肝癌特异性gp73核心启动子及其筛选构建方法
【专利摘要】本发明公开了肝癌特异性GP73核心启动子，为以下任意一种：p-19/-413，p-19/-613，p-19/-677，p-19/-729。本发明还同时公开了其筛选构建方法，包括：以人肝癌细胞Huh7的总DNA基因组为模板，得到PCR产物为GP73启动子全长序列p-19/-2616，用Mlu?I和HindIII双酶切与同样双酶切的pGL3-Basic质粒连接，得到pGL3-L2598质粒；2）、以pGL3-L2598为模板，用携带Mlu?I和Hind?III酶切位点的不同的引物经PCR获得含有不同GP73片段长度的质粒。
【专利说明】肝癌特异性GP73核心启动子及其筛选构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和基因治疗领域，具体地说，是涉及一种肝癌特异性的启动子GP73启动子的核心序列的筛选和克隆，以及携带GP73启动子靶向肝癌腺病毒载体GD55的构建和应用。
【背景技术】
[0002]对于大多数种类的癌症，目前仍然采用的是传统疗法如外科手术、放疗、化疗等，而面对很多中晚期恶性肿瘤，传统疗法显得束手无策，主要表现在治愈率低、复发率及死亡率高、预后较差。基因治疗是通过将外源正常基因导入靶细胞以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，人们对肿瘤的基因治疗寄寓极闻的热情，64.2%的基因治疗临床试验均用于肿瘤治疗。到目前为止，肿瘤的基因治疗研究已取得了重要进展；对于恶性肿瘤，基因治疗可利用肿瘤细胞与正常细胞间分子水平的差异，显著拓宽肿瘤的“治疗窗”，能高效地、选择性地杀伤肿瘤细胞或阻止肿瘤细胞生长以及防止肿瘤的转移。
[0003]2001年，中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的刘新垣院士突破性的提出了癌症的革巴向基因-病毒治疗(Cancer Targeting Gene-Viro Therapy)概念,综合了基因治疗和病毒治疗两者的优势，表现出良好的协同作用，大量的体内、外研究实验表明靶向基因-病毒治疗的效果要明显优于单独的基因治疗或者病毒治疗的效果。其主要是以溶瘤腺病毒为载体，将目的基因插入到病毒基因组中，随着病毒在肿瘤细胞中的不断增殖，抗癌基因也随之发生数百倍乃至千倍的复制，从而大量表达抗癌基因，克服了基因治疗中，基因转染效率低和基因拷贝数低的问题，也解决了病毒治疗中杀伤力弱的问题，成为今后癌症基因治疗、病毒治疗的 新趋势。
[0004]腺病毒载体具有许多独特的优点:腺病毒相对稳定；安全性较好，在人类的肿瘤细胞中尚未发现有腺病毒的整合，未发现其与人类肿瘤的发生有直接关系；腺病毒基因组较大(36kb)，插入大片段外源性基因的潜力大；腺病毒的感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞；细胞及动物实验表明，腺病毒载体容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白；腺病毒基因组较易操作。
[0005]利用肿瘤特异性启动子控制病毒所携带的治疗基因是构建肿瘤靶向性腺病毒的方法之一，其能使治疗基因只能在肿瘤细胞内表达，而在正常细胞中不表达，从而大大降低了肿瘤基因治疗的副反应而增强了其靶向性和疗效。近年研究表明，GP73同肝癌关系密切。2010年北京协和医院的毛一雷教授用免疫沉淀法检测，率先完成了超过4000例的大样本的GP73的研究，GP73诊断肝癌的敏感度和特异度分别达到了 75%和95%，而AFP的仅有58%及85%。2013年汤绍辉博士收集已经发表的用酶联免疫法检测GP73相关的文献，整理得到样本5279例，其中肝癌2075例，进行Meta分析，GP73诊断肝癌的敏感度和特异度分别达到了 78%和84%，而AFP的仅有55%及80%。
[0006]粒细胞-巨卩遼细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony stimulatingfactor, GM-CSF)是一种具有广谱效应的多肽生长因子，它通过结合特定的高亲和力受体起作用，在调节白细胞和造血功能中有重要作用，可以维持造血前体细胞和成熟血细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核/巨噬细胞)的存活；能够促进造血前体细胞(包括粒细胞、单核细胞和巨核细胞等前体细胞)增殖分化，GM-CSF能增强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能，还能增强巨噬细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，对粒细胞和巨噬细胞有直接的趋化作用。GM-CSF作为目前已知功能最强大的免疫调节分子，在增强机体抗肿瘤免疫功能方面显示了良好的应用前景，并被广泛应用于肿瘤的免疫治疗。GM-CSF可通过以下机制参与免疫调节:(I)提高肿瘤细胞MHC分子的表达；(2)诱导树突状细胞的成熟、分化并增强抗肿瘤体液免疫；(3)上调共刺激分子CD86表达，逆转T淋巴细胞免疫耐受；(4)促进效应性T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)在肿瘤部位浸润，杀伤肿瘤细胞。以病毒为载体携带GM-CSF基因用于癌症治疗，已经有多个进入临床试验，例如JX-594、OncoVEX,CGTG-102等，并且显现出非凡的治疗效果。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是提供一种新型的肝癌特异性GP73启动子及其筛选构
建方法。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明提供肝癌特异性GP73核心启动子，为以下任意一种:
[0009]P-19/-413，其 序列如 SEQ ID NO:1 所示(395bp)；
[0010]P-19/-613，其序列如 SEQ ID NO:2 所示(595bp)；
[0011]P-19/-677，其序列如 SEQ ID NO:3 所示(659bp)；
[0012]P-19/-729，其序列如 SEQ ID NO:4 所示(71 Ibp)。
[0013]本发明还同时提供了上述肝癌特异性GP73核心启动子的筛选构建方法，包括如下步骤:
[0014]I)、用PCR方法，以人肝癌细胞Huh7的总DNA基因组为模板，使用GP73特异性引物，得到PCR产物为GP73启动子全长序列P-19/-2616，用Mlu I和Hind III双酶切与同样双酶切的pGL3-Basic质粒连接，得到pGL3_L2598质粒；
[0015]所述GP73 特异性引物为 p-19: (Hind III)和 p-2616: (Mlu I)；
[0016]p-19:(Hind III)ACTAAGCTT CCGGCCTCCGCAGCGGCAAG,
[0017]p-2616: (Mlu DCGACGCGT TAGTCCCACCACTCTCGA:
[0018]2)、以pGL3-L2598为模板，用携带Mlu I和Hind III酶切位点的不同的引物经PCR获得含有不同GP73片段长度的质粒，与Mlu I和Hind III双酶切的pGL3-Basic质粒连接，得到 PGL3-L711 (即，p-19/-729)、pGL3-L659 (即，p-19/-677)、pGL3_L595 (即，p_19/_613)、PGL3-L395 (即，p_19/_413)质粒；
[0019]所述pGL3-L711质粒对应引物为p-19/p_729 ；
[0020]所述pGL3-L659质粒对应引物为p-19/p_677 ；
[0021]所述pGL3-L595质粒对应引物为p-19/p_613 ；
[0022]所述pGL3-L395质粒对应引物为p-19/p_413 ；
[0023]p-413: (Mlu DCGACGCGT ATAAAGAAGGTAACGTGA ；
[0024]p-613: (Mlu DCGACGCGT GAATCTTCACTTTTTCCGTTG:[0025]p-677: (Mlu DCGACGCGT TCATCTGAGGCGCTGTTTCA:
[0026]p-729: (Mlu DTGACGCGT CTCCGGGAGGTACGGCCTCA。
[0027]作为本发明的肝癌特异性GP73核心启动子的筛选构建方法的改进:
[0028]所述步骤I)和步骤2)中的PCR体系均为:
【权利要求】
1.肝癌特异性GP73核心启动子，其特征是为以下任意一种: P-19/-413，其序列如 SEQ ID NO:1 所示； P-19/-613，其序列如 SEQ ID NO:2 所示； P-19/-677，其序列如 SEQ ID NO:3 所示； P-19/-729，其序列如 SEQ ID NO:4 所示。
2.如权利要求1所述的肝癌特异性GP73核心启动子的筛选构建方法，其特征是包括如下步骤: 1)、用PCR方法，以人肝癌细胞Huh7的总DNA基因组为模板，使用GP73特异性引物，得到PCR产物为GP73启动子全长序列P-19/-2616，用Mlu I和Hind III双酶切与同样双酶切的pGL3-Basic质粒连接，得到pGL3_L2598质粒； 所述 GP73 特异性引物为 p-19: (Hind III)和 p_2616:(Mlu I)； p-19: (Hind I II)ACTAAGCTT CCGGCCTCCGCAGCGGCMG, p-2616: (Mlu DCGACGCGT TAGTCCCACCACTCTCGA ； 2)、以pGL3-L2598为模板，用携带MluI和Hind III酶切位点的不同的引物经PCR获得含有不同GP73片段长度的质粒，与Mlu I和Hind III双酶切的pGL3-Basic质粒连接，得到 pGL3-L711、pGL3-L659、pGL3-L595、pGL3-L395 质粒； 所述PGL3-L711质粒对应引物为p-19/p-729 ； 所述PGL3-L659质粒对应引物为p-19/p_677 ； 所述PGL3-L595质粒对应引物为p-19/p_613 ； 所述PGL3-L395质粒对应引物为p-19/p_413 ； p-413: (Mlu DCGACGCGT ATAAAGAAGGTAACGTGA ； p-613: (Mlu DCGACGCGT GAATCTTCACTTTTTCCGTTG ； p-677: (Mlu DCGACGCGT TCATCTGAGGCGCTGTTTCA ； p-729: (Mlu DTGACGCGT CTCCGGGAGGTACGGCCTCA。
3.根据权利要求2所述的肝癌特异性GP73核心启动子的筛选构建方法，其特征是:所述步骤I)和步骤2)中的PCR体系均为:PCR Mix25 μLΙ.?ΜΙ_(〗ΟμΜ)I μL下游引物(丨O μΜ)I μL样 w2 μLddH2021 μL 总体枳50 μLPCR 条件均为:94°C X 45s, 58°C X 30s, 72°C X1.5min。
【文档编号】C12N15/113GK103981185SQ201410147647
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】王毅刚, 刘涛, 马步云, 黄盼盼, 周秀梅, 刘新垣 申请人:浙江理工大学