一种传染性法氏囊病毒纯化方法
【专利摘要】本发明提供了一种传染性法氏囊病毒的纯化方法，该方法综合采用了微滤澄清纯化法，超滤浓缩纯化法，重复洗滤法等一系列工艺，最大限度的增大了IBDV的回收效率，降低了纯化成本。以本发明制备的传染性法氏囊病毒浓缩液成品尤其适用于制备疫苗，以本发明制备的传染性法氏囊病毒浓缩液成品制备的疫苗相对于现有技术的传染性法氏囊病毒疫苗而言安全性高，均一性好、免疫效果好。同时，本发明工艺简便、成本较低，具有突出的推广前景。
【专利说明】一种传染性法氏囊病毒纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种病毒纯化方法，尤其涉及一种传染性法氏囊病毒纯化方法。
【背景技术】
[0002]鸡传染性法氏囊病(Infectiousbursal disease virus, IBD)是由双 RNA 病毒科中的传染性法氏囊病病毒引起的一种特殊疾病，损害幼鸡法氏囊。特征是患鸡腹泻、衰竭，法氏囊先发生显著炎症和增大，继之以萎缩，最后患鸡死亡，自然条件下，本病只感染鸡且所有品种的鸡均可感染。本病除造成一些雏鸡死亡外，还常引起病愈鸡免疫抑制，导致免疫接种失败，增加雏鸡对鸡新城疫等许多疾病的易感性。
[0003]疫苗是预防该病的主要方法之一。目前，我国商品化的传染性法氏囊病毒疫苗主要是全病毒活疫苗，其安全性和有效性主要受病毒滴度，抗原纯净性等因素的影响。商品化疫苗如果直接以细胞繁殖的病毒液进行成品苗的生产，会受到细胞破碎产物，培养基成分，细胞代谢产物等杂质的影响，致使疫苗免疫动物后易发生过敏反应，发热反应等副作用。所以，提高病毒滴度和抗原纯净性是提升疫苗质量基本途径。
[0004]中空纤维膜过 滤技术属于切向流过滤技术(Tangential Flow Filtration, TFF)的范畴，又称错流过滤(Cross-Flow Filtration, CFF):料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离。
[0005]和传统的平板膜包相比，中空纤维柱具有纤维管状的开放式流道结构，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则剧烈湍流，因此具有更低的剪切力，温和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，有利于保护病毒的完整性，防止病毒颗粒聚集的同时有助于杂蛋白的透过和去除。
[0006]目前，对于传染性法氏囊病毒(IBDV)的中空纤维澄清纯化及浓缩工艺尚无报道。
【发明内容】
[0007]本发明旨在解决现有传染性法氏囊病毒疫苗副反应率高、均一性差、免疫效果差等技术问题，提供一种使用微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统实现的传染性法氏囊病毒纯化方法。
[0008]为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]一种传染性法氏囊病毒纯化方法，该方法通过微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统来实现，过程如下:
[0010]I系统的组装
[0011]无菌条件下，将微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统按照组装要求进行组装。在微滤澄清纯化系统中可安装无菌0.45 μ m或0.65 μ m、完整无损的中空纤维微滤膜,在超滤浓缩纯化系统中可安装无菌100KD或300KD、完整无损的中空纤维超滤膜。
[0012]2系统完整性检测[0013]压力保持法检测系统的完整性。
[0014]3系统的处理
[0015]3.1清洗及灭菌
[0016]0.5M NaOH溶液注满系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环泵300rpm，进行系统的清洗及灭菌处理30min。
[0017]3.2水洗及通量检测
[0018]灭囷结束后，排尽系统内的NaOH溶液。将无囷超纯水注?两系统的进料--!，开启循环泵，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至系统内PH为7.0左右。
[0019]3.3PBS 处理
[0020]水洗结束后，弃尽最后一次超纯水。将0.1M PBS溶液注满进料罐，开启循环泵300rpm循环冲洗20min。[0021]上述所述技术方案中，步骤3.1和3.2中用到的NaOH溶液起到清洗、灭菌作用，也可选用50%~80%的酒精溶液，或采用蒸汽灭菌的方式进行系统灭菌。
[0022]一种传染性法氏囊病毒纯化方法，该方法通过微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统来实现，该方法包括以下步骤:
[0023]I)将无菌的吐温20按0.5%~10%(v/v)的比例加入传染性法氏囊病毒(IBDV)病毒液中，振荡处理；
[0024]2)将步骤I)振荡处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，循环一定时间后经0.45或0.65 μ m中空纤维微滤柱过滤，收集透过液待用；
[0025]3)以l:l(v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第一洗滤液待用；
[0026]4)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤3)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第二洗滤液待用；
[0027]5)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤4)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第三洗滤液待用；
[0028]6)将上述透过液、第一洗滤液、第二洗滤液、第三洗滤液混合均匀，得到混合液；
[0029]7)将步骤6)得到的混合液注入超滤浓缩纯化系统的进料罐，开启循环泵循环一定时间，经100~300KD中空纤维超滤柱进行过滤处理，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级浓缩病毒液；
[0030]8)以l:l(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级浓缩病毒液；
[0031]9)以l:l(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级浓缩病毒液；
[0032]10)以1:1 (v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为病毒浓缩液成品。
[0033]将上述制备的病毒浓缩液成品保存于_20°C。
[0034]上述传染性法氏囊病毒纯化方法，采用的是二步纯化法，第一步通过较大孔径的澄清纯化滤膜过滤病毒液，除去毒液中的细胞碎片；第二步通过较小孔径的澄清纯化滤膜洗滤第一步的滤过液，达到除去病毒液中的吐温20、小分子蛋白，细胞代谢产线的小分子物质等杂质及实现浓缩病毒等目的。
[0035]上述传染性法氏囊病毒纯化方法中，步骤I)所述的震荡处理时间优选为IOmin ；步骤I)所述的比例优选为6% ;步骤2)所述的微滤的滤膜孔径优选为0.65 μ m ;步骤7)所述的超滤滤膜孔径优选为300KD ;步骤2、3、4、5、7、8、9、10中所述的开启循环泵循环一定时间的操作条件均优选为1500rpm循环15min ;利用该方法制备的病毒浓缩液成品用于制备疫苗；上述所述病毒澄清纯化及浓缩方法，步骤2)中透过液的体积可以根据需要进行调整，优选为透过液体积达到原液的90% ;步骤7)中的浓缩倍数可以根据实际需要进行调整，优选为浓缩10倍以上。
[0036]上述技术方案中，步骤I)所述的传染性法氏囊病毒液是指制备得到的病毒原液，未经稀释处理；步骤I)加入吐温20起到乳化作用，能够有效避免病毒粒子聚集成团，从而提升后续过滤效率。
[0037]所述微滤澄清纯化系统是指GE公司制造的FlexStand中空纤维澄清纯化系统；所述微滤膜可以选用GE公司制造的型号为CFP-6-D-6A或CFP-4-E-6A的Xample微滤柱膜；所述超滤膜可以选自 GE公司制造的型号为UFP-300-C-6A或UFP-100-C-9A的Xample超滤柱膜。
[0038]上述制备的病毒浓缩液成品检测方法如下:
[0039]对纯化浓缩工艺过程中的病毒样品进行病毒滴度及蛋白浓度检测，以分析浓缩工艺的有效性。其中病毒滴度的检测方法为:
[0040]以TCID5tl法对各样品的病毒滴度进行检测，纯化有效的判定标准为:纯化及浓缩步骤的洗滤液检测不出存活病毒，表明工艺有效；病毒的回收率在80%以上。
[0041]蛋白含量的测定方法为:
[0042]以蛋白浓度测定试剂盒对浓缩病毒液的蛋白残存量进行测定，可溶性蛋白的残存量应低于原液可溶性蛋白的10%,表明工艺有效。
[0043]以上对本发明到的
【发明内容】
进行了详细说明。本发明的纯化方法综合采用了病毒粒子洗脱法，二级纯化法，重复洗滤法等一系列工艺，最大限度的增大了 PCV2的回收效率，降低了纯化成本。以本发明制备的猪圆环病毒浓缩液成品尤其适用于制备疫苗，以本发明制备的传染性法氏囊病毒浓缩液成品制备的疫苗相对于现有技术的传染性法氏囊病毒疫苗而言安全性高,均一性好、免疫效果好。同时,本发明工艺简便、成本较低,具有突出的规模化应用前景。
【具体实施方式】
[0044]实施例所用仪器如下:
[0045]FlexStand中空纤维澄清纯化系统；
[0046]Xample 微滤柱:CFP-6-D_9A (0.65 μ m)，CFP-4-E-9A (0.45 μ m)
[0047]Xample 超滤柱:UFP-300-C_9A (300KD)，UFP-100-C-9A (100KD)，
[0048]上述仪器均购自GE公司。
[0049]实施例所用试剂如下:
[0050]100L传染性法氏囊病毒病毒液，107 0TCID50/ml,由本公司生产；
[0051]0.5M NaOHlOOL ；[0052]无菌0.1M PBS100L ；
[0053]无菌高纯水100L ；
[0054]吐温20，分析纯。
[0055]实施例1
[0056]I操作流程
[0057]1.1预处理
[0058]1.1.1系统的组装
[0059]无菌条件下，将澄清纯化系统和浓缩系统按照组装要求进行组装。在澄清系统中可安装无菌0.65 μ m、完整无损的中空纤维微滤膜，在浓缩系统中安装孔径为300KD的无菌中空纤维超滤膜；[0060]1.1.2系统完整性检测
[0061]压力保持法检测系统的完整性。
[0062]1.1.3系统的处理
[0063]清洗及灭菌:
[0064]将0.5M NaOH溶液注满纯化系统的进料罐，浸泡处理20min，开启循环泵300rpm，进行纯化系统的清洗及灭菌处理30min。
[0065]水洗及通量检测:
[0066]灭囷结束后，排尽纯化系统内的NaOH溶液。将无囷超纯水注?两系统的进料iip，开启循环泵，300rpm循环30min，弃尽系统内的液体，如此反复水洗，直至系统内PH为7.0左右。
[0067]PBS 处理:
[0068]水洗结束后，弃尽最后一次超纯水。将无菌的0.1M PBS溶液注满进料罐，开启循环泵300rpm循环冲洗20min。
[0069]1.2病毒的澄清纯化
[0070]1.2.1病毒液的处理
[0071]将6L无菌的吐温20加入100L传染性法氏囊病毒(IBDV)病毒液中，1500rpm振荡处理15min。
[0072]1.2.2病毒液的澄清
[0073]澄清系统处理完毕后，弃尽系统内的PBS溶液，将振荡处理后的病毒液，注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，800rpm循环30min,经0.65 μ m中空纤维微滤柱进行过滤纯化处理，收集透过液90L，进料罐内存留截留液10L。
[0074]1.2.3截留液的洗滤
[0075]第一次洗滤:
[0076]将IOL无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵800rpm循环30min，收集透过液10L，记为洗滤液I。
[0077]第二次洗滤:
[0078]将IOL无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵800rpm循环30min,收集透过液10L，记为洗滤液2。
[0079]第三次洗滤:[0080]将IOL无菌的0.1M PBS加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵800rpm循环30min,收集透过液10L，记为洗滤液3。
[0081]L 2.4病毒液的收集
[0082]将上述澄清纯化过程所收集的透过液及三次洗滤液混合均匀，得到混合液120L。
[0083]1.2.5初级浓缩
[0084]浓缩系统处理完毕后，将混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环泵，SOOrpm循环30min,经300KD中空纤维超滤柱进行纯化处理,弃去透过液,进料罐中剩余截留液10L,记为初级浓缩病毒液。
[0085]1.2.6浓缩液的洗滤
[0086]第一次洗滤:
[0087]将10L0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩液中，重悬，开启循环泵，800rpm循环30min，弃去透过液10L，进料罐中剩余截留液10L，记为二级浓缩病毒液。
[0088]第二次洗滤:
[0089]将10L0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩液，重悬，开启循环泵，800rpm循环30min，弃去洗滤液10L，进料罐中剩余截留液10L，记为三级浓缩病毒液。
[0090]第三次洗滤:
[0091]将10L0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩液，重悬，开启循环泵，800rpm循环30min，弃去洗滤液10L，进料罐中剩余截留液10L，即为病毒浓缩液成品。
[0092]1.2.7病毒液的收集
[0093]将经过上述处理后的得到的病毒浓缩液成品进行收集，保存于-20°C。
[0094]2有效性检测
[0095]对纯化浓缩工艺过程中的病毒样品进行病毒滴度及蛋白浓度进行检测，以分析浓缩工艺的有效性。
[0096]2.1病毒滴度的检测:
[0097]将浓缩后的病毒用细胞维持液做10倍系列稀释，取10_5、10_6、10_73个稀释度接种96孔培养板CEF细胞单层，每个稀释度重复5孔，每孔0.1ml，5%C02、37°C培养120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID5tlt5检测结果证实，浓缩液每0.1ml病毒含量IO7 tlTCID5ci，浓缩阶段的洗滤液无效价，病毒回收率接近100%。
[0098]2.2可溶性蛋白的检测:
[0099]取各样品以BCA蛋白浓度试剂盒进打测定，结果显不，可溶性蛋白残存率为9.3%。
[0100]3疫苗制备
[0101]以上述工艺制备的病毒浓缩液作为原料，进一步制备疫苗，其工艺步骤如下:
[0102]3.1 灭活
[0103]将纯化浓缩后的IBDV毒液以0.1M PBS进行稀释，使其病毒滴度达到107_ tlTCID5tl/ml，将纯化前的IBDV病毒液(107_°TCID5Q/ml)与纯化后的IBDV病毒液(107_°TCID5Q/ml)分别置于灭活罐内，加入总体积2%。甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，37°C灭活16小时(以罐内液体温度达到37°C开始计时)后放2~8°C保存。
[0104]3.2 乳化
[0105]油相制备:取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司班-802份，先将白油缓慢加温，按6%和2%加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用。
[0106]乳化分别取油相3份放入两个乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时分别徐徐加入彻底灭活的毒液1份后，再以4000r/min搅拌30分钟,制备为油包水型疫苗,将纯化前的IBDV病毒液制备的IBDV灭活疫苗，记为IBDV灭活疫苗I ;纯化后的IBDV病毒液制备的IBDV灭活疫苗，记为IBDV灭活疫苗2。
[0107]4疫苗安全检验
[0108]以上述工艺制备的IBDV灭活疫苗1，IBDV灭活疫苗2，无菌0.1M PBS溶液作为实验材料；取21日龄SPF鸡40只，20只各颈背部皮下注射两组疫苗2羽份，另20只作对照，同条件饲养，观察15日后扑杀。检查疫苗接种部位的组织、法氏囊和各脏器均无病例变化。两组鸡均无肉眼可见异常变化。
[0109]5疫苗效力检验
[0110]以下方法任择其一。
[0111]I)血清学方法:取21日龄SPF鸡4只，其中20只各肌肉或颈部皮下注射疫苗I羽份，另外20只不免疫作为对照，同条件下隔离饲养。，接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，做琼脂免疫扩散试验。免疫IBDV灭活疫苗I的10只鸡琼扩效价为1:21，免疫IBDV灭活疫苗2的10只鸡琼扩效价为1:28，对照鸡全部阴性。
[0112]2)免疫攻毒法:取21日龄SPF鸡40只，其中20只各肌肉或颈部皮下注射疫苗I羽份，另外20只不免疫作为对照，同条件下隔离饲养。接种21日后，所有免疫鸡和对照鸡，每只点眼途径接种10倍稀释的鸡传染性法氏囊病毒BJQ902株毒液0.1ml0攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至96小时，扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变。免疫鸡20只全部正常，不出现法氏囊病变；对照鸡10只全发病，出现明显的法氏囊病变(如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变)。
[0113]综上所述，利用本发明纯化得到的传染性法氏囊病毒浓缩纯化液成品适用于制备传染性法氏囊病毒疫苗；利用本发明纯化得到的传染性法氏囊病毒浓缩纯化液成品制备传染性法氏囊病毒疫苗，其安全性良好同时免疫效力显著。
[0114]实施例2
[0115]I)将无菌吐温20按10%(v/v)的比例加入传染性法氏囊病毒(IBDV)病毒液中，振荡处理；
[0116]2)将步骤I)振荡处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，循环一定时间后经0.45 μ m中空纤维微滤柱过滤处理，收集透过液待用；
[0117]3)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第一洗滤液，4~10°C保存待用；
[0118]4)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第二洗滤液，4~10°C保存待用；
[0119] 5)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第三洗滤液，4~10°C保存待用。
[0120]6)将上述透过液、第一洗滤液、第二洗滤液、第三洗滤液混合均匀，得到混合液；[0121]7)将步骤6)得到的混合液注入超滤浓缩纯化系统的进料罐，开启循环泵循环一定时间，经100KD中空纤维超滤柱进行过滤处理，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级浓缩病毒液；
[0122]8)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级浓缩病毒液；
[0123]9)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级浓缩病毒液；
[0124]10)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为病毒浓缩液成品O
[0125]实施例3
[0126]1)将无菌吐温20按0.5%(v/v)的比例加入传染性法氏囊病毒(IBDV)病毒液中，1500rpm 振荡处理 2 0min ；
[0127]2)将步骤I)振荡处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵以800rpm的条件循环30min,而后经0.65 μ m中空纤维微滤柱微滤,收集透过液待用；
[0128]3)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵以SOOrpm的条件循环30min，收集透过液，得到第一洗滤液，4~10°C保存待用；
[0129]4)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵以800rpm的条件循环30min,收集透过液,得到第二洗滤液待用，4~10°C保存；
[0130]5)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵以SOOrpm的条件循环30min，收集透过液，得到第三洗滤液待用。
[0131]6)将上述透过液、第一洗滤液、第二洗滤液、第三洗滤液混合均匀，得到混合液；
[0132]7)将步骤6)得到的混合液注入超滤浓缩系统的进料罐，开启循环泵以SOOrpm的条件循环30min,经100KD中空纤维超滤柱进行超滤处理,弃去透过液,收集进料罐中剩余截留液，即为初级浓缩病毒液；
[0133]8)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵以800rpm的条件循环30min,弃去透过液,收集进料罐中剩余截留液，即为二级浓缩病毒液；
[0134]9)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵以800rpm的条件循环30min,弃去洗滤液,收集进料罐中剩余截留液，即为三级浓缩病毒液；
[0135]10)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵以800rpm的条件循环30min,弃去洗滤液,收集进料罐中剩余截留液，即为病毒浓缩液成品。
[0136]以上对本发明实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明 。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种传染性法氏囊病毒纯化方法，其特征在于使用微滤澄清纯化系统和超滤浓缩纯化系统，并包括以下步骤: 1)将无菌的吐温20按0.5%~10%(v/v)的比例加入传染性法氏囊病毒(IBDV)病毒液中，振荡处理； 2)将步骤I)振荡 处理后的病毒液注入微滤澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵，循环一定时间后经0.45或0.65 μ m中空纤维微滤柱过滤,收集透过液待用； 3)以l:l(v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第一洗滤液待用； 4)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤3)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第二洗滤液待用； 5)以1:1 (v/v)的比例将无菌的0.1M PBS缓冲液加入到步骤4)处理完毕的进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，收集透过液，得到第三洗滤液待用； 6)将上述透过液、第一洗滤液、第二洗滤液、第三洗滤液混合均匀，得到混合液； 7)将步骤6)得到的混合液注入超滤浓缩纯化系统的进料罐，开启循环泵循环一定时间，经100KD或300KD中空纤维超滤柱进行过滤处理，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级浓缩病毒液； 8)以l:l(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的初级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵循环一定时间，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级浓缩病毒液； 9)以l:l(v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的二级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级浓缩病毒液； 10)以1:1 (v/v)的比例将0.1M PBS注入进料罐中的三级浓缩病毒液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为病毒浓缩液成品。
2.根据权利要求1所述的一种传染性法氏囊病毒纯化方法，其特征在于步骤I)所述的震荡处理时间为IOmin。
3.根据权利要求1所述的一种传染性法氏囊病毒纯化方法，其特征在于其特征在于步骤I)所述的比例为6%。
4.根据权利要求1所述的一种传染性法氏囊病毒纯化方法，其特征在于步骤2)所述的微滤的滤膜孔径为0.45或0.65 μ m,较优的为0.65 μ m。
5.根据权利要求1所述的一种传染性法氏囊病毒纯化方法，其特征在于步骤7)所述的超滤滤膜孔径为300KD。
6.根据权利要求1所述的一种传染性法氏囊病毒纯化方法，其特征在于步骤2、3、4、5、7、8、9、10中所述的开启循环泵循环一定时间的操作条件均为1500rpm循环15min。
7.根据权利要求1~6所述的一种传染性法氏囊病毒纯化方法，其特征在于利用该方法制备的病毒浓缩液成品用于制备疫苗。
【文档编号】C12N7/02GK103937755SQ201410145471
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】吴全忠, 米娜, 李倬, 丁旭娜, 吕茂杰, 杨保收, 梁武, 李守军 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司