一种共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌系统的构建的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组菌E.coil BL21(pETDuet-Sygdh-Sys1)，并且公开了其构建方法。其SyS1酶活力为3.7U/g，SyGDH酶活力为44.1U/g。它避免了添加昂贵的纯酶和辅酶NADPH，只需添加低成本的辅酶NADP+就可以使得辅酶NADPH高效再生，大大降低了生产成本。
【专利说明】一种共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌系统的 构建
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种共表达羰基还原酶基因（Sysl)和葡萄糖脱氢酶基因（Sygdh)的 重组大肠杆菌系统的构建，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 手性醇即含有手性醇羟基的一类化合物，在手性药物、香料、农药等物质的合成方 面有着重要的作用，如（R)-2_氯-1-(3-氯苯基）乙醇（(R)-CCE)是一种重要的手性化合 物，是合成多种β3-肾上腺素能受体（AR)激动剂（SR-58611A、TAK-677)的重要手性中间 体。近年来有关（R)-CCE的合成一直是国内外的热点，该类化合物的制备方法主要包括化 学法和生物法，而每种方法又有拆分法和合成法。拆分法的缺点是最大收率不超过50% ; 化学合成法的收率在70?90%，对映体过量（e. e.)值50?80%，但其所用催化剂价格昂 贵，产物的光学纯度不高，后期金属离子的去除不理想，且药物中对于金属离子的严格要求 都限制着化学合成。生物催化法具有高效性，高立体选择性，反应条件温和等优点，近年来 受到广大研究者的青睐。利用羰基还原酶不对称还原3-氯苯甲酰甲基氯（m-CPC)，将潜手 性的底物111-〇?(：转化成具有手性的〇〇-(1^，有产率高和 6.6.值大等优势。但是生物催化 羰基的不对称还原反应除了在氧化还原酶作用下进行，还需辅酶NAD(P)H参与。辅酶可以 通过底物偶联或酶偶联的方法再生。底物偶联法是在反应过程中添加辅助底物，在相同酶 的作用下实现目标底物和辅助底物的同时转化，但两者的方向相反。酶偶联法是利用两个 独立的氧化还原体系进行反应。
[0003] 最近报道了一种木兰假丝酵母（Candida magnoliae)的羰基还原酶基因（si), 其编码的羰基还原酶（SI)被发现可催化溴代苯乙酮衍生物生成相应卤代醇，但没有关 于利用羰基还原酶Sl还原m-CPC的相关研究和报道。本专利的工作是将其羰基还原 酶基因（si)根据大肠杆菌密码子的偏爱性进行密码子优化并人工合成其基因，命名为 Sysl。为解决辅酶再生问题，利用合成基因 Sysl相同的方法将嗜酸热源体（Thermoplasma acidophilum)中的葡萄糖脱氢酶基因（gdh)进行优化和合成并命名为Sygdh。将二者 构建在含有双启动子的质粒pETDuet-Ι中，并在大肠杆菌BL21(DE3)表达，即E. coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)是一种单菌共表达双酶偶联的体系，可解决生物催化中辅酶的 再生问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是构建一种共表达羰基还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组大 肠杆菌。
[0005] 本发明的技术方案：
[0006] -种新型的共表达羰基还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的大肠杆菌工程菌是指 导入了密码子优化后的木兰假丝酵母（Candida magnoliae)的羰基还原酶基因（si)和嗜 酸热源体（Thermoplasma acidophilum)的葡萄糖脱氢酶基因（gdh)的重组大肠杆菌。 [0007] 所述的木兰假丝酵母（Candida magnoliae)的羰基还原酶基因（si)含有852bp 碱基，其在GeneBank登录号为AB036927,对其进行密码子优化并命名为Sysl。优化后的基 因序列Sysl含有852bp碱基且已提交至GenBank数据库，登录号为KJ522844,其基因序如 SEQ ID NO: 1所示。由该基因编码的羰基还原酶包含283个氨基酸，其GenBank登录号为 AHZ34231，其氨基酸序如 SEQ ID N0:2。
[0008] 所述的嗜酸热源体（Thermoplasma acidophilum)的葡萄糖脱氢酶基因（gdh) 含有1086bp碱基，其在GeneBank登录号为CAC12026,对其进行密码子优化并命名为 Sygdh。优化后的基因序列Sygdh含有1086bp碱基且已提交至GeneBank数据库，登录号为 KF739810,其基因序列入SEQ ID N0:3所示。由该基因编码的葡萄糖脱氢酶包含361个氨 基酸，其GeneBank登录号为AHF81466,其氨基酸序如SEQ ID NO:4。
[0009] 所述重组大肠杆菌的构建方法（见图1)为：人工合成羰基还原酶基因 Sysl和葡 萄糖脱氢酶基因 Sygdh，构建双酶耦合表达载体，并在大肠杆菌中实现共表达，重组蛋白用 SDS-PAGE分析（见图2)。
[0010] 所述的羰基还原酶（SySl)和葡萄糖脱氢酶（SyGDH)的活性测定方法：
[0011] 羰基还原酶（SySl)活性测定：反应体系为200 μ L 0. lmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.0) ，0.2禮隱0?!1，5111111^^(：，加入5(^14且酶液。加入酶液后立即开始扫描反应体系在 340nm处吸光度的变化。酶活定义：每分钟内氧化lymol NADPH所需要的酶量为一个酶活 单位（U)。
[0012] 葡萄糖脱氢酶（Sy⑶H)活性测定：反应为200 μ L 0. lmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.0) 中，0.2mMNADP+，0.1M底物葡萄糖，加入50μL粗酶液。加入酶液后立即开始扫描反 应体系在340nm处吸光度的变化。酶活定义：每分钟内还原lymol NADP+所需要的酶量为 一个酶活单位（U)。
[0013] 所述的（R)-CCE的检测方法：反应结束后，12000rpm，离心5min，取600μ L上清， 加入ImL乙酸乙酯，剧烈振荡5min放置分离有机层和水层。吸取上层乙酸乙酯相，加入适 量无水硫酸镁除去残余水分，所得有机相过滤膜后气相检测。采用CP-Chirasil-DEX CB手 性色谱柱（25mX0. 25nmX0. 25μπι)，检测器FID。分析条件：进样口和检测器温度分别为 220°C和250°C。柱温145°C维持2min，以5°C /min升温至200°C维持5min，载气为氮气，流 量为3mL/min，分流比1:50。
[0014] 本发明的有益效果：本发明构建了羰基还原酶（SySl)基因和葡萄糖脱氢酶 (Sy⑶H)基因共表达的重组菌E. coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)。它避免了添加昂贵的 纯酶和辅酶NADPH，只需添加低成本的辅酶NADP+就可以使得辅酶NADPH高效再生，大大降 低了生产成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图 1 :重组菌 E. coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)质粒图
[0016] 图2 :重组蛋白的SDS-PAGE分析图
【具体实施方式】
[0017] 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详 细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
[0018] 实施例I Sysl基因和Sygdh基因的密码子优化及合成
[0019] 参照大肠杆菌偏爱性密码子表对Sl中的稀有密码子进行优化，并在该基因 N端引 入6个编码组氨酸的标签序列，在两端分别添加 Nde I和Xho I限制性酶切位点。优化后 基因命名为Sysl，由上海Sangon公司合成并与pUCm-T连接，获得重组质粒pUCm-T-Sysl。 同样的方法对gdh进行密码子优化，在两端分别添加 Nco I和Hind III限制性酶切位 点。优化后基因命名为Sygdh，由上海合Sangon公司成并与pUCm-T连接，获得重组质粒 pUCm-T-Sygdh。
[0020] 实施例2表达载体pETDuet-Sygdh-Sysl的构建
[0021] 用限制性内切酶Nde I和Xho I分别对载体pETDuet-Ι和重组质粒pUCm-T-Sysl 进行双酶切，将获得的Sysl基因和线性化载体片段连接，获得的阳性克隆质粒 pETDuet-Sysl。再使用 Nco I 和 Hind III 分别对 pUCm-T-Sygdh 和 pETDuet-Sysl 进行双 酶切，将Sygdh基因插入到pETDuet-Sysl中，构建的连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受 态细胞，经氨苄霉素抗性筛选，获得阳性重组菌E. coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)，并送 至上海Sangon公司测序，测序正确后命名该重组表达质粒为pETDuet-Sygdh-Sysl。
[0022] 实施例 3 重组菌 Ε· coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)的发酵
[0023] 接种重组菌 Ε· coli BL21 (pETDuet-Sygdh-Sysl)于 2mT,含有 100 μ g/mL 氨节青 霉素的LB液体培养基，于37°C、220r/min振荡培养12h。取300 μ L培养液转接于30mL含 有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37°C、220r/min振荡培养至OD6c?为0. 6? 〇. 8时，向培养物中加至终浓度为I. Ommol/L的IPTG，于26°C，220r/min振荡培养10h，4°C 离心收集菌体。菌体用磷酸钾缓冲液（100mm〇l/L、pH 6. 5)悬浮，超声破碎（200w，超声3s， 间歇8s)，4°C离心，测定上清中的酶活，其中SySl酶活力为3. 7U/g(湿菌体），Sy⑶H酶活 力为44. lU/g(湿菌体）。SDS-PAGE分析显示在30. OkDa和41. OkDa有明显条带，表明SySl 和Sy⑶H都成功表达。
[0024] 实施例4辅酶NADPH再生验证
[0025] 在ImL磷酸钾缓冲液（100mmol/L、pH 6. 5)中，力卩入50mg重组菌 E. coliBL21(pETDuet-Sygdh_Sysl)湿菌体，含有终浓度 50mmol/L 葡萄糖、lmmol/L NADPH 或 lmmol/L NADP+、2mmol/L m-CPC;在 37°C、220r/min 条件下反应 12h;同样条件下，在不 加葡萄糖的情况下做为阴性对照，计算产物（R)-CCE的得率，结果（表1)表明，由反应体系 1、2、3、可知葡萄糖脱氢酶参与辅酶的循环，且葡萄糖参与的体系3的产率是体系2的两倍。 体系 3、4、5 可知 NADP+ 和 NADPH 作用相当，说明重组菌 E. Co I i BL21 (pETDuet-Sygdh-Sy s 1) 能够实现辅酶的再生。
[0026] 表1 :不同反应体系分析辅酶再生
[0027] Table I. Analysis of cofactor regeneration with difference reaction systems
[0028]
【权利要求】
1. 一种共表达羰基还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌，导入了密码 子优化后的木兰假丝酵母（Candida magnoliae)的羰基还原酶基因（si)和嗜酸热源 体（Thermoplasma acidophilum)的葡萄糖脱氢酶基因（gdh)并实现了在重组大肠杆菌 BL21(pETDuet-Sygdh_Sysl)中的共表达。
2. 根据权利要求1所述的密码子优化后的木兰假丝酵母（Candida magnoliae)的羰 基还原酶基因（Sysl)含有852bp碱基，登录号为KJ522844,其基因序如SEQ ID N0:1所示。 由该基因编码的羰基还原酶包含283个氨基酸，其GeneBank登录号为AHZ34231，其氨基酸 序如 SEQ ID N0:2。
3. 根据权利要求1所述的密码子优化后的嗜酸热源体（Thermoplasma acidophilum) 的葡萄糖脱氢酶基因（Sygdh)含有1086bp碱基，登录号为KF739810,其基因序列入SEQ ID N0:3所示。由该基因编码的羰基还原酶包含361个氨基酸，其GeneBank登录号为 AHF81466,其氨基酸序如 SEQ ID N0:4。
4. 根据权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法为：克隆羰基还原酶基因Sysl和 葡萄糖脱氢酶基因Sygdh，构建双酶耦合表达载体，并在大肠杆菌中实现共表达。SDS-PAGE 分析显示在30. OkDa和41. OkDa有明显条带，表明SySl和Sy⑶H都成功表达。
【文档编号】C12N1/21GK104388373SQ201410758942
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】邬敏辰, 朱利娟, 吴芹, 李剑芳, 张鹏, 何瑶 申请人:江南大学