治疗和诊断年龄相关性黄斑变性的方法和试剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及与AMD危险提高或降低相关的因子H基因多态性和单元型。本发明提供了诊断和治疗AMD的方法和试剂。
【专利说明】治疗和诊断年龄相关性黄斑变性的方法和试剂
[0001]本申请是发明人于2006年2月14日提交的题为“治疗和诊断年龄相关性黄斑变性的方法和试剂”的中国专利申请200680012494.9的分案申请。
[0002]相关文献的交叉参考
[0003]本申请要求U.S.临时申请N0.60/650, 078 (2005年2月14日提交)、60/717,861(2005 年 9 月 16 日提交)、60/715，503 (2005 年 9 月 9 日提交)和60/735，697 (2005年11月9日提交)的权益，所述文献均以其全部内容引入本文为参考。
[0004]联邦资助的研发中产生的发明的权利陈述
[0005]本申请所述工作部分由NIH眼科研究院基金EY11515资助。美国政府拥有本发明的某些权利。 【背景技术】
[0006]年龄相关性黄斑变性(AMD)是发达国家中引起不可逆失明的最主要原因(综述参阅，Zarbin, 1998, 2004 ;Klein 等，2004 ；Ambati 等，2003 ；de Jong, 2004 ；van Leeuwen 等，
2003)，影响约15%的60岁以上个体。估计有6亿个体在这一年龄统计范围内。AMD的患病数随年龄提高，在75岁及以上的群体中，轻度或早期形式在近30%的个体中发生，高级形式在约7%的个体中发生(Klein等，1992 ;Vingerling等，1995a，1995b)。在临床上，AMD的特征为由黄斑中发生的退化性变化引起的渐进性中央视觉丧失，黄斑是视网膜神经中的特化区域及其下层组织。在最严重或渗出性的疾病形式下，来自脉络膜脉管系统的新生血管叶突破了 Bruch膜和视网膜色素上皮(RPE)，一般引起视网膜脱落和其后的变性。
[0007]AMD作为迟发性复合疾病，似乎由遗传和环境因素的组合引起和/或调节(Seddon和Chen，2004 ;Tuo等，2004 ；Klein和Francis，2003)。家族性聚集研究估计遗传组分主要参与了多达25%的疾病(Klaver等，1998a)。根据流行的假说，多数AMD病例不是多种单基因病症的集合，而是代表定量的表型、表示多种易患基因座的相互作用。所涉及的基因座数、所赋予的归因危险度和多个基因座之间的相互作用仍不清楚。
[0008]连锁和候选基因筛选分析已经对AMD的遗传学提供了有限的了解。已经报道了一个增加危险的基因，ABCA4 (Allikmets等，1997)和一个降低危险的基因，ApoE4 (Klaver等，1998b，Souied等，1998)对AMD的可靠关联。，此外，一些小组报道了全基因组连锁分析的结果(综述于Tuo等，2004 ;Weeks等，2004)。已经证明了一个有AMD表型的家族与特定染色体区域Iq25_q31 (ARMDl)的连锁(Klein等，1998)。已经提出HEMICENTIN-l基因为致病基因(Schultz等，2003)，尽管其作用还没有可靠地得到确认。若干研究(Weeks等，2001 ;Iyengar等，2003 ;Weeks等，2004)中染色体Iq上重叠基因座的鉴定提示该基因座可能包含一个或多个AMD相关基因。
[0009]最近对玻璃疣(与AMD发病相关的特征性眼损伤)的研究已经指出了炎症和其他免疫介导过程(特别是补体活化)在AMD早期和晚期形式的病因学中的作用(Hageman等，1999,2001 ；Mullins 等，2000,2001 ;Russell 等，2000 ;Anderson 等，2002，2004 Johnson等,2000, 2001 ；Crabb 等,2002 ；Ambati 等,2003 ；Penfold 等,2001 ；Espinosa-Heidman 等，2003)。这些研究已经揭示了沿着bruch膜(由弹性蛋白质和胶原组成的分隔RPE和脉络膜的细胞外层)的玻璃疣中和RPE细胞上的玻璃疣中的末端途径补体组分(C5、C6、C7、C8和C9)和末端途径的活化特异性补体蛋白质片段(C3b、iC3b、C3dg和C5b-9)以及多种补体途径调节子和抑制子(包括因子H、因子1、因子0、CD55和CD59) (Johnson等，2000，2001 ；Mullins等2000，2001 ;Crabb等，2002)。许多这些玻璃疣相关分子先前认为是主要由肝合成的循环血浆蛋白质。有趣的是，许多这些玻璃疣相关分子似乎还由RPE和/或脉络膜细胞局部合成。
[0010]补体系统的活化在正常宿主的防御和损伤应答中发挥关键作用(Kinoshita，1991)。这一系统的不适当活化和/或控制(常由特异性补体相关基因的突变引起)可引起自身免疫后遗症和局部组织破坏(Holers, 2003 ；Liszewski and Atkinson, 1991 ；Morganand Walport, 1991 ；Shen and Meri, 2003),就像动脉粥样硬化(Torzewski 等，1997 ；Niculescu等，1999)、阿尔茨海默病(Akiyama等,2000)和肾小球肾炎(Schwertz等,2001)中所显示的那样。
[0011]2型膜性增生性肾小球肾炎(MPGN II) 一种罕见疾病，与补体级联系统旁路途径的非受控系统性活化相关。该疾病的特征为肾小球基底膜中异常电子密度物质的沉积，最终导致肾衰竭，其中所述异常电子密度物质由补体旁路途径中涉及的蛋白质C3和C3c组成。有趣的是，许多MPGNII患者发生了斑状玻璃疣、RPE脱离和脉络膜新生血管膜，它们在临床上和组成上均与AMD中形成的有所不同，尽管它们常在十至二十岁中检测到(Mullins等，2001 ；0 ' Brien 等，1993 ；Huang 等，2003 ；Colville 等，2003 ；DuvalI — Young 等，1989a, 1989b ；Raines 等，1989 ；Leys 等，1990 ；McAvoy and Silvestri, 2004 ；Bennett 等，1989 ；0rth and Ri tz, 1998 ；Habib 等，1975)。
[0012]在多数MPGNII患者中，补体级联系统的调节失能是由针对C3bBb的自身抗体介导的。然而，其他MPGNII患者在因子H中存在突变(Ault等，1997 ;Dragon_Durey等，
2004)，因子H是旁路补体途径的主要抑制子。因子H中的点突变(I1166R)在约克猪中引起MPGNII (Jansen等，1998)，因子H缺陷型小鼠发生严重肾小球肾炎(Pickering等，2002)。此外，一些患MPGNIII的扩大家族(相关疾病)的患病个体显示对染色体lq31_32的连锁(Neary等，2002)，lq31_32是与在AMD的全基因组连锁研究(见上文)中已经鉴定的基因座重叠的区域。这一特定基因座包含大量补体途径相关基因。这些基因的一个组称为补体活化调节子(RCA)基因簇，含有编码因子H、五种因子H相关基因(CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)和凝固因子XIII β亚基的基因。补体途径相关基因的第二个簇与lq25_31基因座毗邻，包括 C4BPA、C4BPB、C4BPAL2、DAF(CD55) CR1、CR2、CRlL 和 MCP (CD46)。
[0013]发明概述
[0014]本发明涉及补体因子H基因的多态性和单元型，所述基因与年龄相关性黄斑变性(AMD)和2型膜性增生性肾小球肾炎(MPGNII)的发生相关。本发明还涉及补体因子H相关5(CFHR5)基因的多态性和单元型，所述基因与AMD和MPGNII的发生相关。本发明提供诊断、监测和治疗这些以及其他疾病的方法。
[0015]在一方面中，本发明提供用于确定受试者发生年龄相关性黄斑变性(AMD)的倾向的诊断方法，所述方法包括检测因子H基因多个多态性位点中变异的存在与否。在一个实施方案中，本发明提供诊断对发生AMD的易感性增加的方法，包括检测个体中因子H基因多态性的存在与否。该方法可包括获得来自个体的DNA和分析来自该个体的DNA以确定该DNA是否在因子H基因中含有多态性。某些多态性指示，该个体与对照群体相比发生AMD的易感性增加。某些多态性指示该个体发生AMD的可能性降低。某些多态性指示该个体发生AMD的可能性既没有增加也没有降低。
[0016]在一个实施方案中，受试者发生年龄相关性黄斑变性(AMD)的倾向的诊断方法包括获得来自该受试者的DNA样品和检测该患者的DNA中是否存在与发生AMD相关的多态性，存在该多态性指示该受试者发生AMD的倾向提高，不存在该多态性指示该受试者发生AMD的倾向降低。
[0017]在相关的方面中，本发明提供诊断对发生AMD的易感性的方法，包括确定个体的因子H单元型。该方法包括获得来自个体的DNA和分析该个体的DNA以确定其因子H单元型。某些单元型(危险单元型)指示该个体对发生AMD的易感性提高。某些单元型(保护性单元型)指示该个体对发生AMD的易感性降低。某些单元型(中性单元型)指示该个体对发生AMD的可能性既不提高也不降低。
[0018]在相关的实施方案中，通过分析该基因编码的基因产物(如RNA或因子H蛋白质(如蛋白质同种型))来确定因子H基因的多态性位点中变异的存在与否。变体蛋白质的表达指示因子H基因的变异，并可指示提高或降低的发生AMD的倾向。可以使用免疫测定和其他方法检测蛋白质。[0019]在另一相关的实施方案中，本发明提供通过检测个体生物样品中的变体因子H多肽来诊断发生AMD或其他疾病的易感性的方法。在一个实施方案中，使用基于抗体的测定诊断个体中的AMD或其他疾病，其中使该个体的生物样品(如血清样品)接触抗体并检测变体因子H多肽的存在与否。在实施方案中，该抗体与变体因子H多肽特异性表位(即在野生型因子H多肽中未发现)特异性相互作用。在实施方案中，使用基于分离的测定(如PAGE)诊断个体中的AMD或其他疾病，其中检测个体的生物样品(如血清样品)中变体因子H多肽的存在与否。
[0020]在一个方面中，本发明提供通过调节因子H的类型和/或全身和/或眼水平的量来治疗患AMD (如其中检测到指示发生症状AMD的危险提高的多态性或单元型的个体)或其他变体因子H基因相关疾病的个体的方法。该因子H多肽可以是野生型因子H多肽或变体因子H多肽。该因子H多肽可以是这样的因子H多肽，即其具有中性或保护性等位基因而不是危险单元型相关等位基因编码的序列。在一个实施方案中，该方法包括对个体施用有效量的因子H多肽，以降低疾病症状。在一个实施方案中，该方法包括对个体施用有效量的因子H多肽，以降低发生疾病症状的倾向并延缓疾病的发生和发展。在一个实施方案中，该方法包括施用包含因子H的血液。在一个实施方案中，该方法包括施用核酸(如转基因)，所述核酸包含编码因子H多肽的核苷酸序列。在一个实施方案中，该方法包括施用表达因子H多肽的细胞。
[0021]在一个方面中，本发明提供治疗患AMD(如其中检测到指示发生症状AMD的危险提高的多态性或单元型的个体)或其他变体因子H基因相关疾病的个体的方法。在一个实施方案中，该方法包括对患者施用有效量的降低变体因子H的量或编码因子H的基因表达的物质，以减少患者的疾病症状。在相关实施方案中，对个体施用治疗量的变体因子H多肽抑制剂(如灭活剂)。[0022]在一个实施方案中,对个体施用抑制性核酸(如与变体因子H多肽的核苷酸序列至少部分互补的RNA)。在一个实施方案中，施用纯化的反义RNA，其与编码变体因子H多肽的RNA互补。
[0023]在另一实施方案中，对个体施用治疗量的抗CFH抗体，所述抗体足以部分灭活变体因子H多肽。
[0024]在另一实施方案中，治疗个体以从血中除去因子H的有害形式(如通过血浆去除术、抗体指导的血浆去除术或与因子H结合部分如肝素的复合)。
[0025]在一个方面中，本发明提供编码变体因子H多肽的纯化DNA、编码变体因子H多肽的纯化RNA，与编码变体因子H多肽的RNA互补的纯化反义RNA以及纯化的变体因子H多肽。在相关方面中，本发明提供用于表达野生型或变体因子H多肽或因子H生物活性片段的核酸。
[0026]在一个方面中，本发明提供包含编码因子H多肽的核酸的基因治疗载体。该载体可包括驱动因子H基因在多种细胞类型中表达的启动子。备选地，该载体可包括驱动因子H基因仅在特定细胞 类型(如视网膜细胞或肾细胞)中表达的启动子。在一个方面中提供了含有编码因子H蛋白质的基因治疗载体和可药用赋形剂的药物组合物，其中该组合物不含有病原体，并适于对人类患者施用。在一个实施方案中，所编码的因子H多肽为保护性变体。
[0027]在一个方面中，本发明提供含有重组或纯化的因子H多肽的组合物，其中所述多肽为保护性多肽。
[0028]在相关方面中，本发明提供含有重组或纯化的因子H多肽和可药用赋形剂的药物组合物，其中所述组合物不含有病原体，并适于对人类患者施用。在一个实施方案中，编码的因子H多肽具有野生型序列。在一个实施方案中，编码的因子H多肽为保护性变体。
[0029]在一个方面中，本发明提供抗体，所述抗体与变体因子H多肽而不是野生型因子H多肽特异性相互作用。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并可通过消减技术获得。这些抗体足以灭活变体因子H多肽。在相关方面中，本发明提供含有抗因子H抗体和可药用赋形剂的药物组合物，其中所述组合物不含有病原体，并适于对人类患者施用。
[0030]在一个方面中，本发明提供鉴定与发生AMD的危险提高或降低相关的变体因子H蛋白质的方法。在一个实施方案中，本发明提供鉴定保护性因子H蛋白质的方法，所述方法通过(a)鉴定具有保护性单元型的个体，和(b)确定在个体基因组中编码的因子H的氨基酸序列，其中保护性因子H蛋白质由具有保护性单元型的等位基因编码。在一个实施方案中，本发明提供鉴定中性因子H蛋白质的方法，所述方法通过(a)鉴定具有中性单元型的个体，和(b)确定在个体基因组中编码的因子H的氨基酸序列，其中中性因子H蛋白质由具有中性单元型的等位基因编码。在相关实施方案中，本发明提供鉴定与发生AMD的危险降低相关的因子H变体形式的方法，包括(a)鉴定具有与发生AMD的危险降低相关的单元型或二倍型(diplotype)的个体；(b)获得来自个体的基因组DNA或RNA ;和(c)确定在个体基因组中编码的因子H的氨基酸序列，其中保护性因子H蛋白质由具有与发生AMD的危险降低相关的等位基因编码。在实施方案中，所述保护性或中性因子H蛋白质不具有野生型因子H多肽的氨基酸序列。
[0031]在相关方法中，鉴定与发生AMD的危险提高相关的因子H形式，是通过(a)鉴定具危险单元型的个体；和(b)确定在个体基因组中编码的因子H的氨基酸序列，其中危险因子H蛋白质由具危险单元型的等位基因编码。在相关实施方案中，本发明提供了鉴定与发生AMD的危险提高相关的因子H的变体形式的方法，包括(a)鉴定具有与发生AMD的危险提高相关的单元型或二倍型的个体；(b)获得来自该个体的基因组DNA或RNA ;和(c)确定在个体基因组中编码的因子H的氨基酸序列，其中危险因子H蛋白质由具有与发生AMD的危险提高相关的单元型的等位基因编码。在实施方案中，所述危险因子H蛋白质不具有野生型因子H多肽的氨基酸序列。
[0032]在一个方面中，本发明提供诊断发生AMD或其他疾病的倾向或易感性的方法，所述方法通过检测患者的生物样品中全长因子H与截短因子H的比值。在一个实施方案中，诊断受试者中发生AMD的倾向或易感性的方法包括获得来自受试者的RNA样品和检测患者RNA中外显子10(即全长因子H)与外显子10A(即截短的因子H)表达的比值，比值提高指示该受试者发生AMD的倾向或易感性提高，比值降低指示该受试者发生AMD的倾向或易感性降低。在一个实施方案中，诊断受试者中发生AMD的倾向或易感性的方法包括获得来自受试者的蛋白质样品和检测患者蛋白质中全长因子H与截短的因子H的表达比值，比值提高指示该受试者发生AMD的倾向或易感性提高，比值降低指示该受试者发生AMD的倾向或易感性降低。
[0033]在一个方面中，本发明提供细胞，所述细胞含有编码因子H蛋白质或其片段的重组或纯化核酸，例如来自因子H基因的核酸。细胞可以为细菌或酵母或用于研究和药物开发的任何其他细胞。因此，本发明提供表达重组变体人因子H的分离宿主细胞或细胞系。在实施方案中，变体是危险变体且第402位氨基酸具有组氨酸。在实施方案中，变体是保护性变体且第62位氨基酸为异亮氨酸。在实施方案中，变体为中性变体。在实施方案中，所述危险、保护性或中性变体因子H蛋白质不具有野生型因子H多肽的氨基酸序列。 [0034]在一个方面中，本发明提供转基因非人动物，其体细胞和生殖细胞含有编码人变体因子H多肽的转基因。本发明的转基因动物可用作AMD模型和用于筛选治疗AMD的有用物质。动物可以是小鼠、虫或用于研究和药物开发(如重组产生因子H)的任何其他动物。在实施方案中，该因子H为变体人因子H，其中所述变体的第62位氨基酸为异亮氨酸或第402位氨基酸为组氨酸。
[0035]在一个方面中，本发明提供筛选多态性位点的方法，所述多态性位点与表1A、1B和IC所述因子H基因中的多态性位点连锁。这些方法包括鉴定基因中与因子H基因多态性位点连锁的多态性位点，其中因子H基因中多态性位点的多态性形式与AMD相关；确定个体群中的单元型，以指示该连锁的多态性位点是否具有与因子H基因的多态性形式平衡一不平衡的多态性形式，其中因子H基因的多态性形式与AMD表型相关。
[0036]在一个方面中，本发明提供MPGNII的诊断、治疗和筛选方法，如上述对AMD进行。
[0037]在一个方面中，本发明提供用于确定受试者发生AMD或MPGNII的倾向的方法，包括检测CFHR5基因的一个或多个多态性位点中是否存在一个或多个变异。在一个实施方案中，本发明提供诊断对发生AMD或MPGNII的易感性提高的方法，包括检测个体CFHR5基因中是否存在多态性。该方法可包括获得自个体的DNA和分析来自该个体的DNA以确定该DNA是否在CFHR5基因中含有多态性。某些多态性指示个体对发生AMD或MPGNII的易感性提高。某些多态性指示个体发生AMD或MPGNII的可能性降低。某些多态性指示个体发生AMD或MPGNII的可能性既不提高也不降低。
[0038]在一个实施方案中，诊断受试者中发生AMD或MPGNII的倾向的方法包括从受试者获得DNA样品和检测该患者的DNA中是否存在与发生AMD或MPGNII相关的多态性，存在该多态性指示该受试者发生AMD或MPGNII的倾向提高,不存在该多态性指示该受试者发生AMD或MPGNII的倾向降低。
[0039]在相关的实施方案中，通过分析基因产物(如RNA或该基因编码的CFHR5蛋白质(如蛋白质同种型))确定CFHR5基因多态性位点处的变异存在与否。变体蛋白质的表达指示CFHR5基因中的变异，并可指示发生AMD或MPGNII的倾向提高或降低。可以使用免疫测定和其他方法检测蛋白质。
[0040]在相关方面中，本发明提供诊断对发生AMD或MPGNII的易感性的方法，包括确定个体的CFHR5单元型。该方法包括获得来自个体的DNA和分析该个体的DNA以确定其CFHR5单元型。某些单元型(危险单元型)指示个体具有比对照群提高的对发生AMD或MPGNII的易感性。某些单元型(保护性单元型)指示该个体具有降低的对发生AMD或MPGNII的易感性。某些单元型(中性单元型)指示该个体发生AMD或MPGNII的可能性既不提高也不降低。[0041]在另一相关方面中，本发明提供通过检测个体的生物样品中变体CFHR5多肽来诊断对发生AMD或MPGNII或其他疾病的易感性的方法。在一个实施方案中，使用基于抗体的测定诊断个体中的AMD或MPGNII或其他疾病，其中通过使个体的生物样品(如血清样品)接触该抗体并检测是否存在该变体CFHR5多肽。在实施方案中，该抗体与变体CFHR5多肽特异性表位(即在野生型CFHR5多肽中未发现的)特异性相互作用。在实施方案中，使用基于分离的测定(如PAGE)诊断个体中的MPGNII或其他疾病，这是通过检测该个体的生物样品(如血清样品)中是否存在该变体CFHR5多肽。可以使用多种类型的免疫测定形式来测定样品中的CFH或CFHR5的多肽或蛋白质。包括夹层ELISA、放射性免疫测定、荧光免疫测定、免疫组织化学测定、点印迹、量杆(dip-stick)和Western印迹。
[0042]在一个方面中，本发明提供通过调节CFHR5的类型和/或全身性和/或肾水平的量来治疗个体的方法，所述个体患有AMD或MPGNII (如其中检测到指示发生AMD或MPGNII症状的危险提高的多态性或单元型的个体)或与变体CFHR5基因相关的其他疾病，或者有患病危险。CFHR5多肽可以是中性或保护性等位基因而不是与危险单元型相关的等位基因所编码的CFHR5多肽。在一个实施方案中，该方法包括以有效降低疾病症状的量对个体施用CFHR5多肽。在一个实施方案中，该方法包括以有效降低发生疾病症状的倾向和延缓疾病的发生或发展的量对个体施用CFHR5多肽。在一个实施方案中，该方法包括施用含有CFHR5的血。在一个实施方案中，该方法包括施用包含编码CFHR5多肽的核苷酸序列的核酸(如转基因)。
[0043]在一个方面中，本发明提供治疗个体的方法，所述个体患有AMD或MPGNII (如检测到指示发生AMD或MPGNII症状的危险提高的多态性或单元型的个体)或与变体CFHR5基因相关的其他疾病。在一个实施方案中，该方法包括以有效降低患者中疾病症状的量对患者施用物质，所述物质降低变体CFHR5的量或编码CFHR5的基因的表达。CFHR5多肽可以是野生型CFHR5多肽或变体CFHR5多肽。
[0044]在一个实施方案中，对个体施用抑制性核酸(如与变体CFHR5多肽的核苷酸序列至少部分互补的RNA)。在一个实施方案中，施用与编码变体CFHR5多肽的RNA互补的纯化的反义RNA。
[0045]在另一实施方案中，对个体施用治疗量的抗CFHR5抗体，所述抗体足以使该变体CFHR5多肽部分失活。
[0046]在相关的实施方案中，对个体施用治疗量的变体CFHR5多肽抑制剂(如灭活剂)。
[0047]在另一实施方案中，治疗个体以从血中除去CFHR5的有害形式(如通过血浆去除术、抗体指导的血浆去除术或与CFHR5结合部分如肝素的复合)。
[0048]在一个方面中，本发明提供编码变体CFHR5多肽的纯化DNA、编码变体CFHR5多肽的纯化RNA、与编码变体CFHR5多肽的RNA互补的纯化的反义RNA以及纯化的变体CFHR5多肽。在相关方面中，本发明提供用于表达野生型或变体CFHR5多肽或CFHR5的生物活性片段的核酸。
[0049]在一个方面中，本发明提供包含编码CFHR5多肽的核酸的基因治疗载体。该载体可包括驱动CFHR5基因在多种细胞类型中表达的启动子。备选地，该载体可包括驱动CFHR5基因仅在特定细胞类型(例如视网膜细胞或肾细胞(如内皮细胞、肾系膜细胞、足细胞))中表达的启动子。在一个方面中，本发明提供含有编码CFHR5蛋白质的基因治疗载体和可药用赋形剂的药物组合物，其中该组合物不含病原体，并适于对人类患者施用。在一个实施方案中，编码的CFHR5多肽为保护性变体。
[0050]在一个方面中，本发明提供含有重组或纯化的CFHR5多肽的组合物，其中该多肽为保护性变体。 [0051]在相关方面中，本发明提供含有重组或纯化的CFHR5多肽和可药用赋形剂的药物组合物，其中该组合物不含病原体，并适于对人类患者施用。在一个实施方案中，编码的CFHR5多肽为野生型序列。在一个实施方案中，编码的CFHR5多肽为保护性变体。
[0052]在一个方面中，本发明提供与变体CFHR5多肽特异性相互作用而不与野生型CFHR5多肽相互作用的抗体。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并都可通过消减技术获得。这些抗体可以足以灭活变体CFHR5多肽。在相关方面中，本发明提供含有抗CFHR5抗体和可药用赋形剂的药物组合物，其中该组合物不含病原体，并适于对人类患者施用。
[0053]在一个方面中，本发明提供鉴定与发生AMD或MPGNII的危险提高或降低相关的变体CFHR5蛋白质的方法。在一个实施方案中，本发明提供鉴定保护性CFHR5蛋白质的方法，所述方法通过(a)鉴定具有保护性单元型的个体，和(b)确定在个体基因组中编码的CFHR5氨基酸序列，其中保护性CFHR5蛋白质由具有保护性单元型的等位基因编码。在一个实施方案中，本发明提供鉴定中性CFHR5蛋白质的方法，所述方法通过(a)鉴定具有保护性单元型的个体，和(b)确定在个体基因组中编码的CFHR5氨基酸序列，其中中性CFHR5蛋白质由具有中性单元型的等位基因编码。在相关实施方案中，本发明提供鉴定与发生AMD或MPGNII的危险降低相关的CFHR5变体形式的方法，包括(a)鉴定具有与发生AMD或MPGNII的危险降低相关的单元型或二倍型的个体；(b)获得来自个体的基因组DNA或RNA;和(c)确定在个体基因组中编码的CFHR5氨基酸序列，其中保护性CFHR5蛋白质由具有与发生AMD或MPGNII的危险降低的单元型的等位基因编码。在实施方案中，保护性或中性CFHR5蛋白质不具有野生型CFHR5多肽的氨基酸序列。
[0054]在相关方法中，鉴定了与发生AMD或MPGNII的危险提高相关的CFHR5形式，所述鉴定通过(a)鉴定具危险单元型的个体和(b)确定在个体基因组中编码的CFHR5氨基酸序列，其中危险CFHR5蛋白质由具危险单元型的等位基因编码。在相关实施方案中，本发明提供鉴定与发生AMD或MPGNII的危险提高相关的CFHR5变体形式，包括(a)鉴定具有与发生AMD或MPGNII的危险提高相关的单元型或二倍型的个体；(b)获得来自该个体的基因组DNA或RNA，和(c)确定在个体基因组中编码的CFHR5氨基酸序列，其中危险CFHR5蛋白质由具有与发生AMD或MPGNII的危险提高相关的单元型的等位基因编码。在实施方案中，危险CFHR5蛋白质不具有野生型CFHR5多肽的氨基酸序列。
[0055]在一个方面中，本发明提供含有重组或纯化的核酸的细胞，所述核酸来自CFHR5基因。该细胞可以为细菌或酵母，或用于研究和药物开发的任何其他细胞。因此，本发明提供表达重组变体人CFHR5的分离的宿主细胞或细胞系。在实施方案中，CFHR5变体为危险变体，并且第46位氨基酸为丝氨酸。在实施方案中，CFHR5变体为中性变体。在实施方案中，危险、保护性或中性变体CFHR5蛋白质不具有野生型CFHR5多肽的氨基酸序列。
[0056]在一个方面中，本发明提供转基因非人动物，其体细胞和生殖细胞含有编码人变体CFHR5多肽的转基因。本发明的转基因动物用作AMD或MPGNII的模型，并用于筛选用于治疗AMD或MPGNII的物质。所述动物可以为小鼠、虫或用于研究和药物开发(如重组产生CFHR5)的任何其他动物。 在实施方案中，CFHR5为变体人CFHR5，其中所述CFHR5变体的第46位氨基酸为丝氨酸。
[0057]在一个方面中，本发明提供筛选与表14或表15中所述CFHR5基因多态性位点连锁的多态性位点的方法。这些方法包括鉴定与CFHR5基因多态性位点连锁的基因中的多态性位点，其中CFHR5基因中多态性位点的多态性形式与AMD或MPGNII相关；以及测定个体群中的单元型，以指示连锁的多态性位点是否具有与AMD或MPGNII表型相关CFHR5基因的多态性形式平衡一不平衡的多态性形式。
[0058]在一个方面中，本发明提供用于分析因子H单元型的试剂盒。该试剂盒可用于诊断患者的AMD。该试剂盒可包括一个或多个因子H、因子H等位基因特异性寡核苷酸(如等位基因特异性引物或探针)或特异性识别因子H多肽的抗体。该因子H等位基因特异性寡核苷酸可包括来自因子H基因编码(外显子)或非编码(启动子、5’未翻译、内含子或3’未翻译)区的序列。该因子H特异性抗体可识别正常或野生型H多肽或变体因子H多肽，其中在该因子H编码区中存在一个或多个非同义单核苷酸多态性(SNP)。该试剂盒可用于诊断AMD以及与因子H基因SNP相关的其他疾病，如MPGNII。作为替代或补充，该试剂盒可包括一个或多个因子H相关5(CFHR5)等位基因特异性寡核苷酸(如引物或探针)或特异性识别CFHR5多肽的抗体。CFHR5等位基因特异性引物和因子H相关5等位基因特异性寡核苷酸可包括来自因子H相关5基因的编码(外显子)或非编码(启动子、5’未翻译、内含子或3’未翻译)区的序列。因子H相关5特异性抗体可识别正常或野生型H多肽或变体因子H相关5多肽，其中在该因子H相关5编码区中存在一个或多个非同义单核苷酸多态性(SNP)。
[0059]在一个实施方案中，该试剂盒包含探针或引物，它们可以在表1A、表1B和/或表IC中列出的多态性位点处区分等位基因。在实施方案中，该探针为用于核酸扩增的引物，所述扩增为扩增跨越表1A、表1B和/或表1C中列出因子H基因多态性位点的区域。在实施方案中，该试剂盒具有探针或引物，它们在表1A、表1B和/或表1C中列出的一个以上多态性位点处区分等位基因。在实施方案中，该试剂盒具有在一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点包括(a)rs529825 ；(b)rs800292 ； (c)rs3766404 ；
(d)rsl061147 ； (e)rsl061170 ； (f)rs203674 ； (g)rs529825 和 rs800292 中至少一个；(h)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少一个；(i)rs529825 和 rs800292 中至少一个，以及 rs3766404 ;以及 rsl061147, rsl061170 和 rs203674 中至少一个；或者 j)rs529825,rs800292, rs3766404, rsl061170 和 rs203674 中至少一个。
[0060]在相关实施方案中，试剂盒具有在一个以上多态性位点区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点包括(a)rs529825 ；(b)rs800292 ； (c)内含子2 (IVS2或insTT) (d)rs3766404 ； (e)rsl061147 ； (f)rsl061170 ； (g)外显子 IOA ； (h)rs203674 ； (i)rs375046 ；j)rs529825 和 rs800292 ； (k)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少两个或三个；(I)rs529825 和 rs800292 中至少一个;和内含子 2 ;和 rs3766404 ;和 rsl061147、rsl061170 和rs203674 中至少一个；和外显子 IOA ;和 rs375046 ； (m)至少 rs529825 ；rs800292 ;内含子2 ；rs3766404 ；rsl061170 ;外显子 IOA ；rs203674 ;和 rs375046 ； (n) rs529825、rs800292、内含子2 ;rs3766404、rsl061170、外显子10A、rs203674和rs375046中至少两个，或至少三个或至少四个；(ο)外显子22 (1210);或(P)外显子22(1210)与任意前述变异或一组变异(a-o)组合。在实施方案中，试剂盒具有在rs460897和rs460184中一处或两处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，该试剂盒具有在一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点选自(a)rs3753394 ； (b)rs529825 ； (c)rs800292 ； (d)内含子 2(IVS2 或 insTT) ； (e)rs3766404 ； (f)rsl061147 ； (g)rsl061170 ； (h)rs2274700 ； (i)rs203674 ； (j)rs3753396 ;和(k)rs1065489?[0061]在一个实施方案中，作为上述探针的替代或补充，试剂盒含有区分CFHR5基因中多态性位点的探针、引物、抗体等。在一个方面中，本发明提供基于CFHR5基因变异的诊断患者AMD或MPGNII的试剂盒。试剂盒可包括一种或多种CFHR5特异性探针或CFHR5等位基因特异性寡核苷酸，或特异性识别CFHR5多肽的抗体。CFHR5特异性引物和CFHR5等位基因特异性寡核苷酸可包括来自CFHR5基因编码(外显子)或非编码(启动子、5’未翻译、内含子或3’未翻译)区的序列。CFHR5特异性抗体可识别正常或野生型CFHR5多肽或变体CFHR5多肽，其中在CFHR5编码区中存在一个或多个非同义单核苷酸多态性(SNP)。该试剂盒可用于诊断AMD或MPGNII以及与CFHR5基因中SNP相关的其他疾病。
[0062]在一个实施方案中，试剂盒含有在表14或表15中列出的多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，探针为用于核酸扩增的引物，其中扩增是扩增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多态性位点的区域。在实施方案中，该试剂盒具有在表14或表15中列出的一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，该试剂盒包含在一个、两个或全部以下多态性位点处区分等位基因的探针或引物:rs9427661( —249T>C) ；rs9427662( — 20T>C)和 rsl2097550(P46S)。
[0063]在一个实施方案中，试剂盒含有在CFH基因中的多态性位点和CFHR基因(如CFHR5)的多态性位点处区分等位基因的探针或引物。
[0064]在一个方面中，本发明提供用于确定受试者单元型的装置。该装置可用于例如诊断患者的AMD或其他疾病。在一个实施方案中，该装置含有在表1A、IB和/或IC中列出的多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，探针为用于核酸扩增的引物，其中扩增是扩增跨越表1A、1B和/或IC中列出的因子H基因多态性位点的区域。在实施方案中，该装置具有在表1A、1B和/或IC中列出的一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，该装置具有在一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点包括(a)rs529825 ； (b)rs800292 ； (c)rs3766404 ； (d)rsl061147 ；
(e)rsl061170 ;(f)rs203674 ;(g)rs529825 和 rs800292 中至少一个；(h)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少一个;(i) rs529825 和 rs800292 中至少一个；和 rs3766404 ；以及 rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少一个；或者 j)至少 rs529825、rs800292、rs3766404、rsl061170 和 rs203674。
[0065]上述试剂盒及其内含物还可用于为任何目的而鉴定发生MPGNII的倾向或确定因子H单元型。
[0066]在相关实施方案中，该装置具有在一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点包括(a)rs529825 ；(b)rs800292 ；(c)内含子2(IVS2或insTT) ； (d)rs3766404 ； (e)rsl061147 ； (f)rsl061170 ； (g)外显子 IOA ； (h)rs203674 ； (i)rs375046 ； (j)rs529825 和 rs800292 ； (k)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少两个或三个；(l)rs529825 和 rs800292 中至少一个；和内含子 2 ;和 rs3766404 ;和 rsl061147,rsl061170 和 rs203674 中至少一个；和外显子 IOA ;和 rs375046 ； (m)至少 rs529825 ；rs800292 ;内含子 2 ；rs3766404 ；rsl061170 ;外显子 IOA ；rs203674 ；和 rs375046 ； (η)rs529825、rs800292、内含子 2、rs3766404、rsl061170、外显子 10A、rs203674 和 rs375046中至少两个，或至少三个或至少四个；(o)外显子22 (1210);或(P)外显子22 (1210)与任意前述变异或一组变异(a- o)组合。在实施方案中，装置具有在rs460897和rs460184中一个或两个处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，装置具有在一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点选自(a)rs3753394 ;(b)rs529825 ;(c)rs800292 ； (d)内含子 2 (IVS2 或 insTT) ； (e)rs3766404 ； (f)rsl061147 ； (g)rsl061170 ； (h)rs2274700 ； (i)rs203674 ; (j) rs3753396 和(k) rsl065489。在实施方案中，装置具有在一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物，其中所述多态性位点选自(a)rs3753394 ；(b)rs529825 ； (c)rs800292 ； (d)内含子 2(IVS2 或 insTT) ； (e)rs3766404 ； (f)rsl061147 ；(g)rsl061170 ； (h)rs2274700 ； (i)rs203674 ； (j)rs3753396 和(k)rs1065489?
[0067]在一个方面中，本发明提供用于诊断患者的AMD或MPGNII的装置。在一个实施方案中，该装置含有在表14和表15列出的多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，探针为用于核酸扩增的引物，其中扩增是扩增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多态性位点的区域。在实施方案中，该装置具有在表14或表15中列出的一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物。本发明的装置可含有区分因子H和CHFR5变体的探针或引物，包括上文及本文公开内容中其他处所述的位点的任何组合。
[0068]上文所述装置及其内含物还可用于为任何目的而鉴定发生MPGNII的倾向或确定因子H单元型。
[0069]在一个实施方案中，作为上述探针或引物的替代或补充，该装置含有区分CFHR5基因中多态性位点的探针、引物、抗体等。在一个方面中，本发明提供基于CFHR5基因变异诊断患者的AMD或MPGNII的装置。该装置可包括一种或多种CFHR5特异性探针或CFHR5等位基因特异性寡核苷酸或特异性识别CFHR5多肽的抗体。CFHR5特异性引物和CFHR5等位基因特异性寡核苷酸可包括来自CFHR5基因编码(外显子)或非编码(启动子、5’未翻译、内含子或3’未翻译)区的序列。该CFHR5特异性抗体可识别正常或野生型CFHR5多肽或变体CFHR5多肽，其中在该CFHR5编码区中存在一个或多个非同义单核苷酸多态性(SNP)。该装置可用于诊断AMD或MPGNII以及与CFHR5基因SNP相关的其他疾病。
[0070] 在一个实施方案中，该装置含有在表14或表15中列出的多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，该探针为用于核酸扩增的引物，其中扩增是扩增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多态性位点的区域。在实施方案中，该装置具有在表14或表15中列出的一个以上多态性位点处区分等位基因的探针或引物。在实施方案中，该试剂盒具有在一个、两个或全部以下多态性位点处区分等位基因的探针或引物:rs9427661( —249T>C) ；rs9427662( — 20T>C)和 rsl2097550(P46S)。
[0071]在一个实施方案中，该装置含有在CFH基因中的多态性位点和CFHR基因(如CFHR5)的多态性位点区分等位基因的探针或引物。
[0072]在阅读全部公开内容后，本发明的其他方面将是显而易见的。
[0073]附图简述
[0074]图1A-1L显示人视网膜色素上皮中因子H(图1A-1H)和末端互补复合物(C5b_9)(图11-1L)的免疫定位。缩写:(RPE) —脉络膜(Chor)复合物；Bruch膜(BM);视网膜(Ret);玻璃疣(Dr)。
[0075]图2显示使用来自人眼的RNA提取物对因子H基因表达((FH和截短形式HFL1)的RT-PCR分析。
[0076]图3是人因子H基因的简图，显示本分析中使用的12个SNP、因子H基因的22个外显子、20个短共有重复序列(SCR)、病原体和其他底物的结合位点以及连锁不平衡(LD)节段的大概位置。显示CHl所有22个外显子(但无内含子)的简图未按比例拉伸。
[0077]图4是人因子H基因SNP的单元型网状图，显示危险(实心圆)、保护性(划线圆)、中性(空心圆)和始祖(标出)单元型的关系以及单元型的相对频率，以圆的大小和位置表示。
[0078]图5显示人因子H基因单元型和二倍型的相关分析。在AMD病例和对照中分析了8个信息化SNP的配对连锁不平衡。显示了在编码链上标出的多态性位点处的核苷酸，除了IYS1，显示了其非编码链上的核苷酸。
[0079]图6显示人因子H cDNA参照形式的3926碱基核苷酸序列(GenBank登录号Y00716[SEQ ID N0:1])。ATG起始密码子开始于第74位核苷酸，TAG终止密码子终止于第3769位核苷酸。
[0080]图7 显示 SEQ ID NO:1 编码的多肽序列(GenBank登录号 Y00716 [SEQ ID NO:2]) ?1231个氨基酸的因子H多肽包括18个氨基酸的N端信号肽。
[0081]图8显示HFLl——人因子H截短形式的参照形式的1658碱基核苷酸序列(GenBank登录号X07523 [SEQ ID NO:3])。ATG起始密码子开始于第74位核苷酸，TGA终止密码子终止于第1423位核苷酸。
[0082]图9显示SEQ ID NO:3编码的HFLl参照形式的多肽序列(GenBank登录号X07523[SEQ ID NO:4])。449个氨基酸的HFLl多肽包括18个氨基酸的N端信号肽。
[0083]图10显示示例性人因子H保护性变体的多肽序列[SEQ ID NO:5]。这种保护性变体因子H多肽的第62位氨基酸为异亮氨酸，第402位氨基酸为酪氨酸(以粗体标出)。
[0084]图11显示示例性HFLl保护性变体——人因子H的截短形式的多肽序列(SEQ IDNO:6)。这种保护性变体截短的因子H多肽的第62位氨基酸为异亮氨酸，第402位氨基酸为酪氨酸(以粗体标出)。
[0085]图12显示如(A)光学显微镜和(B)电子显微镜所见，具有密集膜内沉积的显著的肾小球细胞增多，其在MPGNII患者中引起毛细血管壁增厚。沉积可在肾小球基底膜(GBM)的致密板中形成分节的、间断或弥散模式。通过光学显微镜可见，它们是嗜酸性并为折射体，用过碘酸希夫明亮染色并为高渗的，这解释了其电子密度外观(A)。甚至通过电子显微镜可见，沉积缺乏亚结构，表现为非常暗的均匀斑点(B)。致密沉积的准确组成仍然未知(条带，5 μ m)。
[0086]图13是显示补体级联系统旁路途径的激活和调节的图，所述补体级联系统在AMD和MPGNII患者中系统性高水平激活。补体级联系统的旁路途径在MPGNII/DDD患者中系统性高水平激活。正常情况下，自发的水解(称为tick-over)过程低水平地持续激活C3。C3水解与图上部显示的大的蛋白质构象变化相关。该构象变化使C3 (H20)与C3b(C3的切割产物)类似。起始转化酶C3 (H20)Bb激活C3以形成C3b。尽管C3b具有短暂的半衰期，如果其与IgG、细胞或基底膜结合，则可被保护免于立即失活。(C3b)2-1gG复合物在流体相中形成，并与备解素(P)结合，这促进了因子B的结合和C3bBb的产生，C3bBb为旁路途径的转化酶，其在此处显示为Bb(C3b)2-1gG-备解素复合物。扩增环以箭头显示。C3NeF延长了 C3转化酶的半衰期，在插图中显示。降解C3转化酶的一种机制是通过其与补体因子H(CFH)的相互作用，在底部右侧显示为fH。因子H的缺乏和突变与MPGN II/DDD相关。
[0087]图14为显示补体激活调节子(RCA)基因簇在染色体lq32上的组构以及已知为补体因子 H (CFH)、因子 H 样 I (CFHLl)和因子 H 相关 1、2、3、4 和 5 (CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)中短共有重复序列(SCR)的约60个氨基酸的结构域的排列的图。CFH具有20个SCR。已经确定了这些SCR中一些的相互作用配偶体，在右上方显示(CRP - C反应蛋白质；Hep，肝素)。补体因子H样I(CFHLl)是CFH的剪接异构体，而补体因子H相关蛋白质1-5 (CFHR1-5)各由单独的基因编码(CFHR1-5)。CFHR1-5的SCR与CFH中的一些SCR相似，以椭圆中的数字显示。例如，CFHR5具有9个SCR，前两个与因子H的SCR6和7相似，因此具有CRP和肝素结合特性。CFHR5的SCR5-7在相应椭圆中具有数字12 — 14，因为这些SCR与因子H的SCR12 - 14相似，并具有C3b和肝素结合特性。
[0088]图15显示连锁不平衡曲线，表明A307A和Y402H在因子H中连锁不平衡，一 249T>C和-20T>C在CFHR5中连锁不平衡。
[0089]图16显示人CFHR5参照形式的2821个碱基的核苷酸序列(GenBank登录号AF295327[SEQ ID N0:7])。ATG起始密码子开始于第94位核苷酸，TGA终止密码子终止于第1803位核苷酸。
[0090]图17 显示 SEQ ID NO:7 编码的多肽序列(GenBank 登录号 AAK15619 [SEQ ID NO:8])。569个氨基酸的CFHR5多肽包括18个氨基酸的N端信号肽。
[0091]图18显不CFH和 因子H相关蛋白质的基因中的基因组复制。外显子以垂直线标出。以相同字母标出的区域(如A，A’和A")具有基本相同的序列。
[0092]发明详述[0093]1.引言
[0094]本发明提供由因子H基因中和因子H相关基因如因子H相关5基因中多种变异组成的多态性和单元型的集合。这些多态性和单元型与年龄相关性黄斑变性(AMD)和其他因子H相关病症相关。这些多态性和单元型中的某些导致变体因子H多肽。对这些和其他多态性和多态性组(如单元型)的检测可用于设计和进行AMD的诊断测定。可以通过核酸分析、通过因子H编码序列所编码的多肽(包括剪接变体编码的多肽)的分析或通过本领域已知的其他方法检测多态性和多态性组。分析这类多态性和单元型也可用于设计AMD的预防和治疗方案。
[0095]因 子H是多功能蛋白质，发挥补体系统关键调节子的功能。参阅Zipfel，2001, " Factor H and disease:a complement regulator affects vital bodyfunctions" Semin Thromb Hemost.27:191-9。因子 H 蛋白质活性包括:(I)与 C 反应蛋白质(CRP)结合，⑵与C3b结合，(3)与肝素结合，⑷与唾液酸结合，(5)与内皮细胞表面结合，(6)与细胞整联蛋白质受体结合，(7)与病原体(包括微生物)结合(见图3)和(8)C3b辅因子活性。因子H基因称为HFl、Cra和HF，位于人染色体1，位置lq32。lq32特定基因座含有大量补体途径相关基因。这些基因中的一组称为补体激活调节子(RCA)基因簇，含有编码因子H、五种因子H—相关基因(分别为FHR — 1、FHR — 2、FHR — 3、FHR-4和FHR - 5或者CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)的基因，以及编码凝结因子XIII β亚基的基因。因子H和因子H相关基因几乎完全由短共有重复序列(SCR)组成。因子H和FHLl 分别由 SCRl — 20 和 I — 7 组成。FHR — 1、FHR — 2、FHR — 3、FHR-4 和 FHR — 5 分别由5、4、5、5和8个SCR组成(见图14)。基因的顺序从着丝粒到端粒为FH/FHL1、FHR_3、FHR — 1、FHR-4、FHR — 2 和 FHR — 5。
[0096]因子H基因
[0097]已经确定了人因子H cDNA的参照形式(SEQ ID NO:1)(参阅Ripoche等，1988，Biochem J249:593 — 602)和基因组序列。因子H cDNA编码表观分子量155kDa的长度为1231个氨基酸的多肽(SEQ ID NO:2)。存在称为FHL — I (也称为HFLl或CFHT)的因子H替代性剪接形式。FHL — I (SEQ ID NO:3)基本对应于因子H的外显子I至9 (参阅Ripoche 等，1988，Biochem J249:593 — 602)。FHLIcDNA 编码表观分子量 45 — 50kDA 的长度为449个氨基酸的多肽(SEQ ID NO:4)。Hll和FHLl的前445个氨基酸相同，FHLl具有独特的C端4个氨基酸(外显子10A)。替代外显子IOA位于外显子9与外显子10之间的内含子中。人因子H和FHLl的cDNA和氨基酸序列数据分别以登录号Y00716和X07523见于EMBL/GenBank数据库。人因子H cDNA参照形式的3926碱基的核苷酸序列(GenBank登录号Y00716[SEQ ID NO:1])示于图6，SEQ ID NO:1编码的多肽序列(GenBank登录号Y00716[SEQ ID NO:2])示于图7。人因子H的截短形式——HFLl参照形式的1658个碱基的核苷酸序列(GenBank登录号X07523 [SEQ ID NO:3])示于图8，SEQ ID NO:3编码的多肽序列(GenBank登录号X07523 [SEQ ID NO:4])示于图9。因子H基因序列(长度为150626个碱基)以GenBank登录号AL049744可见。因子H启动子位于因子H基因编码区的5’。
[0098]FHR — I 基因
[0099]FHR-1 基因也称为 CHFR1、CFHL1、CFHL、FHR1 和 HFL1。已经确定了人 HFR — IcDNA的参照形式(参阅 Estaller 等，1991，J Immunol.146:3190 — 3196)和基因组序列。FHR —IcDNA编码长度为330个氨基酸的多肽，预计分子量为39kDa。人FHR — I的cDNA和氨基酸序列数据以登录号M65292见于EMBL/GenBank数据库。FHR — I基因序列以GenBank登录号AL049741可见。
[0100]FHR—2 基因
[0101]FHR - 2 基因也称为 CHFR2、CFHL2、FHR2 和 HFL3。已经确定了人 HFR — 2cDNA 的参照形式(参阅 Strausberg 等，Proc.Natl.Acad.Sci 美国 99: 16899 一 16903)和基因组序列。FHR - 2cDNA编码长度为270个氨基酸的多肽，预计分子量为31kDa。人FHR-2的cDNA和氨基酸序列数据以登录号BC022283见于EMBL/GenBank数据库。FHR — 2基因序列以GenBank登录号AL139418可见。
[0102]FHR—3 基因
[0103]FHR - 3 基因也称为 CHFR3、CFHL3、FHR3 和 HFL4。已经确定了人 HFR — 3cDNA 的参照形式(参阅 Strausberg 等，Proc.Natl.Acad.Sci 美国 99: 16899 一 16903)和基因组序列。FHR - 3cDNA编码长度为330个氨基酸的多肽，预计分子量为38kDa。人FHR-3的cDNA和氨基酸序列数据以登录号BC058009见于EMBL/GenBank数据库。FHR — 3基因序列以GenBank登录号AL049741可见。
[0104]H1R-4 基因
[0105]FHR-4基因也称为CHFR4、CFHL4和FHR4。已经测定了人HFR_4cDNA的参照形式(参阅 Skerka 等，1991，J.Biol.Chem.272:5627 — 5634)和基因组序列。FHR_4cDNA 编码长度为331个氨基酸的 多肽，预计分子量为38kDa。人FHR-4的cDNA和氨基酸序列数据以登录号X98337见于EMBL/GenBank数据库。FHR-4基因序列以GenBank登录号AF190816 (5，末端)、AL139418(3’ 末端)和 BX248415 可见。
[0106]H1R-5 基因
[0107]FHR-5基因也称为CHFR5、CFHL5和FHR5。已经确定了人CHFR_5cDNA的参照形式(SEQ ID NO:83)(参阅 McRae 等，2001，J.Biol.Chem.276:6747 — 6754)和基因组序列。CFHR5cDNA编码长度为569个氨基酸的多肽(SEQ ID NO:8)，表观分子量为65kDa。人CFHR5的cDNA和氨基酸序列数据以登录号AF295327见于EMBL/GenBank数据库。人CFHR5参照形式的2821碱基的核苷酸序列(GenBank登录号AF295327 [SEQ ID NO:7])示于图16，SEQID NO:7 编码的多肽序列(GenBank 登录号 AAK15619[SEQ ID NO:8])示于图 17。CFHR-5基因序列以GenBank登录号AL139418 (5，末端)、AL353809 (3，末端)可见。FHR-5启动子位于CFHR5基因编码区的5’。
[0108]I1.定义
[0109]提供以下定义以帮助理解本发明。除非另外指明，本文使用的所有技术术语、注释和其他科学或医学术语或命名法具有医学和分子生物学领域技术人员普遍理解的意义。在一些情况下，为了清楚和/或易于参考起见，本文定义了具有普遍理解意义的术语，不应假定本文中这些定义的内容代表与本领域一般理解相比存在的显著差异。
[0110]“核酸”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”是任何长度的核苷酸聚合形式，可以是DNA或RNA，并且可以是单链或双链。核酸可包括启动子或其他调节序列。寡核苷酸基本通过合成的手段制备。核酸包括跨越任一多态性位点或位于其侧翼的DNA节段或其互补序列，所示多态性位点示于表1A、表1B和/或1C，或者已知在因子H基因中。节段通常在5至100个连续碱基之间，范围经常从下限5、10、12、15、20或25个核苷酸至上限10、15、20、25、30、50或 100 个核苷酸(其中上限大于下限)。5-10、5-20、10-20、12 — 30、15-30、10-50、20-50或20-100之间的核酸是常见的。多态性位点可以在节段内的任何位置出现。提到双链核酸中的一条链的序列也定义了其互补链，除非本文中另外明确说明，提到核酸的一条链也指其互补物。对于某些应用，可以修饰核酸(如RNA)以提高胞内稳定性和半衰期。可能的修饰包括但不仅限于在分子骨架中使用硫代磷酸酯或2’ -O -甲基而不是磷酸二酯酶键。修饰的核酸包括肽核酸(PNA)和具有内源性内切核酸酶不易识别的非常规碱基如肌苷、queosine和wybutosine以及腺嘌呤、胞嘧唳、鸟嘌呤、胸腺嘧唳和尿嘧唳的乙酰基一、甲基一、硫代一及类似修饰形式的核酸。
[0111]“杂交探针”是能以碱基特异性方式与核酸互补链结合的核酸。此类探针包括核酸和肽核酸(Nielsen等，1991)。可以在本领域已知的严格条件下进行杂交。例如，参阅如 Berger 和 Kimmel (1987)Methods In Enzymology, 152 卷:Guide To Molecular CloningTechniques,San Diego:Academic Press,Inc.;Sambrook 等，(1989)Molecular Cloning:Aaboratory Manual,第 2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory ;Sambook(2001)第 3版；Rychlik，W.和 Rhoads，R.E.，1989，Nucl.Acids Res.17,8543 ；Mueller,P.R.等(1993)In Current Protocols in Molecular Biologyl5.5, Greene Publishing Associates,Inc.和 John Wiley 和 Sons, New York ;以及 Anderson 和 Young, Quantitative FilterHybridization in Nucleic Acid Hybridization (1985))。本文使用的术语“探针”包括引物。探针和引物有时指“寡核苷酸”。
[0112]术语“引物”指能在适当条件下、在适当的缓冲液和适当的温度下作为模板指导的DNA合成的起始点的单链寡核苷酸。引物的适当长度取决于引物的预期用途，但范围一般从15至30个核苷酸。引物序列不需要与模板精确互补，但必须充分互补以与模板杂交。术语“引物位点”指靶DNA中 与引物杂交的区域。术语“引物对”指一组引物，包括与待扩增DNA序列的5’末端杂交的5’上游引物以及与待扩增序列3’末端互补序列杂交的3’下游引物。
[0113]用于短探针和引物的示例性杂交条件为所计算的Tm下约5至12°C。计算Tm的公式是已知的，包括对于小于14个碱基的寡聚物并假定反应在50mM —价阳离子存在下进行时的Tm = 4 0C X (引物中的G和C数)+2°C X (引物中的A和T数)。对于较长的寡聚物，可以使用以下公式:Tm = 64.9°C +41°C X (引物中的G和C数一16.4)/N，其中N为引物长度。另一普遍使用的公式考虑了反应的盐浓度(Rychlik,同上，Sambrook,同上，Mueller,同上):Tm = 81.5°C +16.6°C X (logl0[Na+] + [K+])+0.41°C X (% GC) — 675/N，其中 N 为寡聚物中的核苷酸数。上述公式提供了某些应用的起点，然而，特定探针和引物的设可以考虑其他或不同的因素。设计用于本发明方法的探针和引物的方法为本领域所熟知。
[0114]术语“危险”、“保护性”和“中性”用于描述变异、SNP、单元型、二倍型和特征为这些变异模式的基因所编码的群体中的蛋白质。危险单元型是基因(本文中为因子H或因子H相关基因)的等位基因形式，其包含至少一个与发生AMD的危险提高相关的变体多态性，优选一组变体多态性。涉及因子H或因子H相关基因使用时，术语“变体”指核苷酸序列，其中该序列与种群(本文中为美国欧裔血统的人)中最常见的序列不同。变体多态性可以在基因的编码或非编码部分中。危险因子H单元型的实例为编码氨基酸402处的组氨酸和/或氨基酸1210处的半胱氨酸的因子H基因等位基因。危险单元型可以是天然存在的，或者通过重组技术合成。保护性单元型是基因(本文中为因子H或因子H相关基因)的等位基因形式，其包含至少一个与发生AMD的危险降低相关的变体多态性，优选一组多态性。例如，一种保护性因子H单元型具有编码氨基酸62处为异亮氨酸的因子H基因。保护性单元型可以是天然存在的，或者通过重组技术合成。中性单元型是基因(本文中为因子H或因子H相关基因)的等位基因形式，其不包含种群或人种群中与发生AMD的危险提高或降低相关的变体多态性。从以下的讨论中显然可见，当施用于需要治疗或预防AMD或其他病症的患者时，“中性”单元型编码的蛋白质可以是保护性的。即施用于例如患AMD或有发生AMD的受试者时，CFH或CFHR5的“中性”和“保护性”形式可提供治疗益处，从而“保护”受试者免于疾病。
[0115]术语“野生型”指核酸或多肽，其中序列为种群(本文中为欧洲一美洲血统的人)中的普及形式(约40%普及，见图5)。就本文公开内容的目的而言，“野生型”因子H蛋白质具有SEQ ID NO: 2的序列(图7)，只是第402位氨基酸为酪氨酸(Y ; [SEQ ID NO:337])。就本文公开内容的目的而言，编码野生型因子H蛋白质的因子H基因具有SEQ ID N0:1的序列(图6)，只是开始于碱基1277的密码子(对应于第402位氨基酸)编码酪氨酸(TAT [SEQID NO:336])。
[0116]涉及因子H或因子H相关多肽时使用的术语“变体”指多肽，其中序列在改变所编码多肽的氨基酸序列的位置上不同于正常或野生型序列。例如，因子H基因核苷酸序列中的一些变异或取代改变密码子，从而编码不同的氨基酸(例如但不仅限于在一个或多个I62V、Y402H、D936E中的替代等位基因)，导致变体多肽。变体多肽可与危险相关(如第402位为组氨酸)、与保护相 关(如第62位为异亮氨酸)，或者可以由中性单元型编码(如936位为天冬氨酸)。变体CFHR5多肽可与危险相关(如第46位为丝氨酸)、与保护相关，或者可以是中性的。
[0117]涉及因子H多肽时，术语“参照”指氨基酸序列与Ripoche等人，1988, BiochemJ.249 =593-602 所述的全长 O7Hl，SEQ ID NO:2)或截短(FHL1，SEQ ID NO:4)人因子 H 序列相同的多肽。涉及CFHR5多肽时，术语“参照”指氨基酸序列与McRae等人，2001，J.Biol.Chem.276:6747-6754所述全长人CFHR5 (SEQ ID NO:8)的序列相同的多肽。任意地将第一种鉴定的等位基因形式称为参照形式或等位基因；其他等位基因形式称为替代或变体等位基因。野生型和变体形式可以与参照形式具有实质的序列同一性(例如，野生型或变体形式可以在至少90%的野生型或变体中氨基酸位置上与参照形式相同，有时在至少95%的位置、有时至少98%或99%的位置上与参照形式相同)。变体可以由于移码突变或剪接变异而在某些蛋白质区域中与参照形式不同。
[0118]术语“多态性”指种群中存在两种或更多遗传确定的替代序列或等位基因。“多态性位点”是发生序列趋异的基因座。多态性位点具有至少两种等位基因。双等位基因多态性具有两种等位基因。三等位基因多态性具有三种等位基因。二倍体生物的等位基因形式可以是纯合或杂合的。多态性位点可以小至一个碱基对。多态性位点的实例包括:限制性片段长度多态性(RFLP);可变数目串联重复(VNTR);高变区；小卫星；双核苷酸重复；三核苷酸重复；四核苷酸重复和简单序列重复。本文使用的术语“多态性”可包括一组多态性(即单元型)。[0119]“单核苷酸多态性(SNP) ”在单核苷酸占据的多态性位点发生，所述位点是等位基因序列之间的变异位点。该序列之前和之后一般为高度保守的等位基因序列。SNP通常由于多态性位点处一个核苷酸取代另一个而产生。用一个嘌呤取代另一个嘌呤或者用一个嘧啶取代另一个嘧啶称为转换(transition)。用嘧啶取代嘌呤或相反称为颠换(transversion)。同义SNP指编码区中用一个核苷酸取代另一个而不改变所编码多肽氨基酸序列。非同义SNP指编码区中用一个核苷酸取代另一个而改变所编码多肽氨基酸序列。SNP还可以由相对于参照等位基因的核苷酸缺失或插入而产生。
[0120]一“组”多态性指多于一种多态性，如表1A、表1B和/或表1C中所示或已知在因子H基因或其他基因中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或多于6种多态性。
[0121]术语“单元型”指个体基因中一组多态性或多态性位点的等位基因的命名。例如，“112”因子H单元型指该因子H基因在前两个多态性位点处均包含等位基因I，在第三个多态性位点处包含等位基因2。“二倍型”为单元型对。
[0122]“分离的”核酸指是组合物中存在的优势种的核酸种类。分离的指核酸从至少一种与其天然相关的化合物分离。纯化的核酸包含(基于摩尔)至少约50%、80%或90%的所存在的所有大分子种类。[0123]当两氨基酸序列至少约80%—致、优选至少约90%—致、更优选至少约95%、至少约98%—致或至少约99%—致时，认为其具有“实质的同一性”。一般通过确定两序列间的最佳比对和比较两序列来计算序列同一性百分比。可以通过观察，或使用Smith和Waterman, 1981, Adv.App1.Math.2:482 的局部同源性算法、使用 Needleman 和 Wunsch,1970, J.Mol.Biol.48:443 的同源性比对算法、使用 Pearson 和 Lipman, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.85:2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化的实施(例如Wisconsin Genetics 软件包中，Genetics Computer Group, 575Science Dr., Madison,Wis.)使用用于氨基酸比较的默认参数(例如用于缺口评分等)来进行序列的最适比对。有的时候需要描述两个序列之间关于具体长度或区域的序列同一性(例如两个序列可以被描述为在至少500碱基对的长度上具有至少95%的同一性)。通常所述长度可以是至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个氨基酸，或是参照蛋白质的全长。如果两个氨基酸序列有1、2或3个残基，或2-20个残基、2-10个残基、3_20个残基或3 —10个残基不同，则也认为它们具有实质的同一性。
[0124]“连锁”描述了基因、等位基因、基因座或遗传标记由于其位于相同染色体上，所以被一起遗传的趋势。连锁可通过两个基因、等位基因、基因座或遗传标记之间的重组百分比测量。通常，以彼此间50厘摩(CM)以内的距离存在的基因座是连锁的。连锁的标记可存在于相同的基因或基因簇内。“连锁不平衡”或“等位基因关联”是指具体的等位基因或遗传标记与位于邻近染色体位点上特定的等位基因或遗传标记，以比群体中对任何具体等位基因可能估计的频率更频繁地优先关联。连锁不平衡的标记特别适用于检测对疾病的易感性，即使标记本身不引起所述疾病。
[0125]术语“诊断”是指确定个体是否具有发生疾病的倾向(包括有无体征或症状)的能力。诊断发生疾病的倾向还可被称为“筛选”，在本文中使用时，术语诊断和筛选可交换使用。应当明白具有提高的或降低的发生病症的倾向是指相对于未患有所述病症的群体中的个体，发生所述病症的可能性。
[0126]II1.表格
[0127]本文涉及到的某些表格在下文实施例之后提供。提供以下描述以帮助阅读者:
[0128]表1A-1C显示人因子H基因多态性及其与年龄相关性黄斑变性的关联。(IA)显示人因子H基因中dbSNP号、定位、跨越多态性的编码(顶部，5’到3’方向)和非编码(底部)链的序列、氨基酸改变、对照和AMD病例的等位基因频率，和ISNP的X 2与P —值。(IB)显示人因子H基因中dbSNP号、被查询的序列、黑猩猩因子H基因中相应的核苷酸、定位、氨基酸改变以及引物与探针组。(IC)显示在dbSNP数据库中没有找到的人因子H基因中定位、跨越多态性的序列、氨基酸位置和14SNP的氨基酸改变(如果有的话)。
[0129]表2显示一组AMD病例和对照中人因子H基因中八个SNP的单元型分析。
[0130]表3显示人因子H基因中六个SNP的单元型分析以及它们与AMD的关联。
[0131]表4显示11个人因子H基因SNP与年龄相关性黄斑变性的关联。
[0132]表5显示用于人因子H的SSCP、DHPLC和DNA测序分析的引物。
[0133]表6显示AMD患者和对照的基因分型数据。
[0134]表7显示多个人种群中危险单元型的频率。
[0135]表8显示若干 种因子H的二倍型。指出了普遍危险和保护性二倍型。
[0136]表9显示用于扩增因子H编码序列的引物序列。
[0137]表10显示用于扩增CFHR5编码序列的引物序列。
[0138]表11显示22个MPGNII患者中因子H SNP分析。
[0139]表12显示22个MPGNII患者和AMD —阴性的、人种相匹配的对照中因子H SNP频率的比较。
[0140]表13列出与MPGNII相关联的因子H SNP及其相关的SCR。
[0141]表14显示22个MPGNII患者中CFHR5SNP的分析。
[0142]表15显示22个MPGNII患者和AMD —阴性的、人种相匹配的对照中CFHR5SNP频率的比较。
[0143]表16显示用于检测因子H基因中多态性的示例性的等位基因特异的探针(16A)和引物(16B)。
[0144]IV.补体因子H多态性
[0145]在一个方面，本发明提供与下述发现相关的新的诊断、治疗和药物筛选方法，所述发现为:补体因子H(HFl)基因中的多态位点与对AMD的易感性和AMD的发展有关。
[0146]与AMD相关的因子H多态性如实施例1所述被鉴定，其根据标准方案使用SSCP分析、DHPLC分析和直接测序法检查因子H(包括外显子10A，其被转录为因子H的同种型FHLI)的编码区和邻近内含子区域的变体。剩余的多态性通过5’核酸酶(Taqman，ABI)方法分型。如所述的进行Taqman基因分型和关联分析(Gold等,2004)。使用Mac Vector软件设计用于SSCP和DNA测序分析的引物，以扩增各外显子及其邻近的内含子区域。根据标准方案通过SSCP和DHPLC，针对序列变异筛选PCR得到的扩增子。通过SSCP和DHPLC检测到的所有改变根据标准方案通过双向测序证实。使用X方(X2)和Fisher' s精确检测(P值)进行统计学分析。
[0147]使用两组独立的AMD病例和年龄匹配的对照。所有参与的个体都是美国欧裔血统、大于60岁年龄并依照知情同意在IRB-批准的方案下招募。这些组由以下组成:来自The University of 1wa的352名患有临床上被证明的AMD的无关联的患者(平均年龄79.5±7.8岁)和113名无关联的对照患者(平均年龄78.4±7.4岁；通过年龄和人种匹配)，和来自Columbia University的550名患有临床上被证明的AMD的无关联的患者(平均年龄71.32±8.9)和275名无关联的、通过年龄和人种匹配的对照(平均年龄68.84±8.6岁)。由视网膜研究员训练的眼科医师通过间接检眼镜检查法和裂隙灯显微镜检查法来检查患者。
[0148]Fundas照片根据标准化的、国际分类体系(Bird等，1995)分级。如果对照患者未显示任何可辨别的黄斑疾病体征或不具有已知的AMD家族史，则将他们选择并包括。AMD患者根据他们参与研究时最严重的眼分类被细分为表型类别:早期AMD (ARM)、地图样萎缩(GA)和渗出性(CNV) AMD。The University of 1wa的ARM和GA病例被进一步细分为不同的表型(单独的RPE改变、>10的斑状硬玻璃疣、斑状软玻璃疣、BB (表皮)玻璃疣、PED、“Cherokee”萎缩、半岛状地图样萎缩(peninsular geographic atrophy)和框式地图样萎缩(pattern geographic atrophy))。所有病例的最早的可被证明的表型也被记录并用于分析。
[0149]如表1A中所示，在两个独立组的检测中发现因子H基因多态位点与AMD的高度显著的关联，所述两个独立组一共包括约900个AMD病例和400个匹配的对照。表1A-1B中列出十六(16)个因子H基因中的多态性。其中有十二(12)个在SNP数据库(dbSNP)中发现，所述数据库可在国家生物技术信息中心(NCBI)找到。dbSNP是人因子H基因中SNP的集合，所述SNP分散于因子H基因的22个编码外显子中，分散于因子H基因的启动子、5’未翻译区、内含子和3’未翻译区中。以下列出在dbSNP数据库中找到的人因子H基因中379个SNP的登录号。这些SNP可用于实施本发明的方法。
[0150]表A
【权利要求】
1.分离的补体因子H多肽在制备预防或治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的用途，其中所述补体因子H多肽包含SEQ ID NO:2第402位残基对应位点的酪氨酸。
2.权利要求1的用途，其中所述补体因子H多肽包含SEQID NO:2第62位残基对应位点的异亮氨酸。
3.权利要求1或2的用途，其中所述补体因子H多肽用于通过眼内注射施用。
4.表达补体因子H多肽的分离的细胞在制备预防或治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的用途，其中所述补体因子H多肽包含SEQ ID NO:2第402位残基对应位点的酪氨酸。
5.权利要求4的用途，其中所述补体因子H多肽包含SEQID NO: 2第62位残基对应位点的异亮氨酸。
6.分离的多核苷酸在制备预防或治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的用途，所述多核苷酸包含编码补体因子H多肽的序列，所述序列与启动子有效连接，其中所述补体因子H多肽包含SEQ ID NO:2第402位残基对应位点的酪氨酸。
7.权利要求6的用途，其中所述补体因子H多肽包含SEQID NO: 2第62位残基对应位点的异亮氨酸。
8.权利要求6或7的用途，其中所述启动子对视网膜色素上皮具有特异性。
9.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述补体因子H多肽的氨基酸序列是SEQIDNO:2，或是由SEQ ID NO:2经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸衍生的序列，且该序列具有与补体因子H多肽相同的功能，前提是第402位对应的残基是酪氨酸。
10.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述补体因子H多肽包含SEQID NO: 5或SEQID NO:6的残基19之前的氨基酸序列。
11.与补体因子H多肽的至少一部分核苷酸序列互补的分离的反义RNA、核酶或短干扰RNA在制备治疗或预防年龄相关性黄斑变性的药物中的用途。
12.单克隆抗体在制备治疗或预防年龄相关性黄斑变性的药物中的用途，所述单克隆抗体与第402位为组氨酸的补体因子H多肽结合，但不与第402位为酪氨酸的补体因子H多肽结合。
13.权利要求1-12中任一项的用途，其中所述药物给予诊断患有年龄相关性黄斑变性的患者，或给予鉴定具有与年龄相关性黄斑变性危险相关的补体因子H基因单元型的患者。
14.药物组合物，其包含重组补体因子H多肽和可药用赋形剂，其中重组补体因子H多肽包含第62位的异亮氨酸和第402位的酪氨酸，并且其中所述组合物不含病原体，并且适于对人类患者施用。
15.药物组合物，其包含重组补体因子H多肽和可药用赋形剂，其中所述补体因子H多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:2，或是由SEQ ID NO:2经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸衍生的序列，且该序列具有与补体因子H多肽相同的功能，前提是第402位对应的残基是酪氨酸且第62位对应的残基是异亮氨酸，并且其中所述组合物不含病原体，并且适于对人类患者施用。
16.包含抗体的药物组合物，所述抗体与第402位为组氨酸的补体因子H蛋白质结合，但不与第402位为酪氨酸的补体因子H蛋白质结合。
17.药物组合物，其包含编码补体因子H多肽的基因治疗载体和可药用赋形剂，其中所述补体因子 H多肽包含第62位的异亮氨酸和第402位的酪氨酸。
18.表达重组人补体因子H的分离的哺乳动物宿主细胞，其中所述重组人补体因子H包含第62位的异亮氨酸和第402位的酪氨酸。
【文档编号】C12N5/10GK103920142SQ201410180974
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2006年2月14日 优先权日:2005年2月14日
【发明者】G·S·哈格曼, R·J·史密斯 申请人:爱荷华大学研究基金会