生产啶南平的方法
【专利摘要】提供了用啶南平A生物合成所必需的中间体化合物培养微生物制备啶南平的方法，在所述微生物中引入特定多核苷酸或包含其的重组载体。
【专利说明】生产啶南平的方法
本申请为2011年I月19日提交的、发明名称为“生产啶南平的方法”的PCT申请PCT/JP2011/050851的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2012年7月26日，申请号为 201180007262.5。
[与相关申请的交叉引用]
[0001]此专利申请要求在2010年I月26日提交的日本专利申请号14727/2010的优先权，将其全部公开引入本文作为参考。
[发明背景]
[0002]发明领域
本发明涉及一种生产唳南平(pyripyropene)的方法,更具体地,一种生产唳南平A,E,O等的方法。
[0003]【背景技术】
如在日本专利特开公报号(Laid-Open Publication N0.) 360895/1992 (专利文件I)和Journal of Antibiotics (1993)，46 (7)，1168-9 (非专利文件I)中公开的啶南平A，具有针对ACAT(酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶)的抑制活性，有望将其应用于治疗由胆固醇积累引起的疾病等等。
[0004]作为产唳南平A的真菌，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)FQ-1289菌株已在日本专利特开公报号360895/1992 (专利文件I)中公开:Eupenicillium reticulosporumNRRL-3446 菌株已在 Applied and Environmental Microbiology (1995), 61 (12),4429-35 (非专利文件2)中公开:灰黄青霉(Penicillium griseofulvum) F1959菌株已在W02004/060065 (专利文件 2)中公开:和粪牛.青霉(Penicillium coprobium) PFl 169 菌株已在 Journal of Technical Disclosure500997/2008 (专利文件 3)中公开。
[0005]此外，作为唳南平A的生物合成途径，在Journal of Organic Chemistry (1996),61,882-886(非专利文件 3)和 Chemical Review (2005)，105，4559-4580 (非专利文件 4)中已公开了在烟曲霉F0-1289菌株中假定的生物合成途径。这些文件公开了在烟曲霉F0-1289菌株中，通过环化酶连接分别由聚酮合酶或异戊烯转移酶合成的部分结构以合成啶南平A。
[现有技术参考]
[专利文件]
[0006][专利文件I]日本专利特开公报号360895/1992 [专利文件 2]W02004/060065
[专利文件 3] Journal of Technical Disclosure500997/2008
[非专利文件]
[0007][非专利文件 I] Journal of Antibiotics (1993), 46 (7), 1168-9.[非专利文件 2] Applied and Environmental Microbiology (1995) ,61 (12)，4429-35.[非专利文件 3] Journal of Organic Chemistry (1996), 61,882-886.[非专利文件 4] Chemical Review (2005)，105，4559-4580.[发明概述]
[0008]本
【发明者】现在发现，能够通过用啶南平A生物合成所必需的中间体化合物培养微生物生产啶南平A或类似物，在所述微生物中引入特定多核苷酸或包含其的重组载体。已基于这些发现产生了本发明。
[0009]因此，本发明的一个目的是提供一种生产啶南平A的方法。
[0010]此外，根据本发明的一个实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培养导入有以下(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体的微生物，并通过啶南平O分离啶南平A:
(I)分离的多核苷酸，其具有选自以下(a)至(d)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序
列:
(a)SEQ ID NO:266的核苷酸序列，
(b)核苷酸序列，其能够在严格条件下与SEQID NO:266的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与SEQ ID NO:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白，
(C)SEQ ID NO:266的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与SEQ ID NO:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白，和
(d)核苷酸序列，其与SEQ ID NO:266的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一性，且其编码与SEQ ID NO:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(II)分离的多核苷酸，其具有编码选自SEQID NO:267至275的至少一个氨基酸序列或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和
(III)分离的多核苷酸，其具有选自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:
(I)在以下(a)至⑴中的核苷酸序列:
(a)SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从3342至5158的核苷酸序列，
(b)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从5382至12777的核苷酸序列，
(c)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列，
(d)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列，
(e)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从18506至19296的核苷酸序列，
(f)SEQ ID NO: 266中显示的核苷酸序列的从19779至21389的核苷酸序列，
(g)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列，
(h)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，和
(i)SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能够在严格条件下与(I)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一个或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其与(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一'丨生,且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
[0011]另外，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培养微生物，其中引入上述(I)至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并通过啶南平E和啶南平O分离啶南平A。
[0012]此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E, 6E) -3, 7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)_2H_ 吡喃-2-酮(4-hydroxy-6- (pyridin-3-yl)-3- ((2E, 6E)-3, 7, Il-trimethyldodeca-2, 6, 10-trienyl) -2H-pyran-2-one)的方法，其特征在于用4_氧-6- (3-吡唳基)_ α -吡喃酮(4-οχο-6-(3-pyridyl) - a -pyrone)培养微生物,其中引入上述⑴至(III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
[0013]根据本发明的另一个实施方案，提供了上述(I)至(III)中的至少一种分离的多核苷酸。
[0014]此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了重组载体，其选自pPP6 (用质粒pPP6转化的米曲霉(Aspergillus oryzae)的登记号:FERM BP-11218), pPP7 (用质粒pPP7转化的米曲霍的登记号:FERM BP-11219)和pPP9(用质粒pPP9转化的米曲霍的登记号:FERMBP-11220)。
[0015]此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了转化体，其包含选自质粒pPP6，pPP7和pPP9的一种或多种载体。
[0016]根据本发明的另一个实施方案，提供了上述重组载体用于生产啶南平A的用途。 [0017]根据本发明的另一个实施方案，提供了上述转化体用于生产啶南平A的用途。
[0018]根据本发明的生产方法，能够通过基因重组技术生产啶南平A，E，O等等。因此本发明的生产方法对啶南平A，E，O等等的大量生产技术具有重大贡献。
[附图简述]
[0019][图1]图1显示了PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。用于电泳，使用以下引物扩增PCR产物:M:分子量标记(IOObp梯)，泳道1: SEQ ID NO:1 2的引物，泳道2:SEQ IDNO: 239 和 240 的引物，泳道 3: SEQ ID NO: 237 和 238 的引物，泳道 4: SEQ ID NO: 241 和 242 的引物，泳道5: SEQ ID NO: 247和248的引物，泳道6: SEQ ID NO: 251和252的引物，泳道7: SEQID NO:245 和 246 的引物，泳道 8:SEQ ID NO:243 和 244 的引物，泳道 9:SEQ ID NO:249 和250的引物，泳道10: SEQ ID NO: 235和236的引物，泳道11: SEQ IDNO: 233和234的引物，泳道 12:SEQ ID NO:227 和 228 的引物，泳道 13:SEQ ID NO:229 和 230 的引物，泳道 14:SEQ IDNO:231和232的引物。
[图2]类似图1，图2显示了 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。用于电泳，使用以下引物扩增PCR产物:M:分子量标记(IOObp梯)，泳道1: SEQ ID NO: 253和254的引物，泳道2: SEQ IDN0:257 和 258 的引物，泳道 3:SEQ ID NO:259 和 260 的引物，泳道 4:SEQ ID NO:255和256的引物，泳道5:SEQ ID NO:261和262的引物。
[图3]类似图1，图3显示了 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。用于电泳，使用以下引物扩增PCR产物:泳道1:分子量标记(IOObp梯)，泳道2:SEQ ID NO:264和265的引物(400bp扩增片段)。
[图4]图4显示了 pUSA的质粒图谱。
[图5]图5显示了 pPP2的质粒图谱。[图6]图6显示了 P450-2cDNA扩增的方案。
[图7]图7显示了 pPP3的质粒图谱。
[图8]图8显示了啶南平E在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
[图9]图9显示了用质粒pPP2转化的米曲霉的培养产物在氘化乙腈中的1H-NMR谱。 [图10]图10显示了啶南平O在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
[图11]图11显示了显示了用质粒PPP3转化的米曲霉的培养产物在氘化乙腈中的1H-NMR 谱。
[图12]图12显示了质粒pPP6，pPP7和pPP9的质粒图谱。
[发明详述]
[0020]微牛物保藏
用质粒pCCl-ΡΡΙ转化的大肠杆菌(Escherichia coli)(,大肠杆菌EPI300tm_T1r)已被保藏至专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary),独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(地址:日本茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6 (邮政编码305 — 8566)(AIST Tsukuba Central6,1-1-1Higashi，Tsukuba, Ibaraki, Japan, 305-8566)),登记号为自2008年10月9日(原始保藏日期)起的FERMBP-11133(从登记号为FERMP-21704的国内保藏移管)(保藏者所 用的识别标识(identification reference):大肠杆菌EPI300?-T1R/pCCl-PPl)。
[0021]用质粒pPP2转化的米血霊已被保藏至专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址:日本茨城县筑波市东 I 丁目 I 番地I中央第6(邮政编码305 - 8566))，登记号为自2009年6月23日起的FERM BP-11137 (保藏者所用的识别标识:米曲霉PP2-1)。
[0022]用质粒pPP3转化的米血霊已被保藏至专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址:日本茨城县筑波市东 I 丁目 I 番地I中央第6 (邮政编码305 - 8566))，登记号为自2009年7月3日起的FERM BP-11141 (保藏者所用的识别标识:米曲霉PP3-2)。
[0023]用质粒pPP6转化的米血霊已被保藏至专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址:日本茨城县筑波市东 I 丁目 I 番地I中央第6 (邮政编码305 — 8566))，登记号为自2009年12月21日起的FERM BP-11218 (保藏者所用的识别标识:米曲霉PP6)。
[0024]用质粒pPP7转化的米血霊已被保藏至专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址:日本茨城县筑波市东 I 丁目 I 番地I中央第6 (邮政编码305 — 8566))，登记号为自2009年12月21日起的FERM BP-11219 (保藏者所用的识别标识:米曲霉PP7)。
[0025]用质粒pPP9转化的米血霊已被保藏至专利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),独立行政法人产业技术综合研究所(Nat1nal Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址:日本茨城县筑波市东 I 丁目 I 番地I中央第6 (邮政编码305 — 8566))，登记号为自2009年12月21日起的FERM BP-11220 (保藏者所用的识别标识:米曲霉PP9)。
[0026]生产啶南平的方法
本发明涉及一种生产啶南平的方法，其中通过用啶南平A生物合成所必需的中间体化合物培养微生物得到次级代谢产物，在所述微生物中引入参与啶南平A生物合成的基因。
[0027]啶南平A生物合成途径的实例包括以下方案I。
[表1]
【权利要求】
1.一种生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-α -吡喃酮培养导入有下面(VIII)至(IX)中的至少一种所述多核苷酸或包含其的重组载体的微生物，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2Ε, 6Ε) -3，7，11-三甲基十二碳_2，6，10-三烯)-2Η-吡喃-2-酮: (VIII)分离的多核苷酸，其为编码SEQID NO:273的氨基酸序列的核苷酸序列； (IX)多核苷酸，其为SEQID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列。
2.根据权利要求1的生产4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2Ε, 6Ε) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2Η-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6-(3-吡啶基)-α -吡喃酮培养包含下述质粒，即包含SEQ ID NO:266的从21793至22877的核苷酸的质粒的微生物，并分离4-羟基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳_2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
3.至少一种分离的多核苷酸，其选自以下(b)和(h): (b)多核苷酸，其编码由SEQ ID NO:273的氨基酸序列组成的多肽，和 (h)分离的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列 。
4.重组载体，其为包含SEQID NO:266的从21793至22877的核苷酸的质粒。
5.包含载体的转化体，所述载体为包含SEQID NO:266的从21793至22877的核苷酸的质粒。
6.根据权利要求4的所述重组载体用于生产啶南平A和/或生产其中间体的用途。
7.根据权利要求5的所述转化体用于生产啶南平A和/或生产其中间体的用途。
【文档编号】C12N5/10GK104017839SQ201410218973
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2011年1月19日 优先权日:2010年1月26日
【发明者】安西弘行, 山本憲太朗, 尾山和彦, 土田麻里子, 后藤公彦, 三富正明 申请人:明治制果药业株式会社