屠宰厂废水养殖球等鞭金藻和异胶藻的培养基及培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用屠宰厂废水养殖海洋单胞藻的方法。利用屠宰厂废水养殖藻类，变废为宝，既处理了废水，又得到了用途极大的单胞藻产品，一举两得；我在以屠宰厂废水为基本原料的培养基中加入了酵母膏，葡萄糖，L-谷氨酸，土壤抽出液，S3维生素溶液等成分，并通过充气管向藻液充入混合气体，营养更加全面、均衡，单胞藻生长速度大大提高，产量提高240％；而且，与传统的单种培养相比，两种单胞藻混合培养有利于发挥不同单胞藻营养需求的差异和互利共生作用，优势互补，相互促进，更加充分地利用营养盐，更加高效地吸收光能，减少了营养盐的损失，单胞藻产量和经济效益大大提高。
【专利说明】屠宰厂废水养殖球等鞭金藻和异胶藻的培养基及培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋单胞藻养殖领域，涉及一种利用屠宰厂废水养殖海洋单胞藻的方法，尤其涉及一种利用屠宰厂废水混合养殖球等鞭金藻和异胶藻的培养基及培养方法。
【背景技术】
[0002]屠宰废水是一种高浓度有机废水，是我国最大有机污染源之一。随着经济发展和人民生活水平的提高，肉类加工业将有更大发展，因而屠宰废水污染有不断加剧趋势。据调查，我国生猪日宰量50-5000头的屠宰场已有600多家，每年排放废水20亿吨左右，占全国工业废水排放量6%。屠宰过程中排放废水含有大量血污、油脂、毛、内脏杂物、未消化食物及粪便等，并带有令人不适的血红色及血腥味，且含有大肠菌、粪便链球菌等致病菌，威胁人体健康。废水具有浓度变化大、有机物含量高特点，如果不经处理直接排放，大量悬浮物和有机物将会迅速消耗水体溶解氧，恶化水质，影响生活和生产用水，同时致病菌进入水体，成为传染病源。因此，屠宰废水治理对保护环境和人类健康十分重要。根据屠宰废水可生化性强的特点，目前多采用生物方法治理，常用的活性污泥法有:完全混合曝气法、延时曝气法、射流曝气法、深井曝气法，常用的生物膜法有:生物转盘、生物滤池及生物接触氧化法。化学絮凝法常用絮凝剂有:铁盐、铝盐及聚合硫酸铁、碱式氯化铝。但单独使用一种方法处理都不能达到排放要求，即使是较好的加压生化法，COD去除率也只能达到80%左右，而采用屠宰废水养殖单胞藻则是一条理想的方法，对C0D、SS、NH3-N的平均去除率分别可达98^^96^^99%,既能处理废水，又得到了有重要饵料价值的单胞藻产品，一举两得。
[0003]球等鞭金藻Isochrysis galbana是一种分布广泛的海洋浮游单细胞藻类,属金藻门，金藻纲，等鞭金藻目，等鞭金藻科，等鞭金藻属。因其个体小、繁殖快、营养丰富、运动速度适中，又不含纤维质细胞壁，易被贝类幼虫捕捉、吞食和消化，因而是海产经济动物栉孔扇贝、马粪海胆、日本对虾、牡蛎、文蛤、贻贝、舌鳎、银鲛、鲍鱼、梭子蟹等多种名贵海产经济动物良好饵料。近来又报道，球等鞭金藻富含n-3多不饱和脂肪酸，尤其富含DHA和EPA，具有生产DHA和EPA的潜力。EPA和DHA具有防治心脑血管疾病、促进大脑发育等重要生理功效。该藻在海洋中营浮游生活，属低温品系，经过_8°C冰冻后，还能复苏，适宜水温0-27°C，最适13-18°C;适宜盐度10-35，最适15-30 ;适宜光照强度3000-30000Lux ;适宜pH6_10 ;营二分裂法繁殖，纵向分裂。正常情况下5小时分裂I次；生活于透明度较大、温度较低、有机质含量低的水体。
[0004]异胶藻Hdterogloea sp.是一种海洋单胞藻,适应性强,繁殖迅速,容易培养。属黄藻门，黄藻纲，异囊藻目，异囊藻科，异胶藻属，是紫贻贝、泥蚶、杂色蛤及扇贝幼体最佳饵料。细胞长椭圆形，一侧生黄绿色素体占细胞大部分，无蛋白核。细胞长4-5.5微米，宽
2.5-4微米，二分裂繁 殖；盐度13-31范围正常繁殖，最适盐度20-29 ;适温范围8_35°C，最适 15-330C ;适宜光照强度 1000-8000Lux, ρΗ7.5-8.2。
[0005]球等鞭金藻和异胶藻培养传统上使用f/2培养基并使用开放水泥池培养，藻细胞倍增时间长，生长速度慢，投资大，产量低，容易污染，操作麻烦。使用本发明提供的培养基并使用简易光生物反应器培养球等鞭金藻和异胶藻细胞不饱和脂肪酸含量高，成本低，不易污染，易于操作，大大降低了工作量，而且我在培养基中增加了牛肉浸膏，蛋白胨，酵母膏，葡萄糖，L-谷氨酸，琼脂，可溶性淀粉，海泥抽取液，土壤抽出液，S3维生素溶液等成分，有机肥和无机肥混合搭配使用，营养更加全面、均衡，球等鞭金藻和异胶藻生长速度大幅度提高，培养周期缩短，产量提高240 %。而且，与传统的单种培养相比，混合培养有利于发挥两种单胞藻营养需求的差异和互利共生作用，优势互补，相互促进，更加充分地利用营养盐，更加高效地吸收光能，减少了营养盐的损失，提高了经济效益。
[0006]有益结果:利用屠宰厂废水养殖藻类，变废为宝，既处理了废水，又得到了有重要饵料价值的单胞藻产品，一举两得；我在以屠宰厂废水为基本原料的培养基中加入了牛肉浸膏，蛋白胨，酵母膏，葡萄糖，L-谷氨酸，琼脂，可溶性淀粉，海泥抽取液，土壤抽出液，S3维生素溶液等成分，并通过充气管向藻液充入空气、纯二氧化碳、氨气、甲烷组成的混合气体，营养更加全面、均衡，单胞藻生长速度大大提高，产量提高240% ;传统的光生物反应器照明用的灯都是置于反应器外部，现在我将灯置于反应器内部，减少了光程和光线穿过反应器玻璃壁造成的光能的损耗，提高了光能利用效率；而且传统的水龙头是安置在反应器的侧壁上，制作麻烦，成本高，向外排放藻液时放不干净，总有残存；现在我将它安置在底部，藻液排放彻底、干净，几乎没有残留，操作也很方便。而且，与传统的单种培养相比，两种单胞藻混合培养有利于发挥不同单胞藻营养需求的差异和互利共生作用，优势互补，相互促进，更加充分地利用营养盐，更加高效地吸收光能，减少了营养盐的损失，单胞藻产量和经济效益大大提高。
【发明内容】
[0007]为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种利用屠宰厂废水养殖球等鞭金藻和异胶藻的培养基，配方如下:
[0008]屠宰厂废水50毫升，牛肉浸膏1.0克，蛋白胨1.5克，酵母膏0.5克，葡萄糖2.0克，L-谷氨酸0.1克，琼脂1.5克，可溶性淀粉1.2克，NH4N0315毫克，NaN034毫克，尿素3毫克，KH2PO4L 5毫克，鸡粪浸出液2.5毫升，兔粪浸出液1.8毫升，海泥抽取液1.5毫升，土壤抽出液1.2毫升，S3维生素溶液1.0毫升，次氯酸钠消毒后的纯净海水1000毫升；
[0009]其中S3维生素溶液配方:硫胺素盐酸盐50毫克，尼古丁酸10毫克，泛酸钙10毫克，对氨安息香酸1.0克，维生素H0.1克，肌醇0.5克，叶酸0.2微克，胸间氮苯0.3克，蒸馏水1000毫升；
[0010]一种等鞭金藻和异胶藻混合培养方法，具体步骤如下:
[0011 ] 培养容器为圆柱形有机玻璃反应器，柱高90厘米，直径30厘米，壁厚5毫米，顶部有一盖子，盖子上有3个孔，一个孔插入充气管，另一个孔插入排气管，中间一个孔插入导线，导线末端连着一个100瓦的节能灯。底部按着一个水龙头，将反应器洗刷干净，后用蒸馏水润洗3遍，用漏斗装入权利要求1所述的培养基至水深55厘米，充气混合5分钟，选择生命力旺盛、无污染的球等鞭金藻和异胶藻藻液分别进行接种，先接种球等鞭金藻，接种密度8X104cell/mL，再接种异胶藻，接种密度15X 104cell/mL ;瓶口插入两根干净玻璃管，一根较长，顶端露出瓶口 7-10厘米，下端插入较深，离瓶底5厘米，用以充气；另一根较短，16厘米，两端露出盖子即可，用以排气；两根玻璃管同样粗细，直径6毫米；用干净的透明胶带将两根玻璃管固定；长的玻璃管上端用料管与充气泵相连，充入混合气体，混合气体成分和体积比例是空气:纯二氧化碳:氨气:甲烷=92%: 6%: 1%: 1% ;充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；室内培养，空调控温，最佳温度23±2°C，节能灯照射，光照强度6000-10000Lux，光/暗周期为16L/8D，即光照16小时，黑暗8小时；培养至第6天，停止充气，拿开盖子，补充新鲜培养基至水深60厘米，盖上盖子，充气，继续培养，至第9天，球等鞭金藻和异胶藻密度分别增加至100X IO4ceIVmL和4000X 104cell/mL，停止培养，从底部的水龙头放出藻液，将反应器洗刷干净后，加入中药消毒液消毒30分钟，后进入下一轮培养；
[0012]所述中药消毒液:由以下重量比的物质组成:每100份85%乙醇中加入以下重量份的中药材:板蓝根30~50份、柴胡15~25份、薄荷15~25份、桅子5~15份、艾叶5~15份。中药消毒液制作方法:将新鲜板蓝根、柴胡、薄荷叶、艾叶、山桅果切碎，于60-70°C下烘干，再用中药材粉碎机分别粉碎至70目备用。用托盘天平分别称取烘干并粉碎的板蓝根120克，柴胡60克，薄荷叶60克，艾叶30克，山桅果30克，置于三角烧瓶中充分混合后，加入1000毫升85%乙醇，浸泡48小时，200筛絹过滤，将清液静置沉淀36小时，撇去液面漂浮物，取中上层的清液，即为复方中药消毒液，密封于黑色试剂瓶中，贴上标签，置于4°C冰禮备用。
[0013]优选地，对选用的所述的反应器，洗刷干净后进行消毒，使用紫外灯消毒，消毒10-20分钟。优选地，对选用的所述的反应器，洗刷干净后进行消毒，使用高压氮气喷射消毒，消毒5-10分钟；
[0014]优选地，对选用的所述的反应器，洗刷干净后进行消毒，使用高压二氧化碳喷射消毒，消毒5-6分钟； [0015]优选地，对选用的所述的反应器，洗刷干净后分两个阶段消毒，先使用高压氮气喷射消毒，消毒2-3分钟；使用高压二氧化碳喷射消毒，消毒2-3分钟；消毒完毕后再进行藻类培养。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为利用屠宰厂废水养殖海洋单胞藻的方法图。其中附图标记为:1充气管2光生物反应器3藻液4水龙头5节能灯6排气管。
【具体实施方式】
[0017]I)预处理:屠宰厂废水用于养藻前需要进行预处理，方法是:先用80目的铜筛过滤，除去碎肉、骨渣、血块、猪毛、脂肪等较大块固形物，后将污水引入长30米、宽15米、深
0.8米的水泥池中，池子呈东西走向，以接受更多的阳光照射；水深保持在65厘米；按每立方米污水加入50克生石灰的量均匀泼洒生石灰(生石灰最好预先按I公斤加入5升纯水的量在塑料桶中溶解、稀释、搅拌均匀，再全池泼洒)，隔30分钟，再按每立方米污水加入10克的量全池泼洒明矾(明矾最好预先按100克加2升纯水的量在塑料桶中溶解、稀释并搅拌均匀，再全池泼洒)，然后用耙子搅动或充气搅拌45分钟，使石灰和明矾充分溶解、混合并与污水中有机物充分发生化学反应，然后自然沉淀、发酵、曝光72小时，撇去水面漂浮物，勿搅动池底，取中上层的污水，煮沸5分钟，冷却，装入不透光的黑色塑料桶中，密封，4°C冰箱或冷库，保存，备用。[0018]2)接种用的等鞭金藻和异胶藻预先进行提纯(本领域常规方法，只要可实现提纯即可，例如索氏提取法)，以确保接种时藻种处于指数生长期；
[0019]3)各种营养盐要按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
[0020]4)各种营养盐特别是S3维生素溶液均需预先配成母液且置于4°C冰箱冷藏保存备用，放置时间不要超过60天；
[0021]5)全部营养盐加完后要充气混合15分钟，使营养盐混合均匀后再接种；
[0022]6)海泥抽取液制备方法:取比较肥沃又不於黑的海泥，以1份泥加5份淡水，充分搅拌均匀，静置1-2分钟，取上层泥浆于铝锅中，按每1000毫升泥浆加I克NaOH的量加入NaOH，煮沸10分钟。煮时需不断搅拌均匀，煮后静置、冷却、沉淀24小时，取上清液，置于4 °C冰箱保存，备用；
[0023]7)鸡粪浸出液制备方法:把干鸡粪、青草、豆饼、米糠、颖壳(五谷杂粮的外壳)和腐殖土按60: 10: 12: 15: 2: I的重量比例混合，搅拌均匀，装入缸内密闭进行发酵，30天后，倒出，在干净水泥地上，摊成薄层，晾干48小时，后取2公斤，置于塑料水桶，加自来水10公斤，搅拌均匀，用200目筛絹过滤，将清液煮沸5分钟，冷却，静置24小时，取上清液，装入试剂瓶，贴上标签，置于4°C冰箱，备用。
[0024]8)兔粪浸出液制备方法:将兔粪与青菜、萝卜、水草、树叶等青饲料按3:1重量比例，再加入0.5%的食盐和5%水混匀，装入缸或水泥池压实，上面加2-3厘米厚的麸皮，以利保温，然后用塑料膜密封，发酵15天，后取出置于干净水泥地上，摊成薄层，阳光下暴晒3天，后取3公斤放入水桶中，加入10升蒸馏水，充分搅匀，静置，48小时后200目筛絹过滤，取滤液加热、煮沸15分钟，杀死其中的细菌、霉菌、病毒等，冷却，沉淀48小时，取上清液，即得兔粪浸出液，装入磨口塞试剂瓶，密封，贴上标签，置于4°C冰箱备用；
[0025]9) 土壤抽出液制备方法:到树林中取松散、富含有机质的上层土壤I公斤，加自来水5升，煮沸20分钟，将泥浆倒入烧杯中，静置24小时，后吸取上清液，倒入三角烧瓶中，加棉花塞，煮沸15分钟，冷却，静置沉淀12小时，取上清液即得土壤抽出液，装入磨口塞试剂瓶，密封，贴上标签，置于4°C冰箱备用；
[0026]10)所用化学药品纯度均需化学纯级别；
[0027]11) 一种球等鞭金藻和异胶藻混合培养高产培养基，其配方如下:
[0028]屠宰厂废水50毫升，牛肉浸膏1.0-1.5克，蛋白胨1.5-2.0克，酵母膏0.5克，葡萄糖2.0克，L-谷氨酸0.1克，琼脂1.5克，可溶性淀粉1.2克，NH4NO315毫克，NaN034毫克，尿素3晕克,KH2PO4L 5晕克，鸡粪浸出液2.5毫升，兔粪浸出液1.8毫升，海泥抽取液1.5晕升，土壤抽出液1.2毫升，S3维生素溶液1.0毫升，次氯酸钠消毒后的纯净海水1000毫升；
[0029]其中S3维生素溶液配方:硫胺素盐酸盐50毫克，尼古丁酸10毫克，泛酸钙10毫克，对氨安息香酸1.0克，维生素H0.1克，肌醇0.5克，叶酸0.2微克，胸间氮苯0.3克，纯水1000毫升；
[0030]12) 一种球等鞭金藻和异胶藻混合高产培养方法，具体步骤如下:
[0031 ] 培养容器为圆柱形有机玻璃反应器，柱高90厘米，直径30厘米，壁厚5毫米，顶部有一盖子，盖子上有3个孔，一个孔插入充气管，另一个孔插入排气管，中间一个孔插入导线，导线末端连着一 个100瓦的节能灯。底部按着一个水龙头，将反应器洗刷干净，后用蒸馏水润洗3遍，100X 104cell/mL和4000X IO4CelΙ/mL，停止培养，从底部的水龙头放出藻液，将反应器洗刷干净后，加入中药消毒液消毒10-30分钟，后进入下一轮培养；
[0032]所述中药消毒液:由以下重量比的物质组成:每100份85%乙醇中加入以下重量份的中药材:板蓝根30~50份、柴胡15~25份、薄荷15~25份、桅子5~15份、艾叶5~15份。中药消毒液制作方法:将新鲜板蓝根、柴胡、薄荷叶、艾叶、山桅果切碎，于60-70°C下烘干，再用中药材粉碎机分别粉碎至70目备用。用托盘天平分别称取烘干并粉碎的板蓝根120克，柴胡60克，薄荷叶60克，艾叶30克，山桅果30克，置于三角烧瓶中充分混合后，加入1000毫升85%乙醇，浸泡48小时，200筛絹过滤，将清液静置沉淀36小时，撇去液面漂浮物，取中上层的清液，即为复方中药消毒液，密封于黑色试剂瓶中，贴上标签，置于4°C冰箱或冷库备用。
[0033]14)优选地，对选用的所述的反应器，洗刷干净后进行消毒，使用紫外灯消毒，消毒10-20分钟。
[0034]优选地，对选用的所述的反应器，洗刷干净后进行消毒，使用高压氮气喷射消毒，消毒5-10分钟；
[0035]优选地，对选用的所述的反应器，洗刷干净后进行消毒，使用高压二氧化碳喷射消毒，消毒5-6分钟；
[0036]优选地，对选用的所述的反应器，洗刷干净后分两个阶段消毒，先使用高压氮气喷射消毒，消毒2-3分钟；使用高压二氧化碳喷射消毒，消毒2-3分钟；消毒完毕后再进行藻类培养。
[0037]15)次氯酸钠消毒法消毒海水方法是:1立方米海水中加入漂白粉200-300克，使海水中有效氯含量达到10-20mg/L，充气8-12小时后，用硫代硫酸钠中和余氯。硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止；
[0038]16)应预先准备三块长方体状的木块，用于支撑光生物反应器，相当于反应器的三条腿；木块的大小是20厘米X 15厘米X 10厘米；放置反应器的地面应平整、坚硬、干净，最好是水泥面。
[0039]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
【权利要求】
1.一种利用屠宰厂废水混合养殖球等鞭金藻和异胶藻的培养基，其特征在于配方如下: 屠宰厂废水50毫升，牛肉浸膏1.0克，蛋白胨1.5克，酵母膏0.5克，葡萄糖2.0克，L-谷氨酸0.1克，琼脂1.5克，可溶性淀粉1.2克，NH4NO315毫克，NaN034毫克，尿素3毫克，KH2PO4L 5毫克，鸡粪浸出液2.5毫升，兔粪浸出液1.8毫升，海泥抽取液1.5毫升，土壤抽出液1.2毫升，S3维生素溶液1.0毫升，次氯酸钠消毒后的纯净海水1000毫升， 其中S3维生素溶液配方:硫胺素盐酸盐50毫克，尼古丁酸10毫克，泛酸钙10毫克，对氨安息香酸1.0克，维生素H0.1克，肌醇0.5克，叶酸0.2微克，胸间氮苯0.3克，蒸馏水1000毫升。
2.一种球等鞭金藻和异胶藻混合培养方法，其特征在于具体步骤如下: 培养容器为圆柱形有机玻璃反应器，柱高90厘米，直径30厘米，壁厚5毫米，顶部有一盖子，盖子上有3个孔，一个孔插入充气管，另一个孔插入排气管，中间一个孔插入导线，导线末端连着一个100瓦的节能灯，底部按着一个水龙头，将反应器洗刷干净，后用蒸馏水润洗3遍，用漏斗装入权利要求1所述的培养基至水深55厘米，充气混合5分钟，选择生命力旺盛、无污染的球等鞭金藻和异胶藻藻液分别进行接种，先接种球等鞭金藻，接种密度8X 104cell/mL,再接种异胶藻,接种密度15X 104cell/mL ;瓶口插入两根干净玻璃管,一根较长，顶端露出瓶口 7-10厘米，下端插入较深，离瓶底5厘米，用以充气，另一根较短，16厘米，两端露出盖子即可，用以排气；两根玻璃管同样粗细，直径6毫米，用干净的透明胶带将两根玻璃管固定，长的玻璃管上端 用料管与充气泵相连，充入混合气体，混合气体成分和体积比例是(空气:纯二氧化碳:氨气:甲烷)=92%: 6%: 1%: 1% ;充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可，室内培养，空调控温，最佳温度23±2°C，节能灯照射，光照强度6000-10000LUX，光/暗周期为16L/8D，即光照16小时，黑暗8小时，培养至第6天，停止充气，拿开盖子，补充新鲜的权利要求1所述的培养基至水深60厘米，盖上盖子，充气，继续培养，至第9天,球等鞭金藻和异胶藻密度分别增加至100X 104cell/mL和4000 X IO4Cell/mL，停止培养，从底部的水龙头放出藻液，将反应器洗刷干净后，加入中药消毒液消毒30分钟，后进入下一轮培养； 所述中药消毒液由以下重量比的物质组成:每100份85%乙醇中加入以下重量份的中药材:板蓝根30~50份、柴胡15~25份、薄荷15~25份、桅子5~15份、艾叶5~15份，中药消毒液制作方法:将新鲜板蓝根、柴胡、薄荷叶、艾叶、山桅果切碎，于60-70°C下烘干，再用中药材粉碎机分别粉碎至70目备用，用托盘天平分别称取烘干并粉碎的板蓝根120克，柴胡60克，薄荷叶60克，艾叶30克，山桅果30克，置于三角烧瓶中充分混合后，加入1000毫升85%乙醇，浸泡48小时，200筛絹过滤，将清液静置沉淀36小时，撇去液面漂浮物，取中上层的清液，即为复方中药消毒液，密封于黑色试剂瓶中，贴上标签，置于4°C冰禮备用。
3.根据权利要求2所述的一种球鞭金藻和异胶藻混合培养方法,其特征在于,对选用的所述的反应器，洗刷干净后进行消毒，使用紫外灯消毒，消毒10-20分钟。
4.根据权利要求2所述的一种球鞭金藻和异胶藻混合培养方法,其特征在于，对选用的所述的反应器，洗刷干净后进行消毒，使用高压氮气喷射消毒，消毒5-10分钟。
5.根据权利要求2所述的一种球鞭金藻和异胶藻混合培养方法,其特征在于，对选用的所述的反应器，洗刷干净后进行消毒，使用高压二氧化碳喷射消毒，消毒5-6分钟。
6.根据权利要求2所述的一种球鞭金藻和异胶藻混合培养方法,其特征在于,对选用的所述的反应器，洗刷干净后分两个阶段消毒，先使用高压氮气喷射消毒，消毒2-3分钟，使用高压二氧化碳喷射消毒，消毒2-3分钟，消毒完毕后再进行藻类培养。
【文档编号】C12R1/89GK103966100SQ201410222836
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】王培磊 申请人:临沂大学