：MP，N33Y,D：MN，G121F和G87S,W及L178F和A179T中的一个或两个。PS4变体多肤可W衍生自具有该种取代的亲本多肤。[0095]基于施氏假单胞菌亲本多肤的PS4变体多肤[0096]在一些实施方案中，PS4变体源自施氏假单胞菌非产麦芽糖酶序列，优选如下面SEQIDNO:7所示。[0097]因此，PS4变体多肤可W衍生自序列PS化-D34(SEQIDN0:8)。我们进一步公开了基于施氏假单胞菌非产麦芽糖酶序列并包括G121和/或G87取代的PS4变体多肤。该些可W包含下列取代：G134R，A141P，I15化，G223A，册0化，S334P，N33Y，D34N和G121D，W及L178F和A179T中的一个或两个，W及包含下列取代的PS4变体多肤：G134R，A141P，I15化，G223A,册071^，S3：MP，N33Y,D：MN，G121D和G87S,W及L178F和A179T中的一个或两个。[0098]所W，PS4变体多肤可W源自施氏假单胞菌非产麦芽糖酶亲本序列，所述亲本序列具有序列PSUi-D20(SEQIDN0:9),其包含G121D，或具有序列PSUi-D14(SEQIDN0:10),其进一步包含G87S。[0099]PS4变体核酸[0100]我们还描述了具有对应于或编码PS4变体多肤序列中变化的序列的PS4核酸，用于为了该里描述的目的来生产该些多肤。因而，我们提供能够编码本文中给出的任意多肤序列的核酸。[0101]技术人员将会意识到核酸序列与多肤序列之间的关系，特别是，遗传密码W及该种密码的简并性，并且将能够毫不困难地构建该些PS4核酸。例如，他将会意识到对于PS4变体多肤序列中的每个氨基酸取代，都可W有一个或多个密码子编码取代氨基酸。因此，将会显而易见的是，取决于该特定氨基酸残基的遗传密码简并性，对应于该PS4变体多肤序列可W生成一种或多种PS4核酸序列。另外，当PS4变体多肤包含一种W上的取代时，例如A141P/G223A，对应的PS4核酸可W包含分别编码两种氨基酸变化的密码子的成对组合。[0102]PS4变体核酸序列可W衍生自编码上述任意亲本多肤的亲本核酸。特别地，亲本核酸可W包含野生型序列，例如，SEQIDN0:6或SEQIDNO:12。所WPS4变体核酸可W包含编码野生型非产麦芽糖外切型淀粉酶的核酸，但其在相应的位置上编码另一种氨基酸而非野生型氨基酸残基。PS4变体核酸序列还可W包含具有一个或多个突变的野生型序列，例如，其编码上述归于"组合"之下的亲本多肤。[0103]将会理解的是与特定PS4变体核酸序列不同，但涉及该些的核酸序列，也将可用于本文所述的方法和组合物，如PS4变体核酸序列的变体、同源物、衍生物或片段，或其能够杂交的补体或序列。除非本文另外规定，术语"PS4变体核酸"应当用来包括上面列出的该些实体的每一种。[0104]可W通过多种本领域已知若干技术中的任一种来制成氨基酸序列和核酸序列中的突变。通过任一种已知诱变技术可W轻易制成变体序列，例如，利用PCRW适当的寡核巧酸引物进行的定点诱变，5'添加突变，错配引物突变等。或者，或此外，PS4变体核酸序列可W重新制备。[0105]在特别优选的实施方案中，如实施例中所说明的，通过使用适当引物的PCR(聚合酶链式反应）将突变引入亲本序列。如所述的，所W有可能通过将任意所需的氨基酸取代导入优选具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的亲本多肤中来改变多肤序列，如在氨基酸或核酸水平上导入嗜糖假单胞菌或施氏假单胞菌外切型淀粉酶序列。我们介绍了通过改变编码非产麦芽糖外切型淀粉酶的核酸序列来改变非产麦芽糖外切型淀粉酶序列的方法。[0106]不过，当然将会理解的是PS4变体多肤并不需要实际上源自野生型多肤或核酸序列，例如，通过一步步的突变。相反，一旦确定了PS4变体多肤的序列，技术人员就能够轻易地通过本文已知的方法，例如，使用合适的寡核巧酸引物和PCR，由野生型制成具有所有突变的序列。事实上，可W通过，例如，肤合成方法来从头制成具有其所有突变的PS4变体多肤。[0107]不过，通常PS4变体多肤和/或核酸衍生自或可W衍生自"前体"序列。本文所用的术语"前体"意指在根据本文所述方法修饰的酶和该里所描述的组合物之前的酶。所W前体包括用来产生经修饰的酶的酶。因而，前体可W是通过本文中其它任何地方所述的诱变进行修饰的酶。同样地，前体可W是野生型酶，变体野生型酶或已经突变过的酶。[010引可W通过本领域已知的任何方法来产生PS4变体多肤和核酸。具体地，它们可W由表达系统进行表达，所述表达系统性质上可W是体外或体内的。具体地，我们介绍了含有PS4核酸序列的质粒和表达载体，优选能够表达PS4变体多肤。还公开了包含W及优选用该些PS4核酸、质粒和载体转化的细胞和宿主细胞，并且应当清楚该些也包括在本文中。[0109]在优选的实施方案中，将PS4变体多肤序列W分离的形式用作食品添加剂。术语"分离的"意指该序列至少基本上不含一种其它组分，所述其它组分在自然界中与该序列天然相关联并在自然中发现。在一方面，优选该序列为纯化的形式。术语"纯化的"意指该序列处于相对纯的状态一例如至少大约90%纯，或至少大约95%纯或至少大约98%纯。[0110]位置编号[0111]本文中通过编号提及的所有位置都参照下面所示的嗜糖假单胞菌外切型淀粉酶参照序列（SEQIDN0:1)的编号：[0112]【权利要求】1.一种非产麦芽糖外切型淀粉酶变体，其在对应于SEQID勵：1的位置121、146、157、161、223、229、272、303和309或在亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶的对等位置含有至少一个氨基酸取代，其中亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶的氨基酸序列是SEQIDNO:l、2、3、4、5、7或8。2.-种通过在具有非产麦芽糖外切型淀粉酶活性的亲本多肽中引入至少一个氨基酸取代获得的PS4变体多肽，其中氨基酸取代选自参照SEQIDNO:l的位置编号的121F、121Y、146G、157M、161A、223E、229P、272Q、303E和309P。3.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶缺少淀粉结合结构域。4.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶是SEQIDNO:1或5。5.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中变体包含参照SEQIDN0:1的位置编号的一个或多个下述取代：121F、121Y、146G、157M、161A、223E、229P、272Q、303E和309P。6.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中变体选自下组：PSac-D34(SEQIDN0:2)、PSac-D20(SEQIDN0:3)、PSac-D14(SEQIDN0:4)、PStu-D34(SEQIDN0:8)、PStu-D20(SEQIDN0:9)、PStu-D14(SEQIDN0:10)、pMD55(SEQIDNO:13)、pMD96(SEQIDNO:14)、SSM381(SEQIDNO:15)、SSM279B1(SEQIDN0:16)、SSM237P2(SEQIDN0:17)、SEQIDN0:18、SSM325F3(SEQIDN0:19)、pMD129(SEQIDN0:20),SSM341A9(SEQIDNO:21),SSM341G11(SEQIDNO:22),SSM350B11(SEQIDN0:23),SSM350C12(SEQIDNO:24),SSM332Q4(SEQIDNO:25),SSM365B4(SEQIDN0:26)、SSM365F4(SEQIDN0:27)和SSM360C7(SEQIDN0:28)、SSM219B3、SAS1401L10、SAS1387D16bf、pMD236、pMD237bf、SAS1379013和SAS137909。7.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶选自获自假单胞菌属，优选嗜糖假单胞菌或施氏假单胞菌的非产麦芽糖外切型淀粉酶。8.如权利要求7所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶获自嗜糖假单胞菌。9.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中，与亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶相比，非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽显示增加的热稳定性。10.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中，与亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶相比，非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽显示增加的特异性活性。11.如权利要求1或2所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽，其中，与亲本非产麦芽糖外切型淀粉酶相比，非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽既显示增加的热稳定性又显示增加的特异性活性。12.-种多核苷酸，其编码权利要求1到11任一项所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽。13.-种载体，其包含权利要求12所述的多核苷酸。14.一种宿主细胞，其包含权利要求13所述的载体。15.如权利要求14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞或酵母细胞。16.-种酶组合物，其包含权利要求1到11任一项所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽。17.如权利要求16所述的酶组合物，其包含Novamyl。18.如权利要求16或17所述的酶组合物，其中酶组合物用于生面团产品以延迟或减弱生面团产品的陈化。19.一种在宿主细胞中生产非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽的方法，其包括在适于表达和生产非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽的条件下培养权利要求14或权利要求15所述的宿主细胞并生产非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽。20.如权利要求19所述的方法，其进一步包括从培养物回收非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽。21.-种制作烘焙产品的方法，其包括：(a)提供淀粉介质；(b)向所述淀粉介质中添加权利要求1-11任一项所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽；和（c)在步骤(b)之中或之后加热所述淀粉介质以生产烘焙产品。22.-种通过权利要求21所述的方法获得的食品产品、饲料产品、生面团产品或烘焙产品。23.-种组合物，其包含面粉和权利要求1-11任一项所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽。24.-种食品产品、饲料产品、生面团产品或烘焙产品，其包含权利要求1-11任一项所述的非产麦芽糖外切型淀粉酶变体或PS4变体多肽。【文档编号】C12N9/28GK104357424SQ201410136270【公开日】2015年2月18日申请日期:2005年7月7日优先权日:2004年7月7日【发明者】卡斯珀·T·伯格,帕特里克·M·F·德克斯,卡罗尔·菲奥里西,吉斯伯特·格里茨,安贾·H·凯利特－史密斯,卡斯滕·M·克拉夫,刘巍,安德鲁·肖,鲍·S·索伦森,夏洛特·R·索达尔申请人:杜邦营养生物科学有限公司,美国丹尼斯克公司