建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的方法

建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的方法
【专利摘要】本发明涉及一种建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的方法，属于动物细胞（组织）工程领域。胶原酶消化成年大鼠胰腺组织，手工挑取胰岛，RPMI1640有血清培养，大鼠胰岛原代上皮样干细胞贴壁生长，克隆环筛选，上皮样干细胞纯化，胰蛋白酶消化液消化传代，建立细胞系；采用该方法建立的一例大鼠胰岛上皮样干细胞系的特征是细胞贴壁呈多角形上皮样，克隆性生长，是正常的二倍体细胞，在蛋白水平表达八聚体转录因子4、配对基因盒4、配对基因盒6、神经源性因子3和巢蛋白，具有多分化潜能，无致瘤性。
【专利说明】建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及建立人类和其它哺乳动物胰岛干细胞系的方法，特别涉及一种建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的方法，属于动物细胞(组织)工程领域。
【背景技术】
[0002]糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是危害人类健康的重大疾病之一，据统计目前全世界糖尿病患者已达3.46亿(Am J Stem Cells.2012，I (3): 196-204.)，而传统的药物及胰岛素替代疗法却不能从根本上医治该病。近十年来，随着移植技术的发展，胰岛移植治疗糖尿病取得了一定的疗效(N Engl J Med 2000，343 (4):230-238.Diabetes.2005, 54(7):2060-2069.Am J Transplant.2008, 8(11):2463-2470.1mmuneNetw.2013, 13(6):235-239.)。但是，由于供体来源短缺，胰岛移植治疗糖尿病技术的应用受到制约。胰岛干细胞是存在于胰腺内分泌组织胰岛中的成体干细胞，能自我更新并具有多分化潜能。体外分离克隆胰岛干细胞，诱导其分化形成功能性胰岛，并移植治疗糖尿病是有效解决供体短缺的途径之一。目前，建立胰岛干细胞系，研究胰岛干细胞分化形成功能性胰岛移植治疗糖尿病已成为焦点。国外，Zulewski等(Diabetes.2001，50(3):521-533.Endocrinology.2002, 143(8):3152-3161.Stem Cells.2004，22 (7): 1134-1141.)首先报道胶原酶消化大鼠或成人胰腺组织分离获得单个细胞和胰岛，RPMI1640+10%FBS+lmmol/LNaHC03+71.5umol β -巯基乙醇+抗生素培养液悬浮培养，96h后,挑出悬浮胰岛,培养液中再添加20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF贴壁培养，上皮样胰岛干细胞克隆性生长。其中，大鼠胰岛干细胞8.5个月扩增了 10倍，人胰岛干细胞8个月扩增了 7倍。免疫化学反应检测胰岛干细胞表达巢蛋白(nestin),不表达insulin、glucagon、somatostatin和CK19。体外定向诱导，胰岛干细胞分化形成胰腺导管细胞，表达CK19 ;分化形成胰岛细胞，表达insulin、glucagon等；分化形成肝脏细胞,表达α-甲胎蛋白；分化形成神经细胞,表达神经细胞特异性粘附分子。移植在小鼠肝脏内，人源性胰岛干细胞分化形成人肝脏细胞。Maria-Engler等(J Endocrinol.2004, 183(3):455-467.)胶原酶HI灌注消化成年人胰腺主胰管，分离获得细胞和细胞团，密度梯度离心，双硫腙(dithizon，DTZ)活性染色检测，筛选出直径大于150 μ m胰岛，CMRL1066+10%FCS培养。共聚焦荧光显微观察和RT-PCR检测，培养24h，胰岛细胞团中仅有少量细胞表达nestin ;培养60d，nestin+表达量显著增多。采用含10%FBS培养液培养nestin+细胞30d，表达insulin ;而采用含1%FBS培养液培养nestin+细胞30d,则表达insulin、glucagon和somatostatin。因此，作者认为体外长期培养，人胰岛中的 nestin+细胞具有干细胞特性。Humphrey 等(Diabetes.2003, 52(10):2519-2525.)胶原酶消化人胎儿早期胰腺组织，获得胰岛细胞团，悬浮培养4d，置入铺有HTB-9的培养皿中，RPMIl640+10%FBS+10ng/mL HGF培养液贴壁培养，上皮样细胞扩增形成单层。构建nestin-GFP质粒，腺病毒转染，418筛选，纯化出nestin+细胞。RT-PCR检测，nestin+细胞共表达波形蛋白。采用烟酰胺、HGF等体外定向诱导，nestin+细胞却不能分化形成表达Pdxl、insulin的β细胞，移植在无胸腺小鼠体内也不能分化形成功能性β细胞，分泌insulin。这表明nestin不是β细胞祖细胞的特异性标记物。Sugiyama等(Proc NatlAcad Sci USA.2007, 104(I): 175-180.)胰蛋白酶消化小鼠胎儿胰腺组织，分离获得单个细胞，流式细胞术分选，获得共表达Ngn3、CD 133和CD45f的胰岛干细胞。体外定向诱导，胰岛干细胞分化形成 β 细胞，分泌 insulin。Ta 等(Stem Cells.2006, 24(7): 1738-1749.)的研究表明在培养液中添加成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth facter,bFGF)、白细胞抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)和骨形态发生蛋白4 (bonemorphogenetic protein-4, BMP4),均能促进成年小鼠胰岛干细胞扩增。Jin等(Proc NatlAcad Sci USA.2013，110 (10): 3907-3912.)胶原酶B+DNase消化液消化成年小鼠胰腺组织获得单个细胞，CD133标记，流式细胞术分选，DMEM++5%FCS+0.lnmol/Lexendin4+10ng/mLactivin β +lng/mLVEGF+100 μ g/mLLN+1%MC+1OmmoI/L 尼克酰胺 +50% 条件培养基培养，3w后，细胞克隆形成细胞团，RT-PCR检测克隆细胞表达⑶133。培养液中添加RSP01定向诱导，CD133+细胞分化形成表达Ngn3的胰岛干细胞和腺泡细胞。流式细胞术进一步分选出Ngn3+胰岛干细胞,体外定向诱导,分化形成β细胞。葡萄糖刺激，分泌insulin。国内，效梅等(中国科学C辑:生命科学.2008，38(8):699-707.Science in China Series C: LifeScience.2008, 51 (9): 779-788.分子细胞生物学报.2008, 41 (6):450-457.分子细胞生物学报.2008，4U6):457-464.解剖学报.2009，40(2):55-58.中国兽医学报.2009，29 (2): 191-195.)报道IV型胶原酶消化人胎儿胰腺组织20~40min，收集单个细胞和细胞团，低糖DMEM+3.7g/LNaHC03+10%FBS+0.08g/L青霉素+0.lg/L链霉素培养液培养。当原代上皮样胰腺干细胞长出后，0.25%胰蛋白酶+0.0496EDTA消化液消化，传代。在传代中逐渐消除成纤维样细胞和其他细胞，纯化上皮样胰腺干细胞。采用克隆环筛选出典型的单克隆人胰腺干细胞，培养液中添加10ng/mLEGF扩增培养，建立人胎儿胰腺干细胞系。免疫化学反应、RT-PCR检测该干细胞表达Pdxl、glucagon、nestin及CK19蛋白，不表达insulin、Q)34、⑶44及⑶45。β-巯基乙醇诱导，分化形成神经细胞，表达NF蛋白。烟酰胺诱导，分化形成DTZ染色阳性，分泌insulin和C肽的功能性类胰岛。将单克隆人胰腺干细胞体外诱导胰岛移植在STZ制备的糖尿病大鼠肾囊内，能降低糖尿病大鼠血糖水平，延长寿命。阎志风等(中国组织工程研究与临床.2008, 12(3): 485-489.)无菌取人胎儿胰腺组织，0.5g/L V型胶原酶消化，分离得到胰岛样细胞团，RPMI1640+ 0.l%FBS+lmmol/L丙酮酸钠+lmmol/L谷氨酰胺+71.5 μ mo I/L β -巯基乙醇+100U/mL青霉素+100mg/L链霉素培养液悬浮培养。72h后，挑出悬浮胰岛样细胞团贴壁培养，上皮样干细胞克隆性生长至单层，传代。生长曲线显示人胎儿胰岛上皮样干细胞传代第3d进入对数生长期，第6d进入平台期，细胞生长曲线呈“S”形。荧光免疫反应检测人胎儿胰岛原代上皮样干细胞表达PCNA、PdxU nestin、CK19、insulin、glucagon和0)29,传代后，胰岛干细胞则不表达insulin、glucagon和0)29。白日星等(中国普通外科杂志.2004, 13(10):746-749)胶原酶消化新生大鼠胰腺组织，组织碎片采用无血清RPMI1640培养液培养。培养36h，nestin+细胞贴壁生长。添加bFGF、EGF、N2,nestin+细胞快速增长。培养18~24d, nestin+细胞分化形成类胰岛样细胞团,胰岛素释放实验检测，分泌insulin。冯若鹏等(中国农业科学.2007, (3).582-587.农业生物技术学报，2011.19(1): 9-17.)胶原酶 消化胎猪胰腺组织分离获得胰岛，贴壁培养，胰岛干细胞快速增殖，传18代，建系。免疫化学反应显示胰岛干细胞表达CK19和α-actin，不表达nestin。无血清诱导培养,2w后,胰岛干细胞分化形成DTZ染色阳性的胰岛样细胞团,表达insulin和Glut2等胰岛素分泌细胞功能相关的蛋白。葡萄糖刺激，分泌insulin和C-肽。将诱导细胞移植到糖尿病裸鼠腹腔内，可缓解其高血糖状况。目前，国内尚无建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的报道，建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的方法还不成熟。本发明建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的方法，将为进一步建立人类和其它哺乳动物胰岛干细胞系及研究其生物学特性提供依据，这对于研究人类和其它哺乳动物胰腺发育、糖尿病的产生以及再造胰岛微小器官治疗糖尿病具有重要的意义。

【发明内容】

[0003]本发明的目的是提供建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的方法，为进一步建立人类和其它哺乳动物胰岛干细胞系及研究其生物学特性提供依据，这对于研究人类和哺乳动物胰腺发育、糖尿病的产生以及再造胰岛微小器官移植治疗糖尿病具有重要的意义。
[0004]为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是:
建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的方法，包括如下步骤:1.大鼠胰岛原代上皮样干细胞分离培养无菌取大鼠胰腺组织，剪碎至Imm3，0.1% IV型胶原酶37°C消化25min ；DTZ染色，手工挑取DTZ着色单个胰岛(图1 )，置于铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS培养液培养，大鼠胰岛原代上皮样干细胞贴壁生长(图2)；
2.大鼠胰岛上皮样干细胞纯化
打开培养皿，将底部沾有凡士林的克隆环置于大鼠胰岛上皮样干细胞区域内，在克隆环孔中加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液，室温消化3min ;收集克隆环中的细胞，接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS培养液培养，纯化的大鼠胰岛上皮样干细胞克隆性生长(图3); 生长至80%融合时，呈“铺路石”样(图4)；
3.大鼠胰岛上皮样干细胞传代培养
当纯化的大鼠胰岛上皮样干细胞生长至80%融合时，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液室温消化3min，收集的细胞接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS+ IOng/mLbFGF细胞培养液扩增培养；1例大鼠胰岛上皮样干细胞已传50代；
4.大鼠胰岛上皮样干细胞冷冻保存
冷冻:80%RPMI1640+10%DMS0+10%NBS细胞冷冻液稀释大鼠胰岛上皮样干细胞至IX IO6个/mL，分装于冷冻管，4°C平衡30min，液氮面上悬浮2h，投入液氮长期冷冻保存；
解冻:从液氮罐中取出大鼠胰岛上皮样干细胞冷冻管，迅速投入37°C水域中解冻，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培养液贴壁培养；台盼蓝染色检测，大鼠胰岛上皮样干细胞解冻成活率约为93% ；
5.大鼠胰岛上皮样干细胞形态特征
H.E染色，大鼠胰岛上皮样干细胞完全贴壁后，呈多角形上皮样(图5) ；Giemsa染色，细胞核为椭圆形，核仁多为单核仁或双核仁(图6)；
6.大鼠胰岛上皮样干细胞生长特性
大鼠胰岛上皮样干细胞克隆性生长，当细胞生长至80%融合时，呈“铺路石”样；生长曲线表明细胞接种第Id生长缓慢，第2~4d进入对数生长期，第5~6d为平台期，第7d增殖能力下降(图7);
7.大鼠胰岛上皮样干细胞染色体数目染色体标本显示大鼠胰岛上皮样干细胞是正常的二倍体细胞，染色体数目2n=42 (图
8)；
8.大鼠胰岛上皮样干细胞表达特征
流式细胞术检测和荧光免疫化学反应显示大鼠胰岛上皮样干细胞在蛋白水平表达八聚体转录因子 4 (Octamer-binding transcription factor 4, 0ct4,图 9)、配对基因盒4 (Paired box 4, Pax4,图 10)、配对基因盒 6 (Paired box 6, Pax6,图 11)、神经源性因子 3 (Neurogenin 3, Ngn3,图 13)和巢蛋白(nestin,图 14),不表达 Pdxl、MafA、Ptfla、CK19、NeuroD2、PCNA、Nanog、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin和secretin ;图12是流式细胞术检测阴性对照，图15是突光免疫化学反应小鼠胎儿成纤维细胞阴性对照；
9.大鼠胰岛上皮样干细胞分化潜能
大鼠胰岛上皮样干细胞具有多分化潜能，体外定向诱导，分化形成神经细胞、脂肪细胞和成骨细胞；
9.1分化形成神经细胞:采用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠脑组织提取液体外定向诱导，诱导6d，约有50%大鼠胰岛多角形上皮样干细胞分化形成有突触的神经细胞(图16)，荧光免疫化学反应表达神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)(图17);
9.2分化形成脂肪细胞:采用DMEM+10%NBS+1 umo I /L地塞米松+lug/Linsulin+
0.5mmol/LIBMX诱导液体外定向诱导，诱导7d，大鼠胰岛多角形上皮样干细胞内出现小而少的脂滴；14d，细胞内脂滴增多，大小均匀；21d，约80%多角形上皮样干细胞变为圆形细胞，细胞内脂滴继续增多，大小不一 ；27d，圆形细胞内脂滴明显增多、增大，油红O染色阳性(图 18)；
9.3分化形成成骨细胞:采用RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+10mmol/L β -磷酸甘油+50ug/mL抗坏血酸盐诱导液体外定向诱导，诱导7d，约30%大鼠胰岛多角形上皮样干细胞出现皱缩；14d，皱缩细胞增至50%，部分细胞死亡；21d，细胞分泌增多，开始出现矿化结节；28d，矿化结节茜素红染色阳性(图19)，Vonkossa染色矿化结节呈现黑色(图20)；
10.大鼠胰岛上皮样干细胞致瘤性
大鼠胰岛上皮样干细胞无致瘤性；大鼠胰岛上皮样干细胞接种在裸鼠背部皮下30d，剖解，眼观未见瘤状物。
[0005]建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的方法建立的大鼠胰导上皮样干细胞系保藏号为C201460，保藏日期2014年4月2日，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，地址:武汉大学中国典型培养物保藏中心。
[0006]本发明的有益效果是:建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的方法，将为进一步建立人类和其它哺乳动物胰岛干细胞系及研究其生物学特性提供依据，这对于研究人类和其它哺乳动物胰腺发育、糖尿病的产生以及再造胰岛微小器官治疗糖尿病具有重要的意义。
【专利附图】

【附图说明】
[0007]本说明书共有20幅附图，其中:
图1大鼠胰岛DTZ染色阳性(X100);
图2大鼠胰岛原代上皮样干细胞贴壁生长(X50);图3纯化的大鼠胰岛上皮样干细胞克隆性生长(XlOO)；
图4大鼠胰岛上皮样干细胞生长至80%融合，呈“铺路石”样(X100)；
图5大鼠胰岛上皮样干细胞H.E染色形态特征(X 200);
图6大鼠胰岛上皮样干细胞Giemsa染色形态特征(X 400)；
图7大鼠胰岛上皮样干细胞生长曲线；
图8大鼠胰岛上皮样干细胞染色体数目2n=42 ；
图9流式细胞术检测，大鼠胰岛上皮样干细胞表达0ct4 ；
图10流式细胞术检测，大鼠胰岛上皮样干细胞表达Pax4 ;
图11流式细胞术检测，大鼠胰岛上皮样干细胞表达Pax6 ；
图12流式细胞术检测阴性对照；
图13荧光免疫化学反应，大鼠胰岛上皮样干细胞表达Ngn3 (X400)；
图14荧光免疫化学反应，大鼠胰岛上皮样干细胞表达nestin (X400)；
图15荧光免疫化学反应小鼠胎儿成纤维细胞阴性对照(X 200)；
图16体外定向诱导，大鼠胰岛上皮样干细胞分化形成有突触的神经细胞(X200)；
图17荧光免疫化学反应，大鼠胰岛上皮样干细胞分化形成的神经细胞表达NSE(X200)；
图18体外定向诱导，大鼠胰岛上皮样干细胞分化形成脂肪细胞，油红O染色阳性(X200)；
图19体外定向诱导，大鼠胰岛上皮样干细胞分化形成成骨细胞，茜素红染色阳性(X100)；
图20大鼠胰岛上皮样干细胞分化形成成骨细胞，Vonkossa染色矿化结节呈现黑色(X100)。
【具体实施方式】
[0008]下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
[0009]实施例1
1.大鼠胰岛原代上皮样干细胞分离培养
无菌取SD成年大鼠胰腺组织，剪碎至Imm3，0.1% IV型胶原酶37 V消化25min，RPMI1640+10%NBS培养液终止消化。100目孔径滤纱过滤，离心(lOOOrpm，5min)。DTZ染色(图1)，在显微镜下手工挑取DTZ着色单个胰岛，放入铺有0.1%明胶的培养皿中，加RPMI1640+10%NBS培养液，置于37°C、5%C02、饱和湿度培养箱中培养。培养3~4d，大鼠胰岛原代上皮样干细胞贴壁生长(图2)。 [0010]2.大鼠胰岛上皮样干细胞纯化
打开培养皿，将底部沾有凡士林的克隆环置于胰岛上皮样干细胞区域内。在克隆环孔中加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液，室温消化3min，RPMI1640+10%NBS培养液终止消化。收集克隆环中的细胞悬液，离心(lOOOrpm，5min)。RPMI1640+10%NBS培养液重悬细胞，接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，继续培养。3~5d，纯化的大鼠胰岛上皮样干细胞克隆性生长(图3)。生长至80%融合时，呈“铺路石”样(图4)。[0011]3.大鼠胰岛上皮样干细胞传代培养
当纯化的大鼠胰岛上皮样干细胞生长至80%融合，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液室温消化3min，RPMI1640+10%NBS培养液终止消化，离心(lOOOrpm，5min)。收集的细胞按IX IO6个/mL细胞密度接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF细胞培养液扩增培养。
[0012]4.大鼠胰岛上皮样干细胞冷冻保存
冷冻:大鼠胰岛上皮样干细胞生长至80%融合，PBS (_)清洗，0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化液消化，RPMI1640+10%NBS培养液终止消化，离心(lOOOrpm, 5min)。80%RPMI1640+10%DMS0+10%NBS细胞冷冻液稀释细胞至I X IO6个/mL，分装于冷冻管。4°C平衡30min，液氮面上悬浮2h，投入液氮长期冷冻保存。
[0013]解冻:从液氮罐中取出大鼠胰岛上皮样干细胞冷冻管，迅速投入37°C水域中解冻，RPMI1640+10%NBS培养液清洗解冻细胞2~3遍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培养液贴壁培养。取少量细胞，台盼蓝染色检测，细胞解冻成活率约为93%。
[0014]采用以上分离、纯化、传代培养及冷冻保存技术，已获得大鼠胰岛上皮样干细胞。其中，I例大鼠胰岛上皮样干细胞系已传50代，冷冻保存50管细胞，约0.5 X IO8个细胞。
[0015]5.大鼠胰岛上皮样干细胞形态特征
H.Ε染色:大鼠胰岛上皮样干细胞完全贴壁后，呈多角形上皮样(图5)。染色方法参照司徒镇强，吴军正.细胞培养[Μ].世界图书出版公司.2007.略；
Giemsa染色:大鼠胰岛上皮样干细胞核为椭圆形，核仁多为单核仁或双核仁(图6)。染色方法参照R.1.弗雷谢尼.动物细胞培养一基本技术指南[Μ].科学出版社.2008.略；
6.大鼠胰岛上皮样干细胞生长特性
大鼠胰岛上皮样干细胞克隆性生长。生长曲线表明细胞接种第Id生长缓慢，第2~4d进入对数生长期，第5~6d为平台期，第7 d增殖能力下降(图7)。
[0016]生长曲线测定方法:解冻复活第20、30、40代大鼠胰岛上皮样干细胞，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培养液分别稀释细胞至I X IO4个/mL。取96孔板7个，每个板上分别接种3种不同代数的细胞，每代设6个孔，每孔加100 μ L细胞悬液，并设阴性对照(基础培养液，无细胞)，置于37°C、5%C02、饱和湿度培养箱中培养。此时记为0d。每24h取出一块培养板，采用CCK-8法测定细胞吸光度值(0D值)，共测7d。测定时，每孔加10μ LCCK-8后，置于37°C、5%C02、饱和湿度培养箱中作用2h，在酶标仪上测定450nm处OD值。以时间(d)为横坐标，吸光度值(OD)为纵坐标，绘制大鼠胰岛上皮样干细胞生长曲线图。
[0017]7.大鼠胰岛上皮样干细胞染色体数目
染色体标本显示大鼠胰岛上皮样干细胞是正常的二倍体细胞，染色体数目2n=42 (图8)。
[0018]大鼠胰岛上皮样干细胞按I父105个/ HiL细胞密度接种于铺有0.1%明胶的培养皿中，贴壁培养。扩增至80%融合时，加入终浓度为0.1 μ g/mL秋水仙素，继续培养5h，使多数细胞染色体停于中期分裂相。0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液室温消化3min，RPMI1640+10%NBS培养液终止消化，离心。弃上清，加入0.4%KC1，并置于37°C水域中，低渗30min，离心。弃上清，加甲醇-冰醋酸固定液(甲醇:冰醋酸=3:1，现用现配)，混匀，静置固定20min，离心。如此反复固定2~3次。弃上清，加0.5mL固定液，混匀，制成染色体悬液。取冰冻载玻片，于约80cm高度滴片,火焰干燥。滴加Giemsa染色液,染色lOmin。普通生物学显微镜下观察染色体标本，照相。
[0019]8.大鼠胰岛上皮样干细胞表达特征
流式细胞术检测和荧光免疫化学反应显示大鼠胰岛上皮样干细胞在蛋白水平表达八聚体转录因子 4 (Octamer-binding transcription factor 4, 0ct4,图 9)、配对基因盒4 (Paired box 4, Pax4,图 10)、配对基因盒 6 (Paired box 6, Pax6,图 11)、神经源性因子 3 (Neurogenin 3, Ngn3,图 13)和巢蛋白(nestin,图 14),不表达 Pdxl、MafA、Ptfla、CK19、NeuroD2、PCNA、Nanog、Sox2、CDl 17、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin和secretin。图12是流式细胞术检测阴性对照，图15是突光免疫化学反应小鼠胎儿成纤维细胞阴性对照。
[0020]8.1流式细胞术检测
根据所购特异性抗体是否带荧光标记，采用直接免疫荧光标记法或间接免疫荧光标记法检测。[0021]8.1.1直接免疫荧光标记法
直接免疫荧光标记法检测大鼠胰岛上皮样干细胞不表达MafA、PCNA、⑶117、⑶15、⑶34和 CD45。
[0022]PBS(-)洗涤大鼠胰岛上皮样干细胞2次，稀释细胞至I X IO6个/mL。取EP管7个，分别加入ImL细胞悬液，离心(lOOOrpm, 5min)。弃上清，分别加入200uL含1%BSA的PBS(-)稀释的荧光素标记抗体(0.25ug/100uL稀释的金黄地鼠抗小鼠MafA荧光抗体、5uL/100uL稀释的小鼠抗人PCNA荧光抗体、5uL/100uL稀释的小鼠抗人CD117荧光抗体、5uL/100uL稀释的小鼠抗人CD 15荧光抗体、5uL/IOOuL稀释的小鼠抗人CD34荧光抗体或5uL/IOOuL稀释的小鼠抗人⑶45突光抗体,均购自eBioscience公司)，阴性对照加PBS(-),混匀，4°C孵育30min,离心(lOOOrpm, 5min)。弃上清，PBS (-)洗漆细胞 2 次,离心(lOOOrpm, 5min),以除去未结合的多余抗体。每管分别加0.5mLPBS (-)重悬细胞，流式细胞仪(Accuri C6，BD，美国)检测阳性细胞比例。实验重复3次。
[0023]8.1.2间接免疫荧光标记法
间接免疫荧光标记法检测大鼠胰岛上皮样干细胞表达八聚体转录因子4 (0ct4)、配对基因盒 4 (Paired box 4, Pax4)和配对基因盒 6 (Paired box 6, Pax6)。
[0024]PBS (_)洗涤大鼠胰岛上皮样干细胞2次，稀释细胞至I X IO6个/mL。取EP管4个，分别加入ImL细胞悬液,离心(lOOOrpm, 5min)。弃上清，分别加入200uL含1%BSA的PBS (_)稀释的无荧光素标记的一抗(1:100稀释的兔抗人0ct4或1:500稀释的兔抗大鼠Pax6,购自Epitomics公司；1:50兔抗人Pax4,购自Abgent公司)，阴性对照加PBS(-),混匀，4°C孵育30min，离心(lOOOrpm，5min)。弃上清，PBS (-)洗涤细胞2次，离心(lOOOrpm，5min),以除去未结合的多余抗体。弃上清，加入200uL含I %BSA的PBS (_)稀释的荧光素标记二抗(1:100稀释的羊抗兔突光二抗,购自Epitomics公司)，阴性对照加PBS (-),混匀，4°C孵育30min，离心(lOOOrpm，5min)。弃上清，PBS (-)洗涤细胞2次，离心(lOOOrpm，5min),以除去未结合的多余抗体。每管分别加0.5mLPBS(_)重悬细胞,流式细胞仪(AccuriC6，BD，美国)检测阳性细胞比例。实验重复3次。
[0025]8.2突光免疫化学反应对于购买不到流式细胞术检测的抗体，则购买荧光免疫化学反应抗体检测。
[0026]荧光免疫化学反应显示大鼠胰岛上皮样干细胞表达神经源性因子3 (Neurogenin3, Ngn3)和巢蛋白(nestin),不表达 Pdxl、Ptfla、CK19、Nanog、NeuroD2、Sox2、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 及 secretin。[0027]在铺有0.1 %明胶的培养皿中放入盖玻片，大鼠胰岛上皮样干细胞按I父105个/mL细胞密度接种在放有盖玻片的培养皿中。当细胞生长至80%融合，4%多聚甲醛室温固定细胞爬片15min。PBS (-)洗涤细胞爬片2次后，l%Triton_X100穿孔30min，1%BSA封闭45min。洗掉多余封闭液，加含1%BSA的PBS (-)稀释的一抗(1: 100稀释的小鼠抗人Ngn3、3 μ g/mL稀释的小鼠抗人Ptfla、5 μ g/mL稀释的小鼠抗人ghrelin或1:100稀释的兔抗人secretin,均购自Abcam公司；1:300稀释的小鼠抗大鼠nestin,购自Novus公司；20yg/mL稀释的小鼠抗人Pdxl或20 μ g/mL稀释的小鼠抗人CK19,购自eBioscience公司；1:100稀释的兔抗人Nanog、1:300稀释的兔抗大鼠NeuroD2、1:100稀释的兔抗人Sox2或1:100稀释的兔抗人somatostatin,均购自Epitomics公司；1:500稀释的小鼠抗大鼠insulin或1:500稀释的兔抗大鼠glucagon，购自Boster公司；)，阴性对照加PBS(-)，4°C过夜。PBS(_)洗涤3次，每次3min。加含1%BSA的PBS (_)稀释的荧光二抗(1:1000稀释的羊抗小鼠突光二抗，购自Novu公司或1:100稀释的羊抗兔突光二抗,购自Epitomics公司)，阴性对照加PBS(-)，37°C孵育lh。PBS (_)洗涤3次，每次3min，甘油封片。荧光显微镜下观察，照相。阴性对照细胞为小鼠胎儿成纤维细胞。
[0028]9.大鼠胰岛上皮样干细胞分化潜能
大鼠胰岛上皮样干细胞具有多分化潜能，体外定向诱导，分化形成神经细胞、脂肪细胞和成骨细胞。
[0029]9.1分化形成神经细胞
分化形成神经细胞:采用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠脑组织提取液体外定向诱导，诱导6d，约有50%大鼠胰岛多角形上皮样干细胞分化形成有突触的神经细胞(图16)，荧光免疫化学反应表达神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)(图17)。
[0030]大鼠胰岛上皮样干细胞按I X IO5个/ mL细胞密度接种，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF培养液扩增培养。当细胞生长至80%融合时，换DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠脑组织提取液定向诱导培养，隔天换液。诱导6d，约有50%大鼠胰岛多角形上皮样干细胞分化形成有突触的神经细胞，荧光免疫化学反应表达NSE。
[0031]9.2分化形成脂肪细胞
分化形成脂肪细胞:采用 DMEM+10%NBS+lumol/L 地塞米松 +lug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX诱导液体外定向诱导，诱导7d，大鼠胰岛多角形上皮样干细胞内出现小而少的脂滴；14d，细胞内脂滴增多，大小均匀；21d，约80%多角形上皮样干细胞变为圆形细胞，细胞内脂滴继续增多，大小不一；27d，圆形细胞内脂滴明显增多、增大，油红O染色阳性(图18)。
[0032]大鼠胰岛上皮样干细胞按I X IO5个/ mL细胞密度接种，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF培养液扩增培养。当细胞生长至80%融合时，换DMEM+10%NBS+lumol/L地塞米松+lug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX诱导液定向诱导培养，隔天换液。诱导7d,大鼠胰岛多角形上皮样干细胞内出现小而少的脂滴；14d，细胞内脂滴增多，大小均匀；21d，约80%多角形上皮样干细胞变为圆形细胞，细胞内脂滴继续增多，大小不一 ；27d，圆形细胞内脂滴明显增多、增大,油红O染色阳性。
[0033]9.3分化形成成骨细胞
分化形成成骨细胞:采用RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+lOmmol/L0 -磷酸甘油+50ug/mL抗坏血酸盐诱导液体外定向诱导，诱导7d，约30%大鼠胰岛多角形上皮样干细胞出现皱缩；14d，皱缩细胞增至50%，部分细胞死亡；21d，细胞分泌增多，开始出现矿化结节；28d，矿化结节茜素红染色阳性(图19)，Vonkossa染色矿化结节呈现黑色(图20)。
[0034]大鼠胰岛上皮样干细胞按I X IO5个/ mL细胞密度接种，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF培养液扩增培养。当细胞生长至80%融合时，换RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+lOmmol/L0 -磷酸甘油+50ug/mL抗坏血酸盐诱导液定向诱导培养，隔天换液。诱导7d，约30%大鼠胰岛多角形上皮样干细胞出现明显的皱缩；14d，皱缩细胞增至50%，部分细胞死亡；21d，细胞分泌增多，开始出现矿化结节；28d，矿化结节茜素红染色阳性，Vonkossa染色矿化结节呈现黑色。
[0035]10.大鼠胰岛上皮样干细胞致瘤性
大鼠胰岛上皮样干细胞无致瘤性。大鼠胰岛上皮样干细胞接种在裸鼠背部皮下30d，解剖，眼观未见瘤状物。
[0036]在6只裸鼠背部皮下分别注射大鼠胰岛上皮样干细胞，剂量为I X IO6个/0.2mL/site, 3只裸鼠背部皮下注射0.2mL细胞培养液RPMI1640作为对照，正常饲养管理30d。结果，6只实验裸鼠和3只 对照裸鼠均存活至实验结束，解剖观察，均未见瘤状物。
【权利要求】
1.建立大鼠胰岛上皮样干细胞系的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)大鼠胰岛原代上皮样干细胞分离培养 无菌取大鼠胰腺组织，剪碎至Irnm3，胶原酶消化；DTZ染色，手工挑取DTZ着色单个胰岛，置于铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS培养液培养，大鼠胰岛原代上皮样干细胞贴壁生长； (2)大鼠胰岛上皮样干细胞纯化 打开培养皿，将底部沾有凡士林的克隆环置于胰岛上皮样干细胞区域内，在克隆环孔中消化；收集克隆环中的细胞，接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS培养液继续培养，纯化的大鼠胰岛上皮样干细胞克隆性生长；当细胞生长至80%融合时，呈“铺路石”样； (3)大鼠胰岛上皮样干细胞传代培养 当纯化的大鼠胰岛上皮样干细胞生长至80%融合，胰蛋白酶消化液消化；收集的细胞接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，细胞培养液扩增培养；1例大鼠胰岛上皮样干细胞已传50代； (4)大鼠胰岛上皮样干细胞冷冻保存 冷冻:细胞冷冻液稀释大鼠胰岛上皮样干细胞，分装于冷冻管，平衡，投入液氮长期冷冻保存； 解冻:从液氮罐中取出大鼠胰岛上皮样干细胞冷冻管，迅速投入37°C水域中解冻，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培养液贴壁培养；台盼蓝染色检测，大鼠胰岛上皮样干细胞成活率为93%。
2.根据权利要求1所述的建立大鼠胰导上皮样干细胞系的方法，其特征在于:步骤(1)所述的胶原酶消化是指加入0.1% IV型胶原酶，在37°C条件下，消化25min。
3.根据权利要求1所述的建立大鼠胰导上皮样干细胞系的方法，其特征在于:步骤(2)所述的消化是指加入0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA消化液，室温消化3min。
4.根据权利要求1所述的建立大鼠胰导上皮样干细胞系的方法，其特征在于:步骤(3)所述的细胞培养液是指RPMI1640+10%NBS+10ng/mLbFGF。
5.根据权利要求1所述的建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，其特征在于:步骤(4)所述的细胞冷冻液是指80% RPMI 1640+10%DMS0+10%NBSo
6.根据权利要求1所述的建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，其特征在于:步骤(4)所述的平衡是指4°C平衡30min，液氮面上悬浮2h。
7.根据权利要求1所述的建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法建立的大鼠胰导上皮样干细胞系，其特征在于:所述的大鼠胰导上皮样干细胞系保藏号为C201460，保藏日期2014年4月2日，保藏单位:中国典型培养物保藏中心。
8.根据权利要求7所述的大鼠胰导上皮样干细胞系，其特征在于:所述的大鼠胰岛上皮样干细胞形态特征为:大鼠胰岛上皮 样干细胞完全贴壁后，呈多角形上皮样，细胞核为椭圆形，核仁多为单核仁或双核仁。
9.根据权利要求7所述的大鼠胰导上皮样干细胞系，其特征在于:所述的大鼠胰岛上皮样干细胞生长特性为:大鼠胰岛上皮样干细胞克隆性生长；细胞接种第Id生长缓慢，第2~4 d进入对数生长期，第5~6d为平台期，第7 d增殖能力下降。
10.根据权利要求7所述的大鼠胰导上皮样干细胞系，其特征在于:所述的大鼠胰岛上皮样干细胞染色体数目为:大鼠胰岛上皮样干细胞是正常的二倍体细胞，染色体数目2n=42o
11.根据权利要求7所述的大鼠胰导上皮样干细胞系，其特征在于:所述的大鼠胰岛上皮样干细胞表达特征为:大鼠胰岛上皮样干细胞在蛋白水平表达八聚体转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4,0ct4)、配对基因盒 4(Paired box 4,Pax4)、配对基因盒6 (Paired box 6, Pax6)、神经源性因子3 (Neurogenin 3, Ngn3)和巢蛋白(nestin)，不表达 Pdxl、MafA、Ptfla、CK19、NeuroD2、PCNA、Nanog、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 和 secretin。
12.根据权利要求7所述的大鼠胰导上皮样干细胞系，其特征在于:所述的大鼠胰岛上皮样干细胞分化潜能为:大鼠胰岛上皮样干细胞具有多分化潜能，体外定向诱导，大鼠胰岛上皮样干细胞分化形成有突触的神经细胞，表达NSE;分化形成含有脂滴的脂肪细胞，油红O染色阳性；分化形成成骨细胞，产生矿化结节，茜素红染色阳性，Vonkossa染色矿化结节呈现黑色。
13.根据权利要求7所述的大鼠胰导上皮样干细胞系，其特征在于:所述的大鼠胰岛上皮样干细胞致瘤性为: 大鼠胰岛上皮样干细胞无致瘤性。
【文档编号】C12R1/91GK103881963SQ201410138860
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】安立龙, 效梅 申请人:广东海洋大学