靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建方法，包括如下步骤：1）、制备携带GP73核心启动子的pXC2-GP73质粒；2）、制备pSD55-GP73-gene质粒；3）、将pSD55-GP73-gene质粒用PmeI线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由GP73核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；4）、将重组鉴定正确的质粒用Pac?I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒GD55-gene。本发明还同时提供了上述溶瘤腺病毒GD55-gene在制备治疗肝癌药物中的应用。
【专利说明】靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和基因治疗领域，具体地说，是涉及一种肝癌特异性的启动子GP73启动子的核心序列的筛选和克隆，以及携带GP73启动子靶向肝癌腺病毒载体GD55的构建和应用。
【背景技术】
[0002]对于大多数种类的癌症，目前仍然采用的是传统疗法如外科手术、放疗、化疗等，而面对很多中晚期恶性肿瘤，传统疗法显得束手无策，主要表现在治愈率低、复发率及死亡率高、预后较差。基因治疗是通过将外源正常基因导入靶细胞以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，人们对肿瘤的基因治疗寄寓极闻的热情，64.2%的基因治疗临床试验均用于肿瘤治疗。到目前为止，肿瘤的基因治疗研究已取得了重要进展；对于恶性肿瘤，基因治疗可利用肿瘤细胞与正常细胞间分子水平的差异，显著拓宽肿瘤的“治疗窗”，能高效地、选择性地杀伤肿瘤细胞或阻止肿瘤细胞生长以及防止肿瘤的转移。
[0003]2001年，中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的刘新垣院士突破性的提出了癌症的革巴向基因-病毒治疗(Cancer Targeting Gene-Viro Therapy)概念,综合了基因治疗和病毒治疗两者的优势，表现出良好的协同作用，大量的体内、外研究实验表明靶向基因-病毒治疗的效果要明显优于单独的基因治疗或者病毒治疗的效果。其主要是以溶瘤腺病毒为载体，将目的基因插入到病毒基因组中，随着病毒在肿瘤细胞中的不断增殖，抗癌基因也随之发生数百 倍乃至千倍的复制，从而大量表达抗癌基因，克服了基因治疗中，基因转染效率低和基因拷贝数低的问题，也解决了病毒治疗中杀伤力弱的问题，成为今后癌症基因治疗、病毒治疗的新趋势。
[0004]腺病毒载体具有许多独特的优点:腺病毒相对稳定；安全性较好，在人类的肿瘤细胞中尚未发现有腺病毒的整合，未发现其与人类肿瘤的发生有直接关系；腺病毒基因组较大(36kb)，插入大片段外源性基因的潜力大；腺病毒的感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞；细胞及动物实验表明，腺病毒载体容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白；腺病毒基因组较易操作。
[0005]利用肿瘤特异性启动子控制病毒所携带的治疗基因是构建肿瘤靶向性腺病毒的方法之一，其能使治疗基因只能在肿瘤细胞内表达，而在正常细胞中不表达，从而大大降低了肿瘤基因治疗的副反应而增强了其靶向性和疗效。近年研究表明，GP73同肝癌关系密切。2010年北京协和医院的毛一雷教授用免疫沉淀法检测，率先完成了超过4000例的大样本的GP73的研究，GP73诊断肝癌的敏感度和特异度分别达到了 75%和95%，而AFP的仅有58%及85%。2013年汤绍辉博士收集已经发表的用酶联免疫法检测GP73相关的文献，整理得到样本5279例，其中肝癌2075例，进行Meta分析，GP73诊断肝癌的敏感度和特异度分别达到了 78%和84%，而AFP的仅有55%及80%。
[0006]粒细胞-巨卩遼细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony stimulatingfactor, GM-CSF)是一种具有广谱效应的多肽生长因子，它通过结合特定的高亲和力受体起作用，在调节白细胞和造血功能中有重要作用，可以维持造血前体细胞和成熟血细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核/巨噬细胞)的存活；能够促进造血前体细胞(包括粒细胞、单核细胞和巨核细胞等前体细胞)增殖分化，GM-CSF能增强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能，还能增强巨噬细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，对粒细胞和巨噬细胞有直接的趋化作用。GM-CSF作为目前已知功能最强大的免疫调节分子，在增强机体抗肿瘤免疫功能方面显示了良好的应用前景，并被广泛应用于肿瘤的免疫治疗。GM-CSF可通过以下机制参与免疫调节:(I)提高肿瘤细胞MHC分子的表达；(2)诱导树突状细胞的成熟、分化并增强抗肿瘤体液免疫；(3)上调共刺激分子CD86表达，逆转T淋巴细胞免疫耐受；(4)促进效应性T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)在肿瘤部位浸润，杀伤肿瘤细胞。以病毒为载体携带GM-CSF基因用于癌症治疗，已经有多个进入临床试验，例如JX-594、OncoVEX,CGTG-102等，并且显现出非凡的治疗效果。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是提供肝癌双靶向溶瘤腺病毒载体GD55-gene的构建方法和用途。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明提供一种靶向肝癌溶瘤腺病毒(肝癌双靶向溶瘤腺病毒载体⑶55-gene)的构建方法，包括如下步骤:
[0009]I)、将作为GP73核心启动子的P-19/-677质粒，用Xho I和SnaB I双酶切后，替换掉pXC2上ElA的野生型启动子，得到携带GP73核心启动子的pXC2_GP73质粒；
[0010]所述P-19/-677，其序列如 SEQ ID NO:3 所示(659bp)；
[0011]2)、用Xho I和Xba I双酶切pXC2_GP73得到GP73-E1A片断，与同样用Xho I和XbaI双酶切的PSD55相连，得到pSD55-GP73 ;当需要携带基因时，可通过PCR获得目的基因，连接到经Hind III和BamH I双酶切的pCA13载体上得到pCA13_gene，然后用Bgl II单酶切得到完整的基因表达框，连接到同样经Bgl II酶切的pSD55-GP73载体上，得到pSD55-GP73-gene质粒;
[0012]3)、将pSD55-GP73-gene质粒用PmeI线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生ElA区由GP73核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；
[0013]4)、将重组鉴定正确的质粒用Pac I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后(备注:细胞病变是指病毒在细胞内大量扩增而出现的细胞先膨胀变圆，后死亡的现象)，得到目的溶瘤腺病毒⑶55-gene。
[0014]本发明还同时提供了上述溶瘤腺病毒⑶55-gene在制备治疗肝癌药物中的应用。
[0015]在本发明中，
[0016]本发明克隆并筛选一种新型的肝癌特异性启动子GP73的核心序列，得到具有较高启动活性的转录序列片段，通过筛选的该启动子的核心序列得到具有较高肝癌启动活性的序列。
[0017]本发明将肝癌特异性GP73启动子和缺失腺病毒ElB55kDa区域两种肿瘤靶向优势结合在起来，共同调控腺病毒，从而提供一种更安全的肿瘤双靶向腺病毒载体。
[0018]本发明提供一种肝癌双靶向溶瘤腺病毒载体⑶55-gene的构建方法。[0019]本发明提供一种肝癌双靶向溶瘤腺病毒载体⑶55-gene在肝癌治疗中的用途。
[0020]为达到上述目的，本发明提供了一种肝癌双靶向溶瘤腺病毒载体⑶55-gene，该载体具有双重肿瘤靶向性，能作为一种更好的基因一病毒治疗载体平台。
[0021]本发明筛选并克隆GP73启动子的核心序列，将其用于控制腺病毒ElA基因转录，从而提高肿瘤基因治疗的靶向性，并且删除了腺病毒的E1B55区，缺失E1B55的腺病毒不能够与正常细胞内P53蛋白结合，而在p53缺失或者突变的肿瘤细胞中能够大量复制，从而达到双靶向性消灭肿瘤的目的。
[0022]备注说明:本发明提供肝癌特异性GP73核心启动子，为以下任意一种:
[0023]P-19/-413，其序列如 SEQ ID NO:1 所示(395bp)；
[0024]P-19/-613，其序列如 SEQ ID NO:2 所示(595bp)；
[0025]P-19/-677，其序列如 SEQ ID NO:3 所示(659bp)；
[0026]P-19/-729，其序列如 SEQ ID NO:4 所示(71 Ibp)。
[0027]上述肝癌特异性GP73核心启动子的筛选构建方法，包括如下步骤:
[0028]I)、用PCR方法，以人肝癌细胞Huh7的总DNA基因组为模板，使用GP73特异性引物，得到PCR产物为GP73启动子全长序列P-19/-2616，用Mlu I和Hind III双酶切与同样双酶切的pGL3-Basic 质粒连接，得到pGL3_L2598质粒；
[0029]所述GP73 特异性引物为 p-19: (Hind III)和 p-2616: (Mlu I)；
[0030]p-19:(Hind III)ACTAAGCTT CCGGCCTCCGCAGCGGCAAG,
[0031]p-2616: (Mlu DCGACGCGT TAGTCCCACCACTCTCGA:
[0032]2)、以pGL3-L2598为模板，用携带Mlu I和Hind III酶切位点的不同的引物经PCR获得含有不同GP73片段长度的质粒，与Mlu I和Hind III双酶切的pGL3-Basic质粒连接，得到 PGL3-L711 (即，p-19/-729)、pGL3-L659 (即，p-19/-677)、pGL3_L595 (即，p_19/_613)、PGL3-L395 (即，p_19/_413)质粒；
[0033]所述pGL3-L711质粒对应引物为p-19/p_729 ；
[0034]所述pGL3-L659质粒对应引物为p-19/p_677 ；
[0035]所述pGL3-L595质粒对应引物为p-19/p_613 ；
[0036]所述pGL3-L395质粒对应引物为p-19/p_413 ；
[0037]p-413: (Mlu DCGACGCGT ATAAAGAAGGTAACGTGA ；
[0038]p-613: (Mlu DCGACGCGT GAATCTTCACTTTTTCCGTTG:
[0039]p-677: (Mlu DCGACGCGT TCATCTGAGGCGCTGTTTCA:
[0040]p-729: (Mlu DTGACGCGT CTCCGGGAGGTACGGCCTCA。
[0041]作为本发明的肝癌特异性GP73核心启动子的筛选构建方法的改进:
[0042]所述步骤I)和步骤2)中的PCR体系均为:
【权利要求】
1.靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建方法，其特征是包括如下步骤: 1)、将作为GP73核心启动子的P-19/-677质粒，用XhoI和SnaB I双酶切后，替换掉PXC2上ElA的野生型启动子，得到携带GP73核心启动子的pXC2_GP73质粒； 所述P-19/-677，其序列如SEQ ID NO:3所示； 2)、用XhoI和Xba I双酶切pXC2-GP73得到GP73-E1A片断，与同样用Xho I和Xba I双酶切的PSD55相连，得到pSD55-GP73 ;当需要携带基因时，可通过PCR获得目的基因，连接到经HindIII和BamH I双酶切的pCA13载体上得到pCA13_gene，然后用Bgl II单酶切得到完整的基因表达框，连接到同样经Bgl II酶切的pSD55-GP73载体上，得到pSD55-GP73-gene质粒; 3)、将pSD55-GP73-gene质粒用PmeI线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生ElA区由GP73核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体； 4)、将重组鉴定正确的质粒用PacI酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒GD55-gene。
2.如权利要求1所述的溶瘤腺病毒GD55-gene在制备治疗肝癌药物中的应用。
【文档编号】C12N15/861GK103981155SQ201410147652
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】王毅刚, 刘涛, 黄芳, 马步云, 黄盼盼, 周秀梅, 刘新垣 申请人:浙江理工大学