Dna条形码鉴别溪黄草及其近属的方法

Dna条形码鉴别溪黄草及其近属的方法【专利摘要】本发明提供一种包括唇形科植物溪黄草和线纹香茶菜的IST2基因序列片段的基因库。本发明还提供一种鉴别唇形科植物溪黄草和线纹香茶菜植物物种的方法，所述方法包括将待鉴别植物物种的植物样品的IST2基因或其序列片段与本发明的基因库进行比较的步骤。本发明还提供IST2基因或其序列片段在鉴别唇形科植物线纹香茶菜和唇形科植物溪黄草中的用途。本发明证明了IST2序列具有通用、易扩增、易比对的特点，并且在唇形科植物线纹香茶菜与唇形科植物溪黄草中，具有良好的扩增性和鉴别效果。【专利说明】DNA条形码鉴别溪黄草及其近属的方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于植物物种鉴定领域，具体而言，本发明涉及唇形科植物溪黄草和线纹香茶菜的物种鉴别方法。【
背景技术：
】[0002]中药溪黄草是广东福建一带居民传统用药，其利湿退黄，用于肝炎、急慢性胆囊炎、痢疾等疾病的治疗，并作为凉茶日常保健食用。[0003]在中药界，部分中药材的名字与其基原，即植物分类学名字不一致。中药溪黄草就存在着这种状况，民间传统使用的中药溪黄草是唇形科植物线纹香茶菜[拉丁名为Rabdosialophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)H.Hara或Isodonstriatus(Benth.)Kudo]及其变种纤花香茶菜[拉丁名为Rabdosialophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)H.Haravar.graciliflora(Benth.)Η·Hara或lsodonlophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)Η·Haravar.gracilifIora(Benth.)H.Hara];同时，由于没有相关标准规范，在药材市场上有唇形科植物溪黄草[拉丁名为lsodonserra(Maxim.)Kudo或Rabdosiaserra(Maxim.)H.Hara]混同使用；另外，相关学术专著及地方标准专著中收录的溪黄草的基原不一致，关于基原的确定及品种的鉴别都有矛盾之处：《常用中草药手册》、《广东中兽医常用草药》、《全国中草药汇编》（上册）、《中药大辞典》及广东、广西、湖南等地方的中药材标准，均记载为溪黄草的基原是线纹香茶菜lsodonlophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)Hara)，其中《广东省中药材标准》第二册同时将植物溪黄草Rabdosiaserra(Maxim.)H.Hara作为基原之一收录进去，但是在植物鉴别中，溪黄草Rabdosiaserra(Maxim.)H.Hara的一些生药特征不符合标准。（本专利申请下文中所述"溪黄草"均指的是唇形科植物溪黄草[拉丁名为Isodonserra(Maxim.)Kudo或Rabdosiaserra(Maxim.)H.Hara]，而不是中药溪黄草）[0004]植物溪黄草与线纹香茶菜为双子叶植物唇形科下的两个种，新鲜的植株上两者的茎、叶等形态外观上差异大，但经干燥或切段后两者不易分辨。在市场流通的中药材通常为干品。有效的鉴别方法既能区别植物溪黄草与线纹香茶菜，又能在基原的确立研究中提供部分技术手段。[0005]目前针对这两种植物及饮片的鉴别方法有性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定等方法。这些现有技术对操作人员的经验依赖度高，而传统鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状特征是与环境紧密相关的表现型，在鉴别时易受环境因素影响及样品形态和材料部位的限制，出现误差。[0006]中药的品种真伪鉴别直接关系到用药安全及临床疗效。因此，目前迫切需要提供能够准确鉴定溪黄草植物物种、从而能够帮助准确用药的新方法。[0007]分子生物学鉴定是目前应用DNA分子标记技术来鉴定中药原植物及其药材和饮片的新方法。简而言之，从分子遗传角度来看，物种的表现型归根结底应追溯到基因型的差异，即在DNA序列上的差异。因此，对基因组序列差异的比较研究为植物分类和鉴定提供了最本质的依据。[0008]近年来，随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已广泛用于药用植物遗传多样性、系统学、分类学研究，并逐渐渗透到中草药的鉴定领域，推动了中草药鉴定研究的发展。DNA分子作为遗传信息的载体，信息含量大，在同种内具有高度的遗传稳定性，且不受外界环境因素和生物发育阶段及器官组织差异的影响，因此用DNA分子特征作为遗传标记进行中草药鉴别具有更为准确可靠，非常适用于近缘种、易混淆品种、珍稀品种等的植物鉴定。[0009]目前，用于中草药鉴定的分子标记技术主要有"限制性片段长度多态性"(RFLP)技术、"随机扩增多态DNA"（RAPD)技术、"微卫星"（SSR)技术、ISSR标记技术、"扩增片段长度多态性"（AFLP)技术等等，及DNA条形码技术（DNAbarcoding)。其中，DNA条形码鉴定是分子鉴定的最新进展，其定义为利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来对物种进行快速、准确地识别和鉴定分子诊断新技术。其优势在于，只需一个或少数几个合适的基因片段即可对整个属、科的绝大部分物种进行准确的鉴别；鉴别速度更快；重复性和稳定性高；实验过程简单化、标准化，更易实现物种鉴别的自动化。DNA条形码鉴定技术是传统鉴别方法的有效补充，能够实现中药基原鉴定的标准化，有助于缓解传统鉴定人才缺乏的现状。[0010]在利用DNA条形码技术鉴定植物时，DNA条形码的筛选及确定是重要一环。通常，DNA条形码筛选有以下标准：（1)标准的短片段；（2)要有足够的变异可将物种分开来，种间差异比较大，便于进行种与种的区分，种内序列变异尽量小，从而使种间和种内变异有一个明晰的界定；（3)序列两段相对保守，以方便引物的设计。[0011]因为缺乏通用引物使其成功扩增，植物核基因组的大多数单拷贝基因和它们的内含子首先被排除作为条形码的候选者。另有研究者提出，核DNA的内部转录空间ITS和ITS2则可能成为潜在的DNA条形码序列。并且，叶绿体基因组的基因及其内含子的研究发现，psbA-trnH的非编码区和ITS可能作为潜在的DNA条形码序列用于鉴定多样性的被子植物物种。还有人提出，matK基因可以作为通用条形码鉴定有花植物，而matK和psbA-trnH两者都适用于肉豆蘧科植物。因此，迄今为止，对于适用于植物鉴定的DNA条形码，目前已先后提出了matK、psbA-trnH、rbcL、rpoCl、rpoB、matK、ITS2等序列，但是没有一个条形码能在所有植物科属种内适用。[0012]已有一些研究者尝试将DNA分子生物学鉴定方法用于鉴定溪黄草，如利用RAro技术来进行鉴定。RAro技术是第二代分子标记技术，没有DNA条形码技术稳定。并且，虽然研究者不断地完善DNA条形码技术在植物物种鉴定中的应用，但是由于目前还有报道任何一条DNA条形码可以适用所有植物的鉴别，因此对具体的植物物种，仍需要进行实验来寻找到合适的基因序列作为DNA条形码使用。[0013]基于上述情况，目前如要利用DNA条形码技术来对唇形科植物线纹香茶菜与唇形科植物溪黄草进行准确鉴定，需要对可能使用的DNA条形码进行筛选，找到最适合的基因序列作为DNA条形码。【
发明内容】[0014]本发明的一个目的是提供最适合鉴别溪黄草和线纹香茶菜的DNA条形码，即特定的DNA序列。[0015]本发明的另一个目的是，通过采集已确定物种的溪黄草、线纹香茶菜（包括变种纤花香茶菜）原产地的多份样品，建立溪黄草、线纹香茶菜的DNA条形码基因库。[0016]本发明的又一个目的是，通过将新的待检样品与该DNA条形码基因库的基因片段进行比对，建立该未知样品的鉴别方法。[0017]本发明的再一个目的是，提供该DNA条形码或基因库在溪黄草和线纹香茶菜中的用途。[0018]本发明的具体技术方案如下：[0019]一方面，本发明人经过大量实验，就溪黄草、线纹香茶菜和纤花香茶菜的DNA条形码基因的筛选，从ITS2、matK、pSbA-trnH3个序列中筛选出最适合溪黄草、线纹香茶菜鉴别的DNA条形码，即ITS2基因或ITS2基因的序列片段。[0020]ITS2为高等植物的核糖体DNA的组成部分，为第二内转录间隔区。目前，核基因组序列在药用植物鉴定和品质研究中的应用主要集中在编码核糖体RNA基因（nrDNA)重复区内。高等植物细胞核中nrDNA是一些高度重复的串联序列组成的多基因家族，每个重复单位从5'端开始，包括外转录间隔区（ETS)、18S基因、第一内转录间隔区（ITSl)、58S基因、第二内转录间隔区（ITS2)和26S基因，重复单位之间为基因间隔区（IGS)或称为非编码区(NTS)。nrDNA的编码区序列（18S、58S和26S基因）为高度保守区，序列差异主要表现在非编码区序列上，而ITS区是中度保守区，序列的变异度处于两者之间。nrDNA高度保守的编码区序列主要用于种、属以上分类层次的研究中，非编码区序列（ETS、IGS/NTS)和中度保守的重复序列则比较适合于近缘类群和居群间关系的研究。[0021]本发明人经过筛选研究发现，相比于其它基因诸如matK、psbA-trnH，ITS2序列具有通用、易扩增、易比对的特点。并且，但本发明人发现，在唇形科植物线纹香茶菜和唇形科植物溪黄草中，ITS2基因有良好的扩增性和鉴别效果，可以作为DNA条形码而用于鉴别上述植物物种。[0022]因此，本发明在此方面提供ITS2基因或其序列片段在鉴别唇形科植物线纹香茶菜和唇形科植物溪黄草中的用途。其中，所述ITS2基因序列片段优选通过采用下述序列作为引物从待鉴别植物样品的基因组DNA中扩增得到：SEQIDNO.37和SEQIDNO.38。[0023]另一方面，本发明提供了包括溪黄草和线纹香茶菜（包括变种纤花香茶菜）的ITS2基因序列片段的基因库。具体而言，首先采集溪黄草、线纹香茶菜原产地的多份样品，以植物传统分类学方法鉴别各自的物种，然后分别提取其基因组DNA，以其基因组DNA为模板，采用特定引物序列、优选SEQIDNO.37和SEQIDNO.38扩增样品的ITS2基因序列片段，由此建立包括溪黄草和线纹香茶菜的ITS2基因序列片段的基因库。所述基因库包括下述序列编号所示的ITS2基因序列片段：SEQIDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36。其中，SEQIDNO.1-8为以植物传统分类学方法鉴定为溪黄草样品各自的ITS2基因序列片段；SEQIDNO.9-10为以植物传统分类学方法鉴定为线纹香茶菜样品各自的ITS2基因序列片段；SEQIDNO.11-36为以植物传统分类学方法鉴定为线纹香茶菜（变种纤花香茶菜）样品各自的ITS2基因序列片段。[0024]又一方面，本发明提供了溪黄草和线纹香茶菜植物物种的鉴别方法，所述方法包括下述步骤：[0025]1)提取待鉴别植物的基因组DNA;[0026]2)以步骤1)得到的基因组DNA为模板，扩增ITS2基因或其序列片段；[0027]3)将步骤2)得到的ITS2基因或其序列片段与本发明提供的基因库进行比较，从而鉴别所述待鉴别植物的物种。[0028]在本发明提供的鉴别方法中，步骤1)中可以采用任何植物基因组DNA提取方法或商业提取试剂盒进行。根据本发明的【具体实施方式】，取待鉴别植物的样品例如叶片，使用75%乙醇水溶液擦洗表面后晾干，称取5mg-2g，经液氮研磨后，用植物基因组DNA提取试剂盒进行提取。[0029]步骤2)中可以采用任何可扩增ITS2基因或其序列片段的条件进行。根据本发明的【具体实施方式】，在扩增待鉴别植物样品的ITS2基因序列片段时，其引物及扩增条件如下所示：[0030]引物--[0031]SEQIDNO.37(正向）：ATGCGATACTTGGTGTGAAT[0032]SEQIDNO.38(反向）：GACGCTTCTCCAGACTACAAT[0033]反应体系-[0034]ExTaqMix25y1,上、下游引物各L0μI,DNA模版3·0μ1,加灭菌蒸馈水至50μ1[0035]反应程序--[0036]95°C，5min;94°C-30s，56°C_lmin，72°C-45s，40次循环；72°C-IOmin检测、测序和结果处理--[0037]采取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。电泳后，PCR产物应在相应的DNA条形码序列长度位置出现一条目的条带，阴性对照应无条带。将有PCR扩增条带的样品送测序公司进行DNA序列测定，使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，PCR扩增引物作为测序引物。测序结果采用序列拼接软件CodonCodeAlignerV2.06(CodonCodeCo,USA)校对拼接，去除低质量序列及引物区，序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。[0038]在步骤3)中，在将步骤2)得到的ITS2基因或其序列片段与本发明提供的基因库进行比较时，相似度最高或匹配度最高或遗传距离最小的对应物种即为待鉴别植物的物种。可以通过将待鉴别植物的序列与基因库内已有的序列之间的进行比对，获得多个序列间的相似性，得出其物种类别。BLAST分析、距离法、建树法都是基于序列比对鉴别物种的方法。[0039]根据本发明的【具体实施方式】，将待鉴别样品的ITS2基因序列片段与此基因库的所有ITS2基因片段进行比对，获得待鉴别植物的序列与基因库内已有的多个序列之间的多个最小变异值，再跟已计算出的溪黄草和线纹香茶菜的种内最大变异值比较，进行结果判定。如：根据实施例1所述，溪黄草ITS2基因和线纹香茶菜ITS2基因的种内最大变异值分别为"4.8"和"1.4"，采用序列比对的计算机软件，如MatGat2.01、MEGA5、VectorNTISuite组件AlignX等，对待鉴别植物的序列与基因库内的线纹香茶菜的多个序列之间逐个两两比对，得到多个序列间最小变异值，这些值等于或低于1.4,则对应物种为线纹香茶菜；同样采用计算机软件计算待鉴别植物的序列与基因库内的溪黄草的多个序列之间的遗传距离，得到多个序列间最小变异值，这些值等于或低于4.8,则对应物种为溪黄草。[0040]具体而言，首先，将从待鉴别样品获得的ITS2基因序列片段峰图文件导入CodonCodeAlignerV3.7进行拼接，然后人工检查拼接效果，包括（1)调整序列正反向(edit一reversecomplement)，（2)去除引物或其他边界序列（sample-trimvector…），(3)查看剩余碱基质量值（qual需要大于等于20)，最后导出一致序列为标准条形码数据。然后，将此标准条形码数据与ITS2基因序列片段的基因库的数据一起导入序列比对软件(MatGat2.01)，选择默认计分矩阵（ScoringMatrix:blosum50)进行多重比对（align)，保存计算结果（Similaritytable)，数值保留小数点后一位，根据后续软件TaxonGap所需格式调整（两个txt文件，一个是物种名称目录，一个为物种DNA序列比对结果，即相似性矩阵）。接下来，利用软件TaxonGap2.4.1查看鉴别结果。在软件主界面导入物种名称目录（Files-DataFiles一Load)，在Biomarker选项下导入物种DNA序列比对结果(Biomarker一Add一Load一Save)，其他次要参数可参考软件说明书进行设置。运行软件后(Run-Execute)获得结果，在txt文件的适宜图中，查看待检样品序列与溪黄草、线纹香茶菜（包括变种纤花香茶菜）各个样品序列分别对应的"种间最小变异值"（假设待鉴别样品是一个新物种），若待检样品序列与溪黄草各样品的序列片段之间的最小变异值（即"种间最小变异值"）等于或小于4.8,即可判定该待检物种为溪黄草；若待检样品与线纹香茶菜各样品的序列片段之间的最小变异值（即"种间最小变异值"）为1.4,即可判定该待检物种为线纹香茶菜。[0041]也可以采用诸如下述其它方法，这几种方法也是通过序列比对、比较匹配度或比较相似性等，确认物种之间的归属：[0042]BLAST分析-[0043]来源于未知样品的DNA条形码序列（querysequence)与DNA条形码数据库（referencelibrary)进行比对，如果在DNA条形码数据库中找到完全一样的序列(referencesequence),那么未知样品就是该referencesequence对应的物种；反之未知样品在数据库中不存在。可利用下面的方法进一步鉴定，在这种情况下，需要重点关注与未知样品DNA条形码序列最相关10个序列的物种，或者比对中出现频率最商的物种，可以将未知样品确定为某一科属。同时该方法也可直接与GenBank数据库进行比对，以保证利用全球最新的核苷酸数据指导鉴定。[0044]距离法--[0045]计算未知样品DNA条形码序列（querysequence)与数据库中每一个序列(referencesequence)的遗传距离，未知样品应为具有最小平均遗传距离（meandistance)的物种或者具有最小遗传距离（nearestdistance)的物种。遗传距离的阈值（threshold)是在"构建药用植物DNA条形码鉴定平台"过程中确定的，理论上对同一个物种，取样涵盖了其全部的地理分布（不同居群）和同一居群中的足够个体，该阈值可以准确反映该物种的遗传变异大小，也有利于更好地确定未知样品的物种，但考虑到研究成本，一般认为同一物种取样最好包括5个居群，每个居群2个个体。[0046]建树法-[0047]先应用CLUSTAL进行MSA，选用合适的遗传距离模型（一般用K2P距离模型）计算种内和种间的遗传距离，应用MEGA或PAUP等软件构建NJ、UPGMA、MP等系统发育树，检验未知样品的DNA条形码序列（querysequence)与数据库中序列（referencesequence)聚类在一起的物种，根据聚类情况进一步确定物种。[0048]成对序列比对法--[0049]通过以上方法仍不能将未知样品鉴别到种时，可以将未知样品与密切相关的10个物种的referencesequence进行成对比对，通过分析碱基变异位点来鉴别物种，或判断为新种，或判断为referencelibrary中尚未收录的物种。[0050]相比于现有技术，本发明作出了以下贡献和有益效果：[0051]首先，本发明对溪黄草、线纹香茶菜和纤花香茶菜的基因条形码进行筛选，从ITS2、matK、psbA-trnH3个基因序列中筛选出最适合鉴别溪黄草和线纹香茶菜的DNA条形码，即ITS2基因或其序列片段。相比于其他基因，ITS2序列具有通用、易扩增、易比对的特点。并且，本研究发现，在唇形科植物线纹香茶菜与唇形科植物溪黄草中，ITS2具有良好的扩增性和鉴别效果。[0052]第二，本发明经过采集溪黄草、线纹香茶菜和线纹香茶菜（变种纤花香茶菜）原产地的多份样品，得到了包括ITS2基因片段的基因库，从而建立了溪黄草和线纹香茶菜（包括变种纤花香茶菜）的标准ITS2序列基因库。[0053]第三，基于上述发现，本发明还建立了新样品的鉴别方法，包括将新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对，判断新样品的物种。特别是通过计算种内种间变异值；对于基因库内的溪黄草和线纹香茶菜（包括变种纤花香茶菜）序列，已经计算出溪黄草和线纹香茶菜（包括变种纤花香茶菜）各自的种内最大变异值和两个物种间的种间最小变异值，当新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对后，得到多个序列间最小变异值(即"种间最小变异值"），这些值等于或小于已计算出的某物种的种内最大变异值，可视为与其同一物种。此鉴别方法可以鉴别溪黄草和线纹香茶菜的全草、器官及饮片。相比于溪黄草和线纹香茶菜的现有鉴别方法，本发明的方法具有对于样品的完整程度要求低，鉴别指标可以量化的优点。【专利附图】【附图说明】[0054]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：[0055]图1显示了本发明提供的DNA条形码鉴定方法效果图，其以植物物种为类别，采用TaxonGap法。其中种间最小变异值显示为深色条；种内最大变异值显示为浅色条，Rs代表物种溪黄草，Rlvg代表物种纤花香茶菜，Rl代表物种线纹香茶菜。【具体实施方式】[0056]以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。[0057]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。[0058]实施例IDNA条形码的筛选和包括IST2基因序列片段的基因库的建立[0059]本实施例就溪黄草、线纹香茶菜和线纹香茶菜（变种纤花香茶菜）的DNA条形码基因的筛选，从ITS2、matK、psbA-trnH3个序列中筛选出最适合溪黄草和线纹香茶菜鉴别的DNA条形码，即IST2基因序列片段。此外，本实施例建立了包括溪黄草和线纹香茶菜（包括变种纤花香茶菜）的IST2基因序列片段的基因库。[0060]1仪器、材料与试药[0061]1.1材料[0062]在7个采样点（广东，福建），收集了溪黄草、线纹香茶菜和线纹香茶菜（变种纤花香茶菜）共36份样品，详细情况见下表1。下述条形码筛选实验以植物叶片为材料。[0063]表1样品信息表[0064]【权利要求】1.一种包括唇形科植物溪黄草和线纹香茶菜的ITS2基因序列片段的基因库，所述基因库包括下述序列编号所示的ITS2基因序列片段：SEQIDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36。2.-种鉴别唇形科植物溪黄草和线纹香茶菜植物物种的方法，所述方法包括将待鉴别植物的ITS2基因或其序列片段与根据权利要求1所述的基因库进行比较的步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：1)提取待鉴别植物的基因组DNA;2)以步骤1)得到的基因组DNA为模板，扩增ITS2基因或其序列片段；3)将步骤2)得到的ITS2基因或其序列片段与根据权利要求1所述的基因库进行比对，从而鉴别所述待鉴别植物的物种。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中采用下述序列作为引物从所述待鉴别植物的基因组DNA中扩增ITS2基因序列片段：SEQIDNO.37和SEQIDNO.38。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中通过将步骤2)得到的ITS2基因或其序列片段与根据权利要求1所述的基因库内已有的序列之间进行比对，获得所述待鉴别植物的序列与基因库内已有的序列之间的相似性，从而鉴别所述待鉴别植物的物种。6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中在将步骤2)得到的ITS2基因或其序列片段与根据权利要求1所述的基因库进行比对时，相似度最高或匹配度最高或遗传距离最小的对应物种即为待鉴别植物的物种。7.ITS2基因或其序列片段在鉴别线纹香茶菜和溪黄草中的用途。8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述ITS2基因序列片段为通过采用下述序列作为引物从待鉴别植物的基因组DNA中扩增得到：SEQIDNO.37和SEQIDNO.38。9.根据权利要求1所述的基因库在鉴别线纹香茶菜和溪黄草中的用途。【文档编号】C12Q1/68GK104404129SQ201410189343【公开日】2015年3月11日申请日期:2014年5月6日优先权日:2014年5月6日【发明者】张慧晔,马新业,李楚源,王德勤,詹若挺申请人:广州白云山和记黄埔中药有限公司