一株丝枝霉菌株及其生产β-葡萄糖苷酶的方法
【专利摘要】一株丝枝霉菌株及其生产β-葡萄糖苷酶的方法，属于食品生物【技术领域】。本发明提供一株新的可产β-葡萄糖苷酶的丝枝霉菌株，该丝枝霉菌株命名为丝枝霉（Aphanocladiumsp.）SK34.001，保藏号为CCTCCNO：M2014090。本发明对β-葡萄糖苷酶产生菌丝枝霉进行斜面、种子、发酵三级培养；从发酵液中分离纯化得到β-葡萄糖苷酶酶粉。本发明提供的利用丝枝霉（Aphanocladiumsp.）SK34.001生产β-葡萄糖苷酶的方法，其发酵工艺简单；酶易于提取；酶活高，酶性质稳定；可直接利用麸皮等废弃资源作为该菌株的培养基碳源，节省能源消耗，降低生产成本，具有广阔的市场应用前景。
【专利说明】一株丝枝霉菌株及其生产β-葡萄糖苷酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株丝枝霉菌株及其生产β-葡萄糖苷酶的方法，属于食品生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]β -葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)，也称β -D-葡萄糖苷酶，它能够水解结合于底物末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、霉菌及细菌体内，它参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用。
[0003]β -葡萄糖苷酶在自然界广泛分布，几乎在所有的生物体中都有存在，但来源不同，其性质各异。该酶对糖苷非糖部分的专一性不强，能水解许多β型的糖苷键。
[0004]β_葡萄糖苷酶除主要用于降解纤维素以外，还可应用于乳品工业来分解乳糖；催化葡萄糖发生转移反应和缩合反应合成功能性低聚糖，如低聚龙胆糖；作为风味酶应用于(果)酒、茶叶、果汁中起到增香或脱苦作用；另外，β_葡萄糖苷酶还可用来水解大豆异黄酮，制备高活性的大豆异黄酮苷元产品。
[0005]目前，国内外用于研究和制备葡萄糖苷酶的微生物主要有木霉属{Trichoderma)和曲霉属{Aspergillus)。研究表明,许多曲霉属是生产高活力β _葡萄糖苷酶的优良菌株，且 被认为是不会产生毒素的纤维素酶产生菌，因而研究比较深入。迄今为止，还没有丝枝霉iAphanocladium)作为β -葡萄糖苷酶产生菌的相关研究报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种丝枝霉菌株及其生产葡萄糖苷酶的方法。
[0007]本发明的技术方案，一株丝枝霉菌株，是本发明人等先前从腐殖土壤样品中分离筛选得到的一株可以高产β_葡萄糖苷酶的丝枝霉菌株，分类命名为丝枝霉Uphanocladium sp.)SK34.001，其保藏号为CCTCC NO:M 2014090，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
[0008]所述菌株的核糖体DNA ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]所述丝枝霉菌株CCTCC NO:M 2014090生产β -葡萄糖苷酶的方法，步骤如下:
(1)斜面培养:取丝枝霉菌株CCTCCNO:Μ 2014090进行斜面培养，采用PDA培养基，各组分以g/L计:马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15~20 ;自然pH，115°C下灭菌30min ;培养温度为25~35°C，培养时间3~8天；
(2)种子培养:采用牛肉膏蛋白胨培养基，各组分以g/L计:牛肉膏2~5，胰蛋白胨5~8，氯化钠2~5，自然pH，121°C灭菌20min ;在250mL三角瓶装液3(T50mL，将步骤(1)所得的斜面培养液进行种子培养，摇瓶转速15(T200rpm，培养温度25~35°C，培养时间18~24h ；
(3)发酵培养:发酵培养基组分以g/L计:麸皮20-40，硫酸铵4飞，磷酸二氢钾2~3，硫酸镁0.3^0.5，氯化钙0.3^0.5，自然pH，121°C灭菌20min ;步骤(2)所得的种子培养液按体积百分数2%~5%接种量接种于发酵培养基中，摇瓶转速15(T200rpm，培养温度25~35°C，培养时间31天；
(4)β-葡萄糖苷酶酶粉制备:将步骤(3)制得的发酵液在5000- 10000rpm离心IOlOmin或过滤去除菌体即得发酵上清液，经超滤除去盐和杂蛋白，再经硫酸铵沉淀、透析，最后将透析液进行冷冻干燥即得β-葡萄糖苷酶酶粉。
[0010]本发明中的β-葡萄糖苷酶活性，是通过使酶作用于对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(PNPG)，分解所生成的对硝基苯酚的量而测定。该酶的单位定义为每分钟生成I μ mol对硝
基苯酚的酶量。
[0011]本发明的有益效果:本发明为首次采用丝枝霉(AphanocIadium)作为β -葡萄糖苷酶的产生菌，该菌株培养方便，发酵工艺简单。其所产酶为胞外酶，易于提取，酶活高，酶性质稳定，可直接利用麸皮等废弃资源作为丝枝霉(Aphanocladiuni)的培养基碳源,节省能源消耗，降低生产成本，具有广阔的市场应用前景。
[0012]生物材料样品保藏:一株丝枝霉菌株,分类命名为丝枝霉sp.)SK34.001，该菌株已于2014年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址:中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2014090。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
将丝枝霉菌株(Aphanocladium sp.) SK34.001在下述条件下进行发酵:
斜面培养:采用PDA培养基，各组分以g/L计:马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，自然pH，115°C灭菌30min。培养条件为:培养温度30°C，培养时间5天；
种子培养:采用牛肉膏蛋白胨培养基，各组分以g/L计:牛肉膏2.5，胰蛋白胨5.0，氯化钠2.5，自然pH，121°C灭菌20min。培养条件为:250mL三角瓶装液30mL，摇瓶转速200rpm,培养温度30°C，培养时间24h ；
发酵培养:发酵培养基组分以g/L计:麸皮35，硫酸铵4.0,磷酸二氢钾2.0,硫酸镁
0.3，氯化钙0.3，自然pH，121°C灭菌20min。培养条件为:种子培养液按体积百分数2%接种量接种于发酵培养基中，摇瓶转速150rpm，培养温度30°C，培养时间7天，得到发酵液的酶活为5U/mL。
[0014]实施例2
β-葡萄糖苷酶酶粉制备:
将实施例1制得的发酵液在8000rpm的转速下离心30min去除菌体即得发酵上清液，经超滤除去盐和杂蛋白，再经硫酸铵沉淀、透析，最后将透析液进行冷冻干燥即得葡萄糖苷酶酶粉。
【权利要求】
1.一株丝枝霉菌株,其分类命名为丝枝霉sp.)SK34.001,其保藏号为CCTCC NO:M 2014090，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
2.根据权利要求1所述丝枝霉菌株,其特征在于:所述菌株的核糖体DNAITS序列如SEQ ID NO:1 所示。
3.权利要求1所述丝枝霉菌株CCTCCNO:M 2014090生产β -葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤如下: (1)斜面培养:取丝枝霉菌株CCTCCNO:Μ 2014090进行斜面培养，采用PDA培养基，各组分以g/L计:马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15~20 ；自然pH，115°C下灭菌30min ;培养温度为25~35°C，培养时间3~8天； (2)种子培养:采用牛肉膏蛋白胨培养基，各组分以g/L计:牛肉膏2~5，胰蛋白胨5~8，氯化钠2~5，自然pH，121°C灭菌20min ；250mL三角瓶装液3(T50mL，将步骤(1)所得的斜面培养液进行种子培养，摇瓶转速15(T200rpm，培养温度25~35°C，培养时间18~24h ； (3)发酵培养:发酵培养基组分以g/L计:麸皮20-40，硫酸铵4飞，磷酸二氢钾2~3，硫酸镁0.3^0.5，氯化钙0.3^0.5，自然pH，121°C灭菌20min ;步骤(2)所得的种子培养液按体积百分数2%~5%接种量接种于发酵培养基中，摇瓶转速15(T200rpm，培养温度25~35°C，培养时间31天； (4)β-葡萄糖苷酶酶粉制备:将步骤(3)制得的发酵液在5000- I OOOOrpm离心10~3Omin或过滤去除菌体即得发酵上清液，经超滤除去盐和杂蛋白，再经硫酸铵沉淀、透析，最后将透析液进行冷冻干燥即得β-葡萄糖苷酶酶粉。
【文档编号】C12R1/645GK103937692SQ201410179291
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】江波, 张涛, 周林芳, 沐万孟, 缪铭 申请人:江南大学