一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒，包括SEQIDNO.1～24。3.本发明针对G6PD基因6个高频突变位点，提供了一种准确及特异性好、检出率高、成本低及推广性好，且能区分杂、纯合突变的快速的G6PD缺陷症基因突变检测试剂盒，在基因水平上为G6PD缺乏症的及早诊断和预防提供快速可靠的分子诊断依据,能在最短时间内使患者确诊，及时对症处理，避免病情进一步恶化，不仅对降低G6PD缺乏症的危害，减少家庭的经济和精神负担具有重要的社会与经济意义，同时具有较高的临床推广应用价值及广泛的市场前景。
【专利说明】一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒。
【技术领域】
[0001]本发明涉及诊断试剂盒，用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变的体外诊断。
【背景技术】
[0002]葡萄糖_6_憐酸脱氧酶（Glucose-6-phosphatedehy Drogenase, G6PD)缺陷症是一种常见的X连锁不完全显性遗传病，也是人类最常见的酶缺陷病之一。Gero缺陷症在我国发病率约为4%~15%，个别地区高达40%以上，常见于我国西南（重庆、四川及贵州）和华南数省（广东、广西及海南等）。
[0003]G6ro是存在于所有细胞和组织中的磷酸戊糖旁路代谢的起始酶，它提供戊糖用于核酸合成，提供还原型辅酶II (NADPH)用于各种生物合成及维持血红蛋白和红细胞膜的稳定性。G6H)缺乏不仅影响NADPH的生物合成，防碍过氧化氢和成熟红细胞的其他化合物的解毒作用；G6H)缺乏症患者可由多种诱因如误食蚕豆、氧化性药物、感染性疾病等均可诱发急性溶血，严重威胁人类健康。Gero缺陷症患者临床表现变化大。患者在无诱因诱导情况下与常人无异，一旦经接触诱因常会导致急性溶血，起病急促，进展迅速，从无症状到新生儿黄疽、药物或感染造成的急性溶血、蚕豆病和重症慢性非球形细胞血溶性贫血，严重者导致新生儿期重症核黄疽，如不及时对症处理常会导致多种严重的并发症，造成永久性神经系统的损伤甚至死亡，极大威胁人民生命健康。
[0004]我国G6ro缺陷症的辅助诊断经历了酶活性测定与基因分析等多种诊断方法。由于酶学法检测影响因素众多，准确性低，尤其对于Gero缺乏症基因携带者的“杂合子”女性患者（其酶活性变化范围很大：既可表现为正常，也可低至半合子水平）酶活性检测很难检出，也是G6ro缺乏症目前实验室漏检的主要原因。由于已明确G6ro基因突变是G6ro缺陷症的分子基础，使得基因水平诊断成为G6ro缺陷症临床确诊的最直接手段。
[0005]目前已存在一些获得认可且已推广的方法。其中部分已有的一些方法如单链构象多态性分析法（SSCP)，变性梯度凝胶电泳法（DGGE)，温度梯度凝胶电泳（TGGE)、高效液相色谱分析法（DHPLC)、DNA直接测序等，检测准确度虽高，但由于费用昂贵、手续复杂、耗时长等因素，限制了其在临床推广使用；而其他一些获得认可方法，如等位基因特异性扩增法(ARMS-PCR)、PCR错配限制性酶切法、等位基因寡核苷酸探针杂交（ASO)法，也仍存在要么效率低下、漏检率或假阳性率高；要么检测位点过少，无法区分杂合或纯合突变等诸多的缺限，导致许多G6ro缺陷症患者得不到及时诊断或误诊，限制了临床上的及时救治，错过了早期干预的时机。
【发明内容】
[0006]本发明针对目前葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变的检测现状，提供一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒，能够一次区分G6H)基因中6个高频突变位点中的正常与突变DNA，以及突变DNA中的纯合突变与杂合突变状况，达到准确，快速，廉价的诊断目的。
[0007]本发明的目的是通过以下措施实现的：
[0008]一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒，包括SEQ IDN0.1~
24。所述序列分别针对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症（G6PD)致病相关的六个主要高频原发突变位点G1388A、G1376T、A95G、C1004T、C1024T、G871A，针对每一个突变位点分别采用四条引物-两条外引物和两条内引物，两条外引物扩增的片段作为PCR体系的内对照，排除体系自身原因造成的误诊，两条内引物分别反向扩增突变及正常的等位基因，能够一次鉴定区分G6H)基因中正常与突变DNA，以及突变DNA中的纯合突变与杂合突变状况。
[0009]本发明试剂盒的诊断原理如图I所示，Pl和P2为扩增含有突变点基因片段的外引物，SI和S2为两条特异性引物即内引物，分别与DNA双链的两条单链互补，其3'端正好与SNP位点重合，由引物的3'端控制着引物的延伸反应，根据延伸产物的长度确定SNP类型，并通过在引物的3'端区域引入一个人为不匹配碱基来提高延伸反应的特异性。野生型(W)基因只能与相匹配的特异性引物S2发生延伸反应。特异性引物SI由于其3'末端碱基与模板不配对，故不发生延伸反应，因此PCR扩增后的产物只有DNA片段P1P2和P1S2 ；同理，突变型（M)基因仅与其配对的特异性引物SI发生延伸反应，特异性引物S2由于其3'末端碱基与模板不配对，故不发生延伸反应.因此PCR扩增后的产物只有DNA片段P1P2和S1P2。
[0010]为了进一步简化检测程序，降低检测成本，并保证检测的准确性和特异性，SEQ IDNO. I ~4 与 SEQ ID NO. 13 ~16，SEQ ID NO. 5 ~8 与 SEQ ID NO. 17 ~20，SEQ ID NO. 9 ~12与SEQ ID NO. 21~24分别在同一反应体系。成功构建了多重四引物扩增受阻突变体系PCR技术（Mutiplex Tetra-primer-ARMS-PCR, MT-ARMS-PCR)，能在单管内进行将多种单个突变位点的检测，极大简化检测程序，降低检测成本，方便实用。同一样本仅进行三管PCR检测，即可快速、准确、高特异性的得到G6H)缺陷症6个高频位点突变的基因检测结果。
[0011]上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症体外诊断试剂盒，SEQ ID NO. 9 ：SEQ ID NO. 10 ：SEQ ID NO. 11 ：SEQ ID NO. 12 ：SEQ ID NO. 21 ：SEQ ID NO. 22 ：SEQ ID NO. 23 ：SEQ ID NO. 24 = 2 —10 ： 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10，SEQ ID NO. 5 :SEQ ID NO. 6 ：SEQ ID NO. 7 ：SEQ ID NO. 8 ：SEQ ID NO. 17 ：SEQ ID NO. 18 ：SEQ ID NO. 19 ：SEQ IDNO. 20 = 2 ~10 ： 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10,SEQ ID NO. I ：SEQ ID NO. 2 ：SEQ ID NO. 3 ：SEQ ID NO. 4 ：SEQ ID NO. 13 ：SEQ ID NO. 14 ：SEQ IDNO. 15 ：SEQ ID NO. 16 = 7 ： 7 ： 7 ： 7 ： 12. 5 ： 12. 5 ： 5 ： 5，以摩尔比计。本试剂盒特定调整外引物与内引物用量，其效果在于有效的平衡外侧与内侧PCR产物扩增效率，提高结果的特异性，便于扩增结果的准确判读。
[0012]为了更简单方便的得到更清晰易辨的检测结果，上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒的使用方法是将三组引物分别与DNA扩增模板、DNA聚合酶、dNTP混合后在95°C保温lOmin，然后按95°C 30s、55°C~65°C 30s,72°C 30s的条件进行35个PCR扩增循环，在72°C保温IOmin进行成像或测序检测。优选为95°C 30s,63°C 30s、72°C 30s。
[0013] 有益效果[0014]I.使用本发明的试剂盒，可直接通过PCR扩增条带的长度，一次性鉴定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症G6H)基因中6个高频突变位点中正常与突变DNA，以及其DNA突变是纯合突变或杂合突变。
[0015]2.本发明可进行6个单管PCR或三管双重同时扩增，一次电泳得到检测结果，所需仪器简单，具有操作简单、观察简单、耗费低廉、检测快速而准确的优势，适合临床推广普及，产业化应用。
[0016]3.本发明针对G6H)基因6种高频突变位点，开发出一种准确及特异性好、检出率高、成本低及推广性好，且能区分杂、纯合突变的快速的G6ro缺陷症基因突变检测试剂盒，在基因水平上为Gero缺乏症的及早诊断和预防提供快速可靠的分子诊断依据，能在最短时间内使患者确诊，及时对症处理，避免病情进一步恶化，不仅对降低G6ro缺乏症的危害，减少家庭的经济和精神负担具有重要的社会与经济意义，同时具有较高的临床推广应用价值及广泛的市场前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图I本发明试剂盒的检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变的原理；
[0018]图2实施例1①PCR扩增产物成像结果；
[0019]图3实施例1②PCR扩增产物成像结果；
[0020]图4实施例1③PCR扩增产物成像结果；
[0021 ]图5实施例1④PCR扩增产物成像结果；
[0022]图6实施例1⑤PCR扩增产物成像结果；
[0023]图7实施例1⑥PCR扩增产物成像结果
[0024]图8为实施例1①G1388A位点无突变的局部测序图；
[0025]图9为实施例1①G1388A位点为纯合突变的局部测序图，在图中显示为G突变为A ：
[0026]图10为实施例1①G1388A位点为杂合突变的局部测序图，在图中显示为G突变为A ；
[0027]图11为实施例1②G1376T位点无突变的局部测序图
[0028]图12为实施例1②G1376T位点为纯合突变的局部测序图，在图中显示为G突变为T
[0029]图13为实施例1②G1376T位点为杂合突变的局部测序图，在图中显示为G突变为T
[0030]图14为实施例1③A95G位点无突变的局部测序图
[0031]图15为实施例1③A95G位点为纯合突变的局部测序图，在图中显示为A突变为G ：
[0032]图16为实施例1③A95G位点为杂合突变的局部测序图，在图中显示为A突变为G ：
[0033]图17为实施例1④C1004T位点无突变的局部测序图
[0034] 图18为实施例1④C1004T位点为纯合突变的局部测序图，在图中显示为C突变为T[0035]图19为实施例1④C1004T位点为杂合突变的局部测序图，在图中显示为C突变为τ
[0036]图20为实施例1⑤C1024T位点无突变的局部测序图
[0037]图21为实施例1⑤C1024T位点为纯合突变的局部测序图，在图中显示为C突变为T ；
[0038]图22为实施例1⑤C1024T位点为杂合突变的局部测序图，在图中显示为C突变为T ；
[0039]图23为实施例1⑥G871A位点无突变的局部测序图
[0040]图24为实施例1⑥G871A位点为纯合突变的局部测序图，在图中显示为G突变为A ：
[0041]图25为实施例1⑥G871A位点为杂合突变的局部测序图，在图中显示为G突变为A ：
[0042]图26多重扩增同时检测A95G和G871A两个位点的PCR扩增产物成像结果；
[0043]图27多重扩增同时检测G1376T和C1024T两个位点的PCR扩增产物成像结果；图28多重扩增同时检测G1388A和C1004T两个位点的PCR扩增产物成像结果。
【具体实施方式】
[0044]下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0045]实施例1
[0046]I.样本：人全血提取的DNA(50~100ng/ul)。样本I和2为正常对照，是指扩增模板来源于无下述6个高频突变的正常人血DNA ;样本3和4为纯合突变体，是指扩增模板来源于有下述6个高频突变的G6H)缺陷症病人全血DNA，且突变为纯合子突变；样本5和6为杂合突变，是指扩增模板来源于有下述6个高频突变的G6H)缺陷症病人全血DNA，且突变为杂合子突变。
[0047]2.试剂：（..io.l.aq ' Hot Start Green Master Mix, 2X ：包含 2XGreen Go TaqReaction Buffer(pH8. 5),400 μ M dATP、400 μ M GATP、400 μ M dCTP、400 μ M dTTP、4mMMgCl2> Nuclease-Free Water、DNA 聚合酶。
[0048]3. T-ARMS-PCR反应体系及扩增程序
[0049]①G1388A采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳成像结果如图2所示。
[0050]内引物：S1 ：GACGAGCTCCGTGAGGCCTGTCA(SEQ ID NO. I)
[0051 ] S2 ： TGGTGCAGCAGTGGGGTGAAAAGAC(SEQ I D NO. 2)
[0052]外引物：P1：GCCCTACAGAGAAGGAGCAGTGTGGAG(SEQ ID NO. 3)
[0053]P2 ：CTTTCCTCACCTGCCATAAATATAGGGGAT(SEQ ID NO. 4)
[0054]反应体系
【权利要求】
1.一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒，包括SEQ ID N0.1~24。
2.如权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒，SEQID N0.1 ~4 与 SEQ ID N0.13 ~16，SEQ ID N0.5 ~8 与 SEQ ID N0.17 ~20，SEQ ID N0.9 ~12与SEQ ID N0.21~24分别在同一反应体系。
3.如权利要求2所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒，SEQID N0.9:SEQ ID N0.10:SEQ ID N0.11:SEQ ID N0.12:SEQ ID N0.21:SEQ ID N0.22:SEQ IDN0.23:SEQ ID N0.24=2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10，SEQID N0.5:SEQ ID N0.6:SEQ ID N0.7:SEQ ID N0.8:SEQ ID N0.17:SEQ ID N0.18:SEQ ID N0.19:SEQ ID N0.20=2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10，SEQ ID N0.1:SEQ ID N0.2:SEQ ID N0.3:SEQ ID N0.4:SEQ ID N0.13:SEQ ID N0.14:SEQ ID N0.15:SEQ IDN0.16=7:7:7:7:12.5:12.5:5:5，以摩尔比计。
4.如权利要求1~3所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变体外诊断试剂盒使用方法，将所述SEQ ID N0.1~24分别与DNA扩增模板、DNA聚合酶、dNTP混合后在95 °C保温lOmin，然后按95°C 30s、55°C~65°C 30s,72°C 30s的条件进行35个PCR扩增循环，在72°C保温1min进行 成像电泳分析。
【文档编号】C12Q1/68GK104017862SQ201410180904
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】黄轶, 李阳, 宋利华 申请人:重庆医科大学附属儿童医院, 黄轶