一种用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH探针组合物、试剂盒及其使用方法

一种用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH探针组合物、试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH探针组合物，该探针组合物中包含有用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH探针。本发明还提供了一种用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH试剂盒，所述FISH试剂盒中包含如权利要求1-5中所述的FISH探针组合物。另外，本发明还公开了用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH试剂盒的使用方法。本发明的技术方案，直接采用荧光原位杂交技术对唾液中多种与食管癌相关miRNA基因进行检测，既可直接对样品进行原位定量，又可实现无创早期食管癌的诊断与筛查。
【专利说明】—种用于检测与食管癌相关m i RNA基因的FISH探针组合物、试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH探针组合物、试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]MicroRNAs (miRNAs)是近些年来发现的一类内源性的具有调控功能的非编码小分子RNA，其大小长约20~25个核苷酸。miRNA基因在细胞核内由RNA聚合酶II转录后形成初级转录产物(pr1-RNAs)。Pr1-RNA经过一系列加工处理后成为19_25bp左右的成熟miRNA。成熟的miRNA在细胞中可以与蛋白质结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA inducedsilencing complex, RISC)。RISC与祀mRNA基因不完全配对时,可以阻断miRNA的翻译过程，降低表达；RISC与靶mRNA完全配对时，则可以导致mRNA的降解。miRNA通过阻断或者降解的mRNA表达来控制靶基因的表达，从而达到调控基因的分化、凋亡等一系列的过程【Hobert 0.Gene regulation by transcription factors and microRNAs[J].Science, 2008，319(5871): 1785-1786】。
[0003]肿瘤的发生发展与基因密不可分，环境因素以及遗传等的因素都可以导致或者引起DNA的变化，从而激活原癌基因或引起肿瘤抑制基因的灭活，引起基因表达水平的异常，使靶细胞发生转化。研究发现，超过50%的miRNA基因位于原癌基因或抑癌基因的染色体脆性位点(fragile sites)或相关遗传区域【Calin等，Human microRNA genes arefrequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(9):2999-3004.】。miRNA 基因往往在肿瘤中发生异常表达，其在肿瘤的发生发展过程中能够作为致癌因子或抑癌因子参与肿瘤的各个过程，对比肿瘤细胞与正常组织细胞间来源的miRNA发现，其表达谱具有明显差异【Castilla等，Micro-RNA signature of the epithelial-mesenchymal transition in endometrialcarcinosarcoma [J].J Pathol, 20`11, 223(1):72-80.】。研究表明 miRNA 在细胞凋亡、增殖、分化、血管生成及肿瘤形成等方面均具有重要的调节作用，参与人体大约30%的基因调节，与心血管疾病、肿瘤、免疫紊乱及代谢紊乱等多种发病有关。已有研究发现若干miRNA的负调控作用与白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌和结肠癌等高度相关。因此，miRNA在肿瘤诊断以及判断预后等方面具有重要的参考价值。
[0004]食管癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，是世界上发病率第八死亡率第六的癌症，我国是食管癌的高发地区，每年因食管癌死亡人数约为15万人，其死亡率占我国恶性肿瘤死亡率的第四位，近年来发病及死亡虽有下降趋势，但目前仍然处于较高水平。如今新辅助化疗的运用，抗肿瘤生物靶向药物的出现，基因制剂的研制，食管内镜等微创外科的开展都为食道癌患者带来了福音。但是食道癌的发病率和死亡率仍较高。目前食道癌的存活率仍较低，仅有3%~5%的患者能够存活5年。由于早期症状不明显，大部分临床食管癌患者已到中晚期，且半数以已上发生肿瘤迁移。因此，提高食道癌的早期诊断水平和治疗是至关重要的。
[0005]miRNA与食管癌的发生发展关系非常密切，通过检测食管癌组织miRNA的表达谱，发现其在正常组织与肿瘤组织中的表达水平具有明显的差异【Hanahan等，Thehallmarks of cancer[J].cell, 2000，100(I):57-70.】。Guo 等【Guo 等，DistinctivemicroRNA profiles relating to patient survival in esophageal squamous cellcarcinoma [J].Cancer research, 2008, 68 (I): 26-33.】最早米用基因芯片的方法检测了食管癌组织中的miRNA表达，发现在食管癌组织中有46种miRNA的表达明显区别于癌旁正常组织，并找到了 7种miRNA可以区分恶性病变和正常食管癌组织。Ye等【Ye等，Genetic variations in microRNA-related genes are novel susceptibility loci foresophageal cancer risk [J].Cancer Prevention Research, 2008，I (6): 460-469.】通过对346例食管癌进行研究发现，7个miRNA相关基因的单核苷酸多态性和食管癌的发病风险有关，其中位于pre-miR423区的单核苷酸多态性rs6505162位点可能与降低食管癌的风险有关，表明miRNA基因组水平的改变和食管癌的发生有关，这些miRNA可作为食管癌诊断的分子标志物。Kan 等【Kan 等,The miR-106b-25Polycistron, Activated by GenomicAmplification, Functions as an Oncogene by Suppressing p21and Bim[J].Gastroenterology, 2009, 136(5): 1689-1700.】用微阵列芯片法研究发现，食管癌组织mir-106b_25有异常表达，并用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)证实其存在。Komatsu等【Komatsu等，Circulating microRNAs in plasma of patients with oesophageal squamous cellcarcinoma [J].British journal of cancer, 2011，105 (I): 104-111.】对食管鱗状细胞癌患者血浆中循miRNAs进行了相关研究，发现血浆中miRNA-21表达水平明显高于正常人，提出高水平表达的RNA-21容易侵袭血管，产生血行转移，并与肿瘤的发有着密切的关系，从而发现miRNAs可能成为检测和诊断食道癌新的肿瘤基因标志物。通过研究这些不正常的miRNA，将有助于进一步阐明食管癌的发病机制，并将有助于食管癌癌变组织的检测、诊断、治疗以及预后的判断。
[0006]多种miRNAs已被发现在食管癌患者的组织和血浆内表达失调，并对食管癌具有检测诊断作用【Komatsu 等，Circulating microRNAs in plasma ofpatients with oesophageal squamous cell carcinoma[J].British journal ofcancer, 2011, 105 (I): 104-111.】。由于唾液腺血运丰富，被认为是血循环的末端产物，几乎所有的在血液中存在的分子物质也见于唾液中，如蛋白、RNA、DNA、病毒颗粒等【Lee等，Saliva:an emerging biofluid for early detection of diseases[J].American journalof dentistry, 2009, 22(4):241.】。近年来也有研究报道组织、血浆和唾液三者具有相似的miRNA表达谱，即若干个同种miRNA在患者的癌组织、血液和唾液中的表达同时发生了显著的变化[Wiklund等，MicroRNA alterations and associated aberrant DNA methylationpatterns across multiple sample types in oral squamous cell carcinoma[J].PLoSOne，2011，6 (I I): e27840.】。我们的前期研究【吴伟东等，唾液中miRNA-144可作为早期诊断食道癌的基因标志物[J].南方医科大学学报，2013(12).】表明食道癌患者唾液中miRNA-144存在高表达，可作为早期诊断食道癌的基因标志物，因此开展唾液中miRNA_144基因及其他在食道癌中表达差异显 著的miRNA的FISH (荧光原位杂交技术，fluorescentin situ hybridization)检测将有助于食道癌的早期筛查与诊断。[0007]国内外对食管癌组织miRNA分析的方法很多，如基因芯片筛选食管癌miRNA，RT-PCR定量分析等。基因芯片可以直接测定一份标本的多种miRNA，但是此方法背景和杂信号干扰大，重复性差，不能区分差异小的miRNA，因此被用于食管癌miRNA的筛选。RT-PCR技术通过实时监测目标miRNA转录基因的扩增产物来推算目标基因的量，灵敏度高，精确度高，但是多了转录步骤，程序略复杂。此外，由于实验条件的差异，会影响实验效果，例如:
(I)标本离体时间、保存条件不同，影响组织样本中可能的RNA的降解；(2)总RNA提取方法不同、试剂不同，影响核酸回收率，并最终影响定量；(3)因仪器、试剂不同，cDNA合成效率不同。由于以上实验条件没有统一的标准，会使结果的重复性较差，有的甚至出现截然相反的结论，严重阻碍着食管癌组织miRNA检测的发展和应用。再者，食管癌组织miRNA检测需要采集较多的新鲜组织(20~80mg)，不宜作为术前筛查，也阻碍着食管癌组织miRNA检测。
[0008]综上所述，本领域中尚无采用FISH技术检测唾液中食道癌的基因标志物miRNA基因，因此可开发该技术应用于食道癌早期筛查工作中。

【发明内容】

[0009]为了克服现有技术的缺陷，一方面，本发明所解决的技术问题在于提供一种用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH探针组合物。
[0010]本发明的用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH探针组合物，其特征在于，该探针组合物中包含有用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH探针。
[0011]优选地，所述与食管癌相关miRNA基因至少包含以下基因中的一种:
[0012]hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因、hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129 基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因。
[0013]其中，所述hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因为上调基因，所述 hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因为下调基因。
[0014]优选地，所述FISH探针为以下核酸探针中的至少一种:
[0015](I)针对hsa-miR-144基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的核酸探针:5’ -CTTACAGTATATGATGATATCC-3’ ；
[0016](2)针对hsa-miR-1180基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的核酸探针:5’ -TATTCCCGGCCGGGTGGGTCC-3’ ；
[0017](3)针对hsa-miR_196b基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的核酸探针:5’ -CCCAACAACAGGAAACTACCTA-3’ ；
[0018](4)针对hsa-miR-149基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的核酸探针:5， -GGGAGTGAAGACACGGAGCCAGA-3，；
[0019](5)针对hsa-miR-1825基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示的核酸探针:5， -GGAGAGGAGGGCACTGGA-3，；
[0020](6 )针对hsa-miR-760基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示的核酸探针:5， -TCCCCACAGACCCAGAGCCG-3，；
[0021](7)针对hsa-miR_135b基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的核酸探针:5， -TCACATAGGAATGAAAAGCCATA-3，；
[0022](8)针对hsa-miR-139基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示的核酸探针:5’ -ACTCCAACAGGGCCGCGTCTCCA-3’ ；
[0023](9)针对hsa-miR-1539基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的核酸探针:5’ -GGCATCTGGGACGCGCAGGA-3’ ；[0024](10)针对hsa-miR-1281基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示的核酸探针:5， -GGGAGAGGAGGAGGCGA-3，；
[0025](11)针对hsa-miR-129基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示的核酸探针:5， -GCAAGCCCAGACCGCAAAAAG-3，；
[0026](12)针对hsa-miR-1267基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示的核酸探针:5， -TGGGGATTACACTTCAACAGG-3，；
[0027](13)针对hsa-miR-362基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.13所示的核酸探针:5’ -TGAATCCTTGAATAGGTGTGTT-3’ ；
[0028](14)针对hsa-miR-766基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.14所示的核酸探针:5， -AAGACCAGCACCAATTCCTCCT-3，；
[0029](15)针对hsa-miR-933基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.15所示的核酸探针:5’ -GGGAGAGGTCTCCCTGCGCACA-3’。
[0030]作为本发明的优选方案，在本发明的优选实施例中，所述FISH探针为核苷酸序列如SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.1所示的核酸探针的组合。
[0031]另一方面，本发明所解决的技术问题还在于提供一种用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH试剂盒，所述FISH试剂盒中包含上述方案中所公开的FISH探针组合物。
[0032]优选地，本发明的FISH试剂盒中所用的FISH探针组合物制成溶液，该溶液是通过将FISH探针溶解在2x SSC缓冲液中得到，探针浓度为5ng/μ 1，所述2 X SSC缓冲液是以氯化钠8.8g，柠檬酸钠4.4g，去离子水400ml配制而成。
[0033]优选地，本发明的FISH试剂盒中还包括4’，6_ 二脒基_2_苯基吲哚复染液。
[0034]再则，本发明所解决的技术问题还在于提供了一种用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0035](I)将待检测唾液样品固定在防脱落载玻片上，对玻片上的唾液样品进行预处理；
[0036](2)分别将FISH探针滴加于载玻片圆孔中的样品处，每个探针加2个复孔，使探针待测样品进行变性杂交；
[0037](3)杂交后，对玻片进行洗涤；
[0038](4)使用复染液对玻片上的杂交区域进行复染；
[0039](5)使用荧光显微镜观察玻片的杂交区域。
[0040]优选地，该FISH试剂盒的使用方法的相应步骤中包含如下(I) - (4)项中的任意一项或者多项的具体操作方式:
[0041](I)步骤(1)中将待检测唾液样品固定和预处理具体为:
[0042]①将新鲜收集到的唾液1500rpm离心8min ；
[0043]②去上清，加入5ml0.075M kcl低渗液，混匀，后放入37°C水浴30min ；
[0044]③加入2ml固定液预固定,混合均匀后1500rpm离心8min ;该固定液甲醇:冰乙酸=3:1混合溶液
[0045]④去上清,加入5ml固定液固定,混合均匀后1500rpm离心8min,去上清,加入5ml固定液，混匀后于_20°C保存备用；
[0046]⑤取出预固定好的唾液标本，1500rpm离心8min,去上清,加适量固定液；
[0047]⑥吹打混匀后吸取少量细胞固定液滴片于防脱落载玻片上，自然晾干，56°C烤片30min,防止掉片，滴片前一定要将细胞吹打散开，滴片时保证细胞均匀散开，防止细胞太密集，也要保证有足够计数的细胞；
[0048]⑦将上步所得玻片置于37°C预热的2XSSC溶液中浸泡lOmin，洗涤玻片，增加细胞核的通透性；
[0049]⑧蛋白酶K于55°C消化5-10min ;
[0050]⑨玻片于2 X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ；
[0051]⑩将玻片一次置于70%、95%乙醇溶液中各2min，进行梯度脱水，自然晾干玻片；
[0052](2)步骤(2)将待探针与玻片上的待测样品进行变性杂交具体为:①分别取15种探针试剂I μ 1，2 X SSC缓冲液9 μ 1，混合得到15种不同的探针混合液将上述15种探针混合液分别滴加于样品处，每个探针加样2个复孔，盖上盖玻片，于杂交仪上73°C变性5min，37°C杂交过夜；
[0053](3)步骤(3)玻片洗涤具体为:①去掉封片胶和盖玻片，于46-48°C水浴2X SSC溶液中2次，每次5min;②将玻片置于46°C 0.1%ΝΡ_40/2XSSC中，晃动l_3S，5min后取出；
③70%、95%乙醇中脱水各2min，甩干，自然干燥；
[0054](4)步骤(3)复染具体为:向杂交区加入15 μ 1DAPI，盖上大盖玻片，盖上盖玻片，暗处放置10-20min。
[0055]相比于现有检测方法，本发明的技术方案至少具有以下优势:
[0056]现有技术中，常采用PCR或Q-PCR对血液样品中mir_144等基因进行检测，在该过程中涉及到核酸抽提、逆转录及PCR等繁琐步骤，且采集血液会对病患造成创伤性；本试剂盒直接采用荧光原位杂交技术对唾液中多种与食管癌相关miRNA基因进行检测，既可直接对样品进行原位定量，又可达到无创早期食管癌的诊断与筛查。由于食道癌患者唾液中多种miRNA存在高表达，可作为早期诊断食道癌的基因标志物，因此采用本发明的技术方案通过唾液对与食管癌相关miRNA基因表达的检测可达到易采集、无创伤性、快速检测等优点。另外，采用本发明的方案能够同时对多种(最多15种)与食管癌相关miRNA基因的表达情况进行检测，技术实践中，如何使多种探针的组合物在荧光原位杂交反应中表现出良好的有效性和特异性是一项好大的选择过程，而本发明的探针组合物中包含的多种探针能够高效、特异性明显地与各自针对的目的基因进行特异性杂交，并高效、快捷地通过显示出正确的检测结果，大大提高检测效率，为相应的与食管癌相关miRNA基因的表达情况的检测以及食管癌的检测提供了一种有效途径。【专利附图】

【附图说明】
[0057]图1是本发明实施例3中FISH检测食道癌患者唾液样品中与食管癌相关miRNA基因表达阳性的实验结果图。其中，A为hsa-miR-144基因表达阳性、B为hsa-miR-1180基因表达阳性、C为hsa-miR-196b基因表达阳性、D为hsa-miR-149基因表达阳性、E为hsa-miR-1825基因表达阳性、F为hsa-miR-760基因表达阳性、G为hsa_miR-135b基因表达阳性、H为hsa-miR-139基因表达阳性、I为hsa-miR-1539基因表达阳性、J为hsa-miR-1281基因表达阳性、K为hsa-miR-129基因表达阳性、L为hsa-miR-1267基因表达阳性、M为hsa-miR-362基因表达阳性、N为hsa-miR-766基因表达阳性、O为hsa-miR-933基因表达阳性。其中 hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因为上调基因。hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129 基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因为下调基因。
[0058]图2是本发明实施例3中FISH检测正常组唾液样品中与食管癌相关miRNA基因表达阳性的实验结果图。
[0059]图3是本发明实施例3中阴性样品中与食管癌相关miRNA基因表达阳性的实验结果图。
【具体实施方式】
[0060]为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0061]实施例1:探针 的设计与合成。
[0062]通过在线数据库miRBase (http://www.mirbase.0rg/)对15种与食管癌相关miRNA基因进行分析，设计18-25bp的荧光素标记探针待检测基因及其探针序列如下所示:
[0063](I)针对 hsa-miR-144 基因的探针:5’ -CTTACAGTATATGATGATATCC-3 (SEQ IDN0.1)；
[0064](2)针对 hsa-miR-1180 基因的探针:5’ -TATTCCCGGCCGGGTGGGTCC-3 (SEQ IDN0.2)；
[0065](3)针对 hsa-miR-196b 基因的探针:5’ -CCCAACAACAGGAAACTACCTA-3’ (SEQ IDN0.3)；
[0066](4)针对 hsa-miR-149 基因的探针:5’ -GGAGTGAAGACACGGAGCCAGA-3’ (SEQ IDN0.4)；
[0067](5)针对 hsa-miR-1825 基因的探针:5’-GGAGAGGAGGGCACTGGA-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0068](6)针对hsa-miR-760基因的探针:5’-TCCCCACAGACCCAGAGCCG-3’(SEQ ID N0.6)；
[0069](7)针对 hsa-miR-135b 基因的探针:5’-TCACATAGGAATGAAAAGCCATA-3’ (SEQ IDN0.7)；
[0070](8)针对 hsa-miR-139 基因的探针:5’ -ACTCCAACAGGGCCGCGTCTCCA-3’ (SEQ IDN0.8)；
[0071](9)针对 hsa-miR-1539 基因的探针:5’ -GGCATCTGGGACGCGCAGGA-3’ (SEQ IDN0.9)；
[0072](10)针对hsa-miR-1281 基因的探针:5’-GGGAGAGGAGGAGGCGA-3’(SEQ ID N0.10)；
[0073](11)针对 hsa-miR-129 基因的探针:5 ’ -GCAAGCCCAGACCGCAAAAAG-3 ’ (SEQ IDN0.11)；
[0074](12)针对 hsa-miR-1267 基因的探针:5’ -TGGGGATTACACTTCAACAGG-3’ ；(SEQ IDN0.12)；
[0075](13)针对 hsa-miR-362 基因的探针:5’ -TGAATCCTTGAATAGGTGTGTT-3’ (SEQ IDN0.13)；
[0076](14)针对 hsa-miR-766 基因的探针:5’ -AAGACCAGCACCAATTCCTCCT-3’ (SEQ IDN0.14)；
[0077](15)针对 hsa-miR-933 基因的探针:5’ -GGGAGAGGTCTCCCTGCGCACA-3’ (SEQ IDN0.15)。
[0078]需要说明的是hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因为上调基因，所述 hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因为下调基因。
[0079]用上述设计好的探针序列合成荧光素标记探针，本实施中通过 申请人:自行合成而得到该批荧光探针(生产批次`为B10SEEN20131217PR0BE)，当然荧光探针也可以在设计好相应序列后委托其他商业生物公司合成。
[0080]实施例2:反应试剂的制备。
[0081]FISH试剂盒中所用的FISH探针组合物制成溶液，该溶液是通过将FISH探针溶解在2x SSC缓冲液中得到，探针浓度为5ng/ μ 1，所述2 X SSC缓冲液是以氯化钠8.8g，柠檬酸钠4.4g，去离子水400ml配制而成。
[0082]另外，FISH试剂盒中还包括5mg/ml的4’，6_ 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染液300 μ I。
[0083]实施例3 =FISH检测食道癌患者唾液样品中与食管癌相关miRNA基因表达阳性的实验。
[0084]按照如下步骤进行试验:
[0085]包括如下步骤:
[0086]1、将待检测唾液样品固定在防脱落载玻片上，对玻片上的唾液样品进行预处理。具体操作如下:
[0087]1.1、将新鲜收集到的唾液1500rpm离心8min。
[0088]1.2、去上清，加入5ml0.075M kcl低渗液。混匀，后放入37°C水浴30min。(作用:利用渗透压差使细胞膜破裂，细胞核吸水膨胀。利于探针的杂交。)
[0089]1.3、加入2ml固定液预固定，(甲醇:冰乙酸=3:1)，混合均匀后1500rpm离心Smin0 (固定液中主要利用冰乙酸和甲醇的小分子性，有极强的细胞穿透能力，在瞬间杀死细胞，使细胞固定在低渗后的膨胀状态，保证细胞中需要检测的物质不被破坏。)
[0090]1.4、去上清,加入5ml固定液固定,混合均匀后1500rpm离心8min。去上清,加入5ml固定液，混匀后于_20°C保存备用。
[0091]1.5、取出预固定好的唾液标本，1500rpm离心8min。去上清,加适量固定液(IOml的唾液样本，根据细胞的多少，一般留IML左右的固定液)。
[0092]1.6、吹打混匀后吸取少量细胞固定液滴片(滴片前一定要将细胞吹打散开，滴片时保证细胞均匀散开，不要太密集，也要保证有足够计数的细胞)于3张12圆孔防脱落载玻片上。自然晾干，56°C烤片30min。(防止掉片)
[0093]1.7、将上步所得玻片置于37°〇预热的2\55(:溶液中浸泡101^11。(洗涤玻片，增加细胞核的通透性。
[0094]1.8、蛋白酶1(于551:消化5-101^11。(每片组织是10 μ I左右)
[0095]1.9、玻片于2 X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ；
[0096]1.10、将玻片一次置于70%、95%乙醇溶液中各2min，进行梯度脱水，自然晾干玻片。
[0097]2、分别将FISH探针滴加于载玻片圆孔中的样品处，每个探针加2个复孔，使探针待测样品进行变性杂交。具体操作如下:
[0098]2.1、2X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ；
[0099]2.2、梯度脱水:将玻片一次置于70%、95%乙醇中各2min，自然晾干玻片。
[0100]2.3、分别将15种探针滴加于载玻片圆孔中的样品处，每个样品孔加10 μ I探针，每个探针加2个复孔，使探针待测样品进行变性杂交，加盖盖玻片，封片。
[0101]2.4、杂交仪上73°C变性5min，37°C杂交过夜。
`[0102]3、杂交后，对玻片进行洗涤。具体操作如下:
[0103]3.1、去掉封片胶和盖玻片，于46°C(46-48°C)水浴2XSSC溶液中2次，每次5min;
[0104]3.2、将玻片置于 46°C 0.1%ΝΡ_40/2X SSC 中，晃动 l_3S，5min 后取出;
[0105]3.3、70%、95%乙醇中脱水各2min，甩干，自然干燥。
[0106]4、使用复染液对玻片上的杂交区域进行复染。向杂交区加入151110么?1，盖上大盖玻片，盖上盖玻片，暗处放置10-20min。
[0107]5、使用荧光显微镜观察玻片的杂交区域，试验结果如图1-3所示。
[0108]结果分析:结果分析:从图1和图2可见，在图1A-图10的实验结果显示，与食管癌相关miRNA基因主要表达于细胞质。相对于正常组别而言，与食管癌相关miRNA基因在食道癌患者唾液样品中高表达，而阴性对照实验中，未检测出绿色荧光。说明本发明的上调基因探针可用于检测唾液样品中与食管癌相关miRNA基因的表达情况。同时用经生物信息学分析获得的在食管癌中下调的microRNA基因探针对样品进行荧光原位杂交分析，结果与预测的相符合，这些基因在食管癌样品中表达量低。因此采用上调基因探针与下调基因探针相结合对样品进行原位杂交分析更为准确、可靠；同时使用与食管癌相关miRNA基因荧光探针进行唾液样品的FISH实验可达到食道癌的筛查与初诊效果。另外，通过测序和业界其他常用于检测与食管癌相关miRNA基因表达情况的方法验证发现，上述实验结果均为准确，足见本发明试剂盒在检测与食管癌相关miRNA基因以及食道癌的筛查中的准确性。
[0109]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【权利要求】
1.一种用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH探针组合物，其特征在于，该探针组合物中包含有用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH探针。
2.根据权利要求1所述的FISH探针组合物，其特征在于，所述与食管癌相关miRNA基因至少包含以下基因中的一种: hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因、hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129 基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因。
3.根据权利要求2所述的FISH探针组合物，其特征在于，所述hsa-miR-144基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因为上调基因，所述 hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129 基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766基因、hsa-miR-933基因为下调基因。
4.根据权利要求2所述的FISH探针组合物，其特征在于，所述FISH探针为以下核酸探针中的至少一种: (1)针对hsa-miR-144基因的核苷酸序列如SEQID N0.1所示的核酸探针:，5’ -CTTACAGTATATGATGATATCC-3’ ； (2)针对hsa-miR-1180基因的核苷酸序列如SEQID N0.2所示的核酸探针:，5’ -TATTCCCGGCCGGGTGGGTCC-3’ ； (3)针对hsa-miR-196b基因的核苷酸序列如SEQID N0.3所示的核酸探针:，5’ -CCCAACAACAGGAAACTACCTA-3’ ； (4)针对hsa-miR-149基因的核苷酸序列如SEQID N0.4所示的核酸探针:，5， -GGGAGTGAAGACACGGAGCCAGA-3，； (5)针对hsa-miR-1825基因的核苷酸序列如SEQID N0.5所示的核酸探针:，5， -GGAGAGGAGGGCACTGGA-3，； (6)针对hsa-miR-760基因的核苷酸序列如SEQID N0.6所示的核酸探针:，5， -TCCCCACAGACCCAGAGCCG-3，； (7)针对hsa-miR-135b基因的核苷酸序列如SEQID N0.7所示的核酸探针:，5， -TCACATAGGAATGAAAAGCCATA-3，； (8)针对hsa-miR-139基因的核苷酸序列如SEQID N0.8所示的核酸探针:，5’ -ACTCCAACAGGGCCGCGTCTCCA-3’ ； (9)针对hsa-miR-1539基因的核苷酸序列如SEQID N0.9所示的核酸探针:，5’ -GGCATCTGGGACGCGCAGGA-3’ ； (10)针对hsa-miR-1281基因的核苷酸序列如SEQID N0.10所示的核酸探针:，5， -GGGAGAGGAGGAGGCGA-3，； (11)针对hsa-miR-129基因 的核苷酸序列如SEQID N0.11所示的核酸探针:，5， -GCAAGCCCAGACCGCAAAAAG-3，； (12)针对hsa-miR-1267基因的核苷酸序列如SEQID N0.12所示的核酸探针:，5， -TGGGGATTACACTTCAACAGG-3，；(13)针对hsa-miR-362基因的核苷酸序列如SEQID N0.13所示的核酸探针:5’ -TGAATCCTTGAATAGGTGTGTT-3’ ； (14)针对hsa-miR-766基因的核苷酸序列如SEQID N0.14所示的核酸探针:5， -AAGACCAGCACCAATTCCTCCT-3，； (15)针对hsa-miR-933基因的核苷酸序列如SEQID N0.15所示的核酸探针:5’ -GGGAGAGGTCTCCCTGCGCACA-3’。
5.根据权利要求4所述的FISH探针组合物，其特征在于，所述FISH探针为核苷酸序列如SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.1所示的核酸探针的组合。
6.一种用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH试剂盒，其特征在于，所述FISH试剂盒中包含如权利要求1-5中所述的FISH探针组合物。
7.根据权利要求6所述的FISH试剂盒，其特征在于，所述FISH探针组合物制成溶液，该溶液是通过将FISH探针溶解在2x SSC缓冲液中得到，探针浓度为5叩/^1，所述2父55〇缓冲液是以氯化钠8.8g，柠檬酸钠4.4g，去离子水400ml配制而成。
8.根据权利要求6所述的FISH试剂盒，其特征在于，还包括4’，6-二脒基-2-苯基吲哚复染液。
9.一种如权利要求6-8所述的用于检测与食管癌相关miRNA基因的FISH试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将待检测唾液样品固定在防脱落载玻片上，对玻片上的唾液样品进行预处理； (2)分别将FISH探针滴加于载玻片圆孔中的样品处，每个探针加2个复孔，使探针待测样品进行变性杂交； (3)杂交后，对玻片进行洗涤； (4)使用复染液对玻片上的杂交区域进行复染； (5)使用荧光显微镜观察玻片的杂交区域。
10.根据根据权利要求9所述的FISH试剂盒的使用方法，其特征在于，该FISH试剂盒的使用方法的相应步骤中包含如下(I) - (4)项中的任意一项或者多项的具体操作方式: (I)步骤(1)中将待检测唾液样品固定和预处理具体为: ①将新鲜收集到的唾液1500rpm离心8min； ②去上清，加入5ml0.075M kcl低渗液，混匀，后放入37°C水浴30min ； ③加入2ml固定液预固定,混合均匀后1500rpm离心8min;该固定液甲醇:冰乙酸=3:1混合溶液 ④去上清，加入5ml固定液固定,混合均匀后1500rpm离心8min,去上清,加入5ml固定液，混匀后于_20°C保存备用； ⑤取出预固定好的唾液标本，1500rpm离心8min,去上清,加适量固定液； ⑥吹打混匀后吸取少量细胞固定液滴片于防脱落载玻片上，自然晾干，56°C烤片30min，防止掉片，滴片前一定要将细胞吹打散开，滴片时保证细胞均匀散开，防止细胞太密集，也要保证有足够计数的细胞； ⑦将上步所得玻片置于37°C预热的2XSSC溶液中浸泡lOmin，洗涤玻片，增加细胞核的通透性； ⑧蛋白酶K于55°C消化5-10min；⑨玻片于2X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ； ⑩将玻片一次置于70%、95%乙醇溶液中各2min，进行梯度脱水，自然晾干玻片； (2)步骤(2)将待探针与玻片上的待测样品进行变性杂交具体为:①分别取15种探针试剂Iy 1，2XSSC缓冲液9μ 1，混合得到15种不同的探针混合液将上述15种探针混合液分别滴加于样品处，每个探针加样2个复孔，盖上盖玻片，于杂交仪上73°C变性5min，`37 °C杂交过夜； (3)步骤(3)玻片洗涤具体为:①去掉封片胶和盖玻片，于46-48°C水浴2X SSC溶液中2次，每次5min ;②将玻片置于46°C 0.1%ΝΡ_40/2 X SSC中，晃动1_3S，5min后取出；@70%、`95%乙醇中脱水各2min,甩干，自然干燥； (4)步骤(3)复染具体为:向杂交区加入15μ IDAPI，盖上大盖玻片，盖上盖玻片，暗处放置 10-20min。`
【文档编号】C12N15/11GK103866040SQ201410136226
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】吴伟东, 王晓香, 周剑, 董先辉, 刘雪媚 申请人:广州伯信生物科技有限公司