白介素6检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种白介素6检测试剂盒。试剂盒包含两株特异性白介素6单克隆抗体。多孔板上包被的单克隆抗体与生物素标记的单克隆抗体以及被测样本的白介素6形成“包被抗体-抗原-生物素标记抗体”的夹心复合物结构。抗体上所标记的生物素与HRP标记的链霉亲和素结合，HRP进而与底物反应产生信号，用以进行白介素6定量分析。通过本发明的试剂盒，使得能够迅速、灵敏地定量检测样本中的白介素6含量。
【专利说明】白介素6检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子免疫学领域，具体涉及一种检测白介素6(IL-6)蛋白含量的试剂盒。
【背景技术】
[0002]机体在受到不同类型的创伤和刺激后会出现一个类似炎症反应的状态，即全身炎症反应综合征(SIRS)。在这一过程中损伤因素刺激机体炎性细胞释放炎症介质。通常情况下，作为防御机制有益于机体创伤后的恢复，并会随着创伤的痊愈而自行消退。然而，如果由于感染、再次损伤等原因使这种炎症反应过度或者反应时间过长，机体合成释放过多的炎症介质，就会引起失控和逐级放大的连锁反应。机体进入一种不良的全身状态，表现出中重度SIRS，随着病情进一步恶化，严重多发伤继发多器官功能不全综合征(MODS)就会序贯发生。因此，创伤、SIRS、MODS在发展上是一个渐进的过程，炎症反应的强度与患者创伤的发展和转归密切相关。
[0003]IL-6是降钙素的前体，生理情况下由甲状腺C细胞合成与分泌。正常情况下，体内不能检测到IL-6的存在，在危重病患者的外周血、肺及肝组织中可被检测到，且被认为对全身性感染具有较好的诊断价值和预警作用。
[0004]IL-6由T淋巴细胞、B淋巴细胞及内皮细胞产生，它能刺激T细胞、B细胞的增殖，并能促进细胞毒性T细胞分化，提高自然杀伤细胞的活力。创伤后不良者早期血液中即可检测到IL-6的异常升高。在SIRS过程中，促炎细胞因子首先被激活，而后促使机体释放IL-6，后者又正反馈于单核巨噬细胞系统和多形核粒细胞，进一步产生更多的各种炎症介质。因此，IL-6在炎症反应中起核心调节作用，是炎症免疫反应的重要介质。
【发明内容】
[0005]根据一些实施方式，提供了一种检测样本中白介素6的ELISA试剂盒，其包含:
[0006]包被有第一白介素6单克隆抗体的多孔板、
[0007]试剂1、
[0008]试剂2、
[0009]试剂3、
[0010]样本稀释液、和
[0011]底物液。
[0012]在一些实施方案中，包被有第一白介素6单克隆抗体的多孔板中第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8796或8797的杂交瘤细胞所产生。
[0013]在一些实施方案中，试剂I也作生物素标记的白介素6单克隆抗体工作液。其包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠，小牛血清、生物素标记的第二白介素6单克隆抗体和防腐剂。在一些实施方案中，第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8797或8796的杂交瘤细胞所产生。第二白介素6单克隆抗体能特异性识别并结合样本中的IL-6，抗体上所标记的生物素与HRP标记的链霉亲和素结合，HRP进而与底物反应产生信号。产生的信号换算成浓度，用于定量分析。在一些实施方案中，试剂I包含5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、和12.5mg/L生物素标记的第二白介素6单克隆抗体。当第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8796的杂交瘤细胞所产生时，第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8797的杂交瘤细胞所产生；或者当第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8796的杂交瘤细胞所产生时，第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCCN0.8797的杂交瘤细胞所产生。
[0014]在一些实施方案中，试剂2用作生物素标记抗体的稀释液、或用作辣根过氧化物酶标记链霉亲和素的稀释液。在一些实施方案中，试剂2包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠，小牛血清、和防腐剂。在具体实施方案中，1000ml的试剂2中包含5.8g磷酸氢二钠、
0.593g磷酸二氢钠、8.0g氯化钠、200ml小牛血清和0.5ml Proclin-300?
[0015]在一些实施方案 中，试剂3用作辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液。在一些实施方案中，试剂3包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、和防腐剂。
[0016]在一些实施方案中，样本稀释液包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、山羊血清、吐温20和防腐剂。在具体实施方案中，1000ml样本稀释液是IOX的，其包括58g/L磷酸氢二钠、5.94g/L磷酸二氢钠、180g/L氯化钠、250ml/L山羊血清、10ml/L吐温20和5ml/L防腐剂。样本稀释液可以配制成浓缩型，也可以不是。技术人员可以理解，其它浓缩倍数也包括在本发明范围内。
[0017]在一些实施方案中，底物液包含:辣根过氧化物酶底物。在具体实施方案中，底物液包含底物液A和底物液B。底物液A是含有过氧化脲的柠檬酸缓冲液。底物液B是含有TMB的柠檬酸缓冲液。
[0018]应当理解，本发明的各试剂可以配制成浓缩型，也可以不是。在一些实施方案中，一些试剂配制成浓缩型，这可以减少运输、储存体积。技术人员可以理解，除了具体实例以外的其它浓缩倍数也包括在本发明范围内。
[0019]在一些实施方案中，样本来自哺乳动物，优选来自人类。样本选自全血、血浆、和血清。在具体实施方案中，样本为人血清。
[0020]在一些实施方案中，本发明的试剂盒还可以根据需要包括校准品。校准品用于标准曲线的绘制。校准品包含已知浓度的白介素6，白介素6浓度在0-1500pg/ml范围内。在具体实施方案中，校准品中白介素6浓度分别为0、10、25、250、750、1500pg/ml。
[0021 ] 在一些实施方案中，本发明的试剂盒还可以根据需要包括质控品。质控品包含已知浓度的白介素6，白介素6浓度在200-1000pg/ml范围内。在具体实施方案中，质控品中白介素 6 浓度分别为 700pg/ml - 900pg/ml ；200pg/ml - 400pg/ml。
[0022]在一些实施方案中，校准品或质控品是已知IL-6浓度的血清；血清可以是任何市售血清、或收集自临床机构的人血清；其经灭活处理，并且抗-TP、HBsAg、抗-HCV和抗-HIV均为阴性。在一些实施方案中，还可以使用阴性血清稀释IL-6纯品来制备校准品或质控品O
[0023]根据一些实施方案，提供了一种白介素6单克隆抗体，其由保藏号为CGMCCN0.8796的杂交瘤细胞所产生。[0024]根据另一些实施方案，提供了一种白介素6单克隆抗体，其由保藏号为CGMCCN0.8797的杂交瘤细胞所产生。
[0025]根据一些实施方案，提供了本发明的白介素6单克隆抗体在制备ELISA诊断试剂中的用途。在一个具体实施方案中，保藏号为CGMCCN0.8796和8797的杂交瘤细胞所产生2株白介素6单克隆抗体共同用于制备ELISA诊断试剂。
[0026]根据一些实施方案，提供了保藏号为CGMCC N0.8796的杂交瘤细胞。
[0027]根据另一些实施方案，提供了保藏号为CGMCC N0.8797的杂交瘤细胞。
【具体实施方式】
[0028]为了使本发明易于理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。
[0029]实施例1.1L-6重组蛋白的制备
[0030]从NCBI数据库中获得IL-6编码序列，构建原核表达载体pET32_IL6，诱导表达IL-6重组抗原,经Western印迹分析蛋白有免疫反应,镍亲和层析柱纯化大量制备IL-6重组蛋白，该蛋白可以用于抗体的制备。
[0031]1.pET28-1L-6表达载体构建
[0032]IL-6基因购买于武汉三鹰生物技术有限公司，参照IL-6cDNA序列设计引物:
[0033]IL-6-F:cgggatccccagtacccccaggag(SEQ ID N0.1)和
[0034]IL-6-R:ccgctcgagctacatttgccgaag(SEQ ID N0.2)。
[0035]PCR扩增IL-6基因，PCR体系:
[0036]
【权利要求】
1.一种检测样本中白介素6的ELISA试剂盒，其包含: 包被有第一白介素6单克隆抗体的多孔板、 试剂1、 试剂2、 试剂3、 样本稀释液、和 底物液； 其中: 试剂I包含:磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、生物素标记的第二白介素6单克隆抗体、和防腐剂； 试剂2包含:磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、和防腐剂； 试剂3包含:磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、和防腐剂； 样本稀释液包含:磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、山羊血清、吐温20和防腐剂； 底物液包含:辣根过氧化物酶底物； 当第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8796的杂交瘤细胞所产生时，第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8797的杂交瘤细胞所产生；或者当第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8796的杂交瘤细胞所产生时，第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8797的杂交瘤细胞所产生； 样本来自哺乳动物，优选人类，样本选自全血、血浆和血清。
2.根据权利要求1所述的检测样本中白介素6的ELISA试剂盒，还包括: 校准品，校准品包含已知浓度的白介素6，白介素6浓度在0-1500pg/ml范围内。
3.根据权利要求1所述的检测样本中白介素6的ELISA试剂盒，还包括质控品，质控品包含已知浓度的白介素6，白介素6浓度在200-1000pg/ml范围内。
4.一种检测样本中白介素6的ELISA试剂盒，其包含: 包被有第一白介素6单克隆抗体的多孔板、 试剂1、 试剂2、 试剂3、 样本稀释液、和 底物液； 其中: 试剂I包含:5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、和12.5mg/L生物素标记的第二白介素6单克隆抗体；
试剂2包含:5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、和 0.5ml/L Proclin-300 ； 试剂3包含:5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、和12mg/L辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素； 样本稀释液包含:58g/L磷酸氢二钠、5.94g/L磷酸二氢钠、180g/L氯化钠、250ml/L山羊血清、lOml/L吐温20和5ml/L防腐剂； 底物液由底物液A和底物液B组成，底物液A含有过氧化脲和柠檬酸缓冲液，底物液B含有四甲基联苯胺和柠檬酸缓冲液； 当第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8796的杂交瘤细胞所产生时，第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8797的杂交瘤细胞所产生；或者当第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8796的杂交瘤细胞所产生时，第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.8797的杂交瘤细胞所产生。
5.一种白介素6单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC N0.8796的杂交瘤细胞所产生。
6.一种白介素6单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC N0.8797的杂交瘤细胞所产生。
7.如下两株白介素6单克隆抗体的组合在制备ELISA诊断试剂中的用途: 由保藏号为CGMCC N0.8796的杂交瘤细胞所产生的白介素6单克隆抗体、以及由保藏号为CGMCC N0.8797的杂交瘤细胞所产生的白介素6单克隆抗体。
8.一种杂交瘤细胞， 其选自保藏号为CGMCC N0.8796 JPCGMCC N0.8797的杂交瘤细胞。
【文档编号】C12N5/20GK103969438SQ201410176133
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】于晖, 李雨心, 王旭, 陈勤慧, 李鑫, 刘琦, 李丽萍 申请人:北京普恩光德生物科技开发有限公司