韩国假单胞菌及其制备内消旋酒石酸或其盐的方法
【专利摘要】本发明提供一种韩国假单胞菌BK-9，具有如SEQIDNO:1所示的16SrDNA序列，命名为韩国假单胞菌Pseudomonaskoreensis，已保藏于CGMCC，保藏登记号为CGMCCNo.8395。本发明提供的一种韩国假单胞菌通过水解将反式环氧琥珀酸或其盐转化为内消旋酒石酸或其盐，且获得较高的产量，充分满足市场需求，具有实用性。
【专利说明】韩国假单胞菌及其制备内消旋酒石酸或其盐的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，涉及一种韩国假单胞菌及其生产内消旋酒石酸或其盐的方法。
【背景技术】
[0002]内消旋酒石酸是一种有机酸，主要用于制备防盐结块剂，也可用于制备药物、果子精油、焙粉以及媒染剂、鞣剂等，其需求量正在逐年递增。目前已报道的生产内消旋酒石酸的方法主要有3种，一是以顺丁烯二酸为原料，以钥酸盐或钨酸盐为催化剂，使顺丁烯二酸和过氧化氢反应生成中间产物顺式环氧琥珀酸，进而合成内消旋酒石酸；二是L (+)-酒石酸在强碱条件下加热，发生分子内部空间结构上的转变，生成内消旋酒石酸；三是生物合成法，采用具有反式环氧琥珀酸水解酶的微生物来生产内消旋酒石酸或其盐:即以反丁烯二酸酐为原料加水得到反丁烯二酸，再以钨酸或钨酸盐为催化剂，使反丁烯二酸与过氧化氢反应制得反式环氧琥珀酸，最后利用具有反式环氧琥珀酸水解酶的微生物将反式环氧琥珀酸或其盐水解为内消旋酒石酸或其盐。
[0003]目前报道的具有反式环氧琥珀酸水解酶的微生物只有恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、黄杆菌(fIavobacterium)属。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种新的韩国假单胞菌菌株(Pseudomonas koreensisBK-9)，具有如SEQ ID N0:1所示的16S rDNA序列，该韩国假单胞菌命名为韩国假单胞菌Pseudomonas koreensis,已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称:CGMCC)，保藏登记号为CGMCC N0.8395，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中国科学院微生物研究所(邮编:100101)。
[0005]本发明的另一个目的是提供韩国假单胞菌菌株在制备内消旋酒石酸或其盐中应用，通过以下步骤实现:先在种子培养基中培养所述韩国假单胞菌的种子液；然后将所述韩国假单胞菌的种子液转接入产酶培养基中，培养获得韩国假单胞菌细胞；最后利用所述韩国假单胞菌细胞对反式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成内消旋酒石酸或其盐。
[0006]本发明制备内消旋酒石酸或其盐的优选具体步骤是:将保存于斜面培养基上的韩国假单胞菌BK-9(CGMCC N0.8395)接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养24h，得到所述韩国假单胞菌的种子液；然后取3ml上述韩国假单胞菌的种子液接种于装有300ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养48h，获得相应的韩国假单胞菌细胞；接着7000rpm、15min离心收集韩国假单胞菌细胞，将该韩国假单胞菌细胞加入到300ml的 浓度为0.SM的反式环氧琥珀酸或其盐中，37°C振荡培养，反应48h，得到转化液；最后向转化液中加入过量的CaCl2，形成内消旋酒石酸钙沉淀，过滤得到沉淀并水洗，再对内消旋酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴、阳离子交换柱精制、减压浓缩、结晶、分离和烘干得到内消旋酒石酸或其盐的成品。[0007]其中反式环氧琥珀酸盐为反式环氧琥珀酸与各种阳离子所形成的盐，阳离子选自钠、钾、铵、钙。
[0008]斜面培养基:葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵lg，硫酸镁0.lg，磷酸二氢钾0.6g，琼脂粉 15g，加水至 1000ml, ρΗ7.0。
[0009]种子培养基:葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵lg，硫酸镁0.lg，磷酸二氢钾0.6g，加水至 1000ml, ρΗ7.0。
[0010]产酶培养基组成为:葡萄糖10g，牛肉膏5g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁0.lg，氯化铵Ig,反式环氧琥拍酸钠IOg,加水至1000ml, pH7.0。
[0011]本发明的发明人经过长期和深入的研究，从田园土中分离获得了一种新的微生物菌株，它能将反式环氧琥珀酸或其盐转化为内消旋酒石酸或其盐。该新的菌株经鉴定为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)。本发明的韩国假单胞菌菌株可用于对反式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成内消旋酒石酸或其盐，获得的内消旋酒石酸经过了详细的鉴定。[0012]本发明提供了一种新的可用于内消旋酒石酸或其盐生产的韩国假单胞菌菌株(Pseudomonas koreensis),且使用本发明韩国假单胞菌BK-9通过对反式环氧琥拍酸或其盐进行水解生成内消旋酒石酸或其盐，并可达到较高的产量，充分满足市场需求，具有实用性。
[0013]生物材料样品的保藏信息
[0014]保藏的生物材料样品:韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)BK-9 ;保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称:CGMCC);保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中国科学院微生物研究所(邮编:100101);保藏日期:2013年10月25H ;保藏登记号:CGMCC N0.8395。
【具体实施方式】
[0015]在本发明通过实施例作进一步的说明。
[0016]以下实施例中，所用的斜面培养基和种子培养基的组成如下:
[0017](I)斜面培养基:葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵lg，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,琼脂粉15g，加水至1000ml, ρΗ7.0。
[0018](2)种子培养基:葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵lg，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,加水至 1000ml, pH7.0。
[0019](3)产酶培养基:葡萄糖10g，牛肉膏5g，磷酸二氢钾lg，硫酸镁0.lg，氯化铵lg，反式环氧琥拍酸钠IOg,加水至1000ml, pH7.0。
[0020](4)筛选培养基:反式环氧琥珀酸钠10g，酵母提取物lg，磷酸二氢钾lg，硫酸镁
0.lg，氯化铵 lg，加水至 1000ml，PH7.0。
[0021]实施例1:韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)BK-9的筛选
[0022]称取5g田园土样品，置于装有50ml筛选培养基的250ml三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养3天。取一环培养液，并在固体筛选培养基平板上划斜线，30°C倒置培养2天。挑取平板上的单菌落，接种于装有50ml产酶培养基的250ml三角瓶中，30°C、200rpm下振荡培养48h。7000rpm下离心15min，收集细胞，于4°C放置备用。将离心收集的细胞用IOml0.8MPH7.0反式环氧琥珀酸钠悬浮，30°C振荡反应I天后，用高效液相色谱法鉴定反应液中有无内消旋酒石酸产生。本发明田园土样品来源于杭州市。
[0023]本发明总共对535个菌株进行了筛选，得到了一株具有将反式环氧琥珀酸或其盐水解为内消旋酒石酸或其盐特性的菌株，经CGMCC证明存活。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏登记号为CGMCC N0.8395，命名为:韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis) BK-9,保藏日:2013年10月25日，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中国科学院微生物研究所(邮编:100101)。
[0024]实施例2:韩国假单胞菌 BK-9 (Pseudomonas koreensis BK-9)的鉴定
[0025]步骤1:变性
[0026]在斜面培养基中挑取韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395于IOul无菌水中，变性后离心取上清作为模板。变性条件为:99°C，IOmin0
[0027]步骤2:PCR扩增
[0028]使用细菌16S rDNA PCR鉴定试剂盒(购于TaKaRa公司，货号D310)，进行PCR扩增韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395的16S rDNA片段。
[0029]其中，PCR反应体系为:步骤I所得的变性反应液I μ 1，PCR Premix25 μ I, Forwardprimer(20pmol/μ I)0.5 μ I,Reverse primer(20pmol/μ I)0.5 μ 1,16S-free H2023 μ I,总体积50 μ 1
[0030]PCR反应条件如下所示:
[0031]
【权利要求】
1.一种韩国假单胞菌菌株，其特征在于，所述韩国假单胞菌命名为:韩国假单胞菌Pseudomonas2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC N0.8395，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中国科学院微生物研究所，该韩国假单胞菌的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种韩国假单胞菌菌株在制备内消旋酒石酸或其盐中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现: 先在种子培养基中培养所述韩国假单胞菌的种子液；然后将所述韩国假单胞菌的种子液转接入产酶培养基中，培养获得韩国假单胞菌细胞；最后利用所述韩国假单胞菌细胞对反式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成内消旋酒石酸或其盐。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，实现步骤优选为: 将保存于斜面培养基上的韩国假单胞菌BK-9接种于装有种子培养基的三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养24h，得到所述韩国假单胞菌的种子液；然后取上述韩国假单胞菌的种子液接种于装有产酶培养基的三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养48h，获得相应的韩国假单胞菌细胞；接着7000rpm、15min离心收集韩国假单胞菌细胞，将该韩国假单胞菌细胞加入到浓度为0.SM的反式环氧琥珀酸或其盐中，37°C振荡培养，反应48h，得到转化液；最后向转化液中加入过量的CaCl2，形成内消旋酒石酸钙沉淀，过滤得到沉淀并水洗，再对内消旋酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴、阳离子交换柱精制、减压浓缩、结晶、分离和烘干得到内消旋酒石酸或其盐的成品。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，反式环氧琥珀酸盐为反式环氧琥珀酸与各种阳离子所形成的盐，所述阳离子选自钠、钾、铵或钙。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，种子培养基为:葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵lg，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,加水至1000ml，pH7.0 ;产酶培养基为:葡萄糖IOg,牛肉膏5g,磷酸二氢钾Ig,硫酸镁0.1g,氯化铵Ig,反式环氧琥拍酸钠IOg,加水至1000ml, ρΗ7.0。
【文档编号】C12P7/46GK103923866SQ201410174188
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】张建国, 谢志鹏, 张振红, 潘海峰, 鲍文娜 申请人:杭州宝晶生物股份有限公司