球等鞭金藻Δ⁹延长酶的核苷酸序列及其应用的制作方法

专利名称：球等鞭金藻Δ⁹延长酶的核苷酸序列及其应用的制作方法
球等鞭金藻as延长酶的核苷酸序列及其应用技术领域：
:本发明属于生物和遗传工程技术领域，涉及从一种产DHA的球等鞭金 藻(Isochrysis galbana)中克隆A9延长酶基因，具体讲是球等鞭金藻八9延长酶的核苷 酸序列及其应用。将该基因直接或与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物或动物中， 利用其编码A9延长酶产生多不饱和脂肪酸的方法和应用。背景技术：
:多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFAs)是指含有两 个或两个以上顺式双键、碳原子数为16至22的直链脂肪酸。多不饱和脂肪酸是以多种形 式存在于细胞中如细胞膜、储存脂、甘油三酯磷脂、鞘脂和脂蛋白等。作为生物膜结构中磷 脂的重要成分之一，PUFAs的种类、数量、饱和度的改变会直接影响生物膜的刚性结构，因此 影响了与刚性结构相关的各种生理功能。经过研究发现PUFAs与包括心血管疾病，糖尿病、 关节炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎在内的多种慢性疾病相关，并且可以通过影响细胞的增殖和 信号传导途径来影响癌症的发生和发展情况。最近的研究表明，PUFAs还能影响骨骼的生 长与修复过程。不仅如此PUFAs还能作为一种重要的生理活性物质影响胎儿的发育。因此 PUFAs的生物合成以及合成途径中的一些关键酶受到广泛的关注。 PUFAs的合成主要是由碳链的延长和脱氢两个主要反应组成，合成的最初底物是 饱和脂肪酸软脂酸和硬脂酸。为了适应不同的自然界环境，不同的物种在基本的合成途 径基础之上又衍生出了各种不同PUFAa合成机制。除了传统的n-6和n_3两类不同的多 不饱和脂肪酸途径外，在藻类等微生物中又发现了第三种分支合成途径，即A9延长酶途 径亚油酸(LinoleicAcid， LA， C18:2n-6， A 9， 12)或a亚麻酸(a-LinolenicAcid， ALA， C18:3n-3， ) A 9， 12， 15) A 9延长酶的催化下生成二十碳二烯酸EDA (Eicosadienoic Acid， EDA， C20:2n-6， A 11， 14)和二十碳三烯酸Etr (EicosatrienoicAcid， EtrA， C20:3n-3， All，14，17)，然后通过A8脱氢酶生成二高y亚麻酸DGLA(Dihomo-y-LinolenicAcid， DGLA，C20:3n-6， A8，11，14)和二十碳四烯酸ETA(EicosatetraenoicAcid， C20:4n-3， A8， 11， 14， 17)，再进入n-6和n-3合成途径，经一系列的碳链延长和脱氢反应合成花生四烯 酸(Arachidonic acid， AA. C20:4n_6， A 5， 8， 11， 14) 、 二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid， EPA. C20:5n-3， A 5， 8， 11， 14， 17)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid， DHA. C22:6n-3， A 4， 5， 8， 11， 14， 17)等有生物活性的长链多不饱和脂肪酸(Long-chain polyunsaturated fatty acids， LC-PUFAs)。包括a _亚麻酸在内的多不饱和脂肪酸在保 健和医疗方面有很广阔的应用前景。研究不饱和脂肪酸的合成和它的生理作用成为当前的 热点之一。A 9延长酶的克隆对于PUFAs的合成和应用研究具有重要意义。

发明内容本发明的目的一是提供从球等鞭金藻中分离的编码八9延长酶的核 苷酸序列或其核苷酸序列的片段、类似物或衍生物。从一种球等鞭金藻中克隆八9延长酶 基因，具体讲是球等鞭金藻A9延长酶的核苷酸序列及其应用。 本发明的目的之二是提供由该核苷酸序列所编码的A9延长酶多肽、或其片段、类 似物或衍生物。 本发明的目的之三是提供含有该基因核苷酸序列与异源调节序列连接，进行功能 性表达的重组表达载体。
本发明的目的之四是提供含有该基因核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调 节序列连接的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代。 本发明的目的之五是提供一种用含有该基因核苷酸序列、或该基因核苷酸序列与 异源调节序列连接的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞、或该核苷酸序列 所编码的A9延长酶多肽制备多不饱和脂肪酸的方法。 本发明第一方面是，提供了 SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列或核苷酸序列的片段、 类似物和衍生物。 本发明分离的八9延长酶基因的核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序 列，与选自下组的一种核苷酸序列有至少65%的同源性1)编码SEQ ID N0:2氨基酸序列 的活性多肽的核苷酸序列；(2)与核苷酸序列(1)互补的核苷酸序列。准确地，该核苷酸序 列是选自下组中的一种(a)具有SEQ ID NO :1序列中1-1653的序列和(b)具有SEQ ID NO :1中45-830的序列。 本发明的第二方面是，提供分离的上述核苷酸序列所编码的多肽，该多肽包含具 有SEQ IDNO :2所示的氨基酸序列的多肽、或其片段、或其保守性变异多肽、或其衍生类似 物。更准确地，该多肽是具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的多肽或其氨基酸变异不超 过30%的衍生物。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本 发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核 宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物)细胞中产生。 本发明的第三方面是，提供了含有上述核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表 达载体；所述的重组表达载体具体是PYES2. O-ASE或pX952A。 本发明的第四方面是，提供了一种用含有该基因核苷酸序列、或者该基因核苷酸 序列与异源调节序列连接的质粒或病毒重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细 胞、或用该核苷酸序列所编码的A9延长酶多肽制备不饱和脂肪酸的方法。这些宿主细胞 包括细菌、真菌、酵母、霉菌、高等植物、昆虫或哺乳动物等细胞。 本发明的其他方面由于本文技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。 本发明所涉及的技术术语的含义"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是 天然环境)。例如，活体细胞内的天然状态下的核苷酸序列和多肽是没有分离纯化的，但同 样的核苷酸序列或多肽如从天然状态中与同存在的其它物质中分开，则为分离纯化的。
"分离的核苷酸序列"是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其 它物质。本领域的技术人员能用标准的DNA纯化技术纯化的。"球等鞭金藻A9延长酶的核苷酸序列"是指包括编码球等鞭金藻A9延长酶多肽 的核苷酸序列和包括附加编码和/或非编码的核苷酸序列。"简并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQ ID N0:2的蛋白质或多肽，但与SEQ ID N0:1所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。 非编码的衍生物还表示可用于抑制所述新型蛋白生物合成的反义DNA。所述的反 义DNA属于本发明的无功能衍生物。如不具备酶促活性的衍生物。可用本领域的技术人员 熟知生产无功能衍生物的其它方法有共抑制，核糖酶和内含子的使用。
4
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，"核酸片段" 的长度至少含10个核苷酸，优选是至少20-30个核苷酸，特别优选是至少50-60个核苷酸， 非常特别的优选是至少100个核苷酸以上。核苷酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR) 以确定和/或分离编码的核苷酸序列。 本发明中的多肽和核苷酸序列优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明中特异核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分 离核苷酸序列。这些技术包括但不局限于(l)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同 源的核苷酸序列；和(2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的核苷酸序 列片段。 本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得(1)从基因组DNA分离双链DNA序 列；(2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。 本发明还提供了一种新的多肽序列-球等鞭金藻八9延长酶多肽的氨基酸序列， 是由SEQ IDN0:2所示的氨基酸序列组成。发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多 肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重 组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞中产生。
本发明也涉及含有编码球等鞭金藻A9延长酶的核苷酸序列和外源性调节序列元
件结合进行功能性表达的重组表达载体。 术语"载体"指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动 物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。能够影响基因表达产物的序列元件包括有 复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。 可用本领域的技术人员熟知的方法来构建含编码球等鞭金藻A9延长酶的核苷酸 序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合 成技术、体内重组技术等。所述的编码球等鞭金藻八9延长酶的核苷酸序列可有效连接到表 达载体的恰当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac 或trp启动子；A噬菌体的启动子真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动 子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞 或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转 录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强 子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10-300bp，作用于启动子以增强基因的转录。如 腺病毒增强子。 本发明还涉及用含有本发明编码球等鞭金藻A9延长酶的核苷酸序列的重组载体
或直接用编码球等鞭金藻八9延长酶的核苷酸序列经基因工程产生的宿主细胞。本发明中， 编码球等鞭金藻A9延长酶的核苷酸序列或含有该核苷酸序列的重组载体可转化或转导入
宿主细胞，以构成含有该核苷酸序列或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语"宿主细胞" 指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动 物细胞。宿主细胞的代表性例子有大肠杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞如油菜、烟草、大 豆；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9 ;动物细胞如CHO、 COS或Bowes黑素瘤细胞等。
用本发明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组载体转化宿主细胞可用本 领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期收集菌体，用Ca(^法处理，所用的步骤在本领域是众所周知的。也可 用MgC^，电穿孔等方法进行。当宿主是真核生物，可选用DNA转染法、显微注射、电穿孔、脂 质体包装等方法。 本发明还涉及用上述转基因宿主细胞生产多不饱和脂肪酸，根据宿主细胞，用本 领域技术人员所共知的方法生长或培养。比如微生物细胞通常是在0-100'e，优选10-60\ 同时还要氧气。培养基中含有碳源，如葡萄糖，氮源，通常是有机氮的形式，如酵母提取物、 氨基酸，或盐，如硫酸铵，微量元素，如铁、镁盐，如果需要的话还有维生素。在此期间培养基 的pH可以保持固定的值，就是说，在培养期间进行控制或不控制。培养可以分批培养、半不 连续培养或连续培养形式进行。在培养之后，收集细胞，捣碎或直接使用，通过本领域技术 人员熟知的方法从细胞中提取脂肪酸。 本发明还涉及一种制备不饱和脂肪酸的方法，该方法是这样实现的，将具有饱和
或不饱和脂肪酸甘油三酯与SEQ ID N0:2序列编码的酶一起培养。该方法优选是在由能够
摄取或释放还原性等同物的化合物存在条件下进行的。然后，可以从甘油三酯中释放脂肪
酸。上述方法优选可以合成通过9位延长、合成具有11位双键的脂肪酸。 本发明还涉及用上述方法制备不饱和脂肪酸，以及将其应用于生产人类食品、动
物饲料、化妆品或药品用途。 本发明的优点和积极效果 本发明获得了球等鞭金藻Ag延长酶基因，通过与其它合成PFUAs相关基因组合 并将其克隆表达特定的表达宿主中，通过基因重组和表达技术的大规模工业化生产PUFAs 和/或提高食品PUFAs的含量。


图1是显示所构建的酿酒酵母重组表达载体pYASE图。
图2A是显示LA、 ALA、 EDA、 EtrA标准物的GC图。
图2B是含pYES2空载体的转基因酿酒酵母的GC图。
图2C是含重组质粒pYASE的转基因酿酒酵母的GC图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明 而不是限制本发明的范围。 实施例l从球等鞭金藻中分离八9延长酶的核苷酸序列 采用Trizol方法从培养3d的球等鞭金藻中提取总的RNA，以2 y L总RNA为模板， 以oligo(dT16)作为引物进行反转录反应，扩增获得cDNA。取2iiL cDNA为模板进行聚合 酶链式反应。根据所发表(Baoxiu Qia. et al. 2002， FEBS Letters)的八9延长酶同源序 列的跨膜区和组氨酸保守区II氨基酸序列设计兼并引物(引物1和引物2)，以上述cDNA 为模板在T-Gradient PCR仪(Biometra公司)上进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩 增条件如下 引物1 :5-ATG TA (TC) AC (TCAG) TA (TC) TA (TC) GG (TCAG) (CT) T—3
引物2 :5- (ATCG) AG (ATCG) CC (GA) TA (GA) TA (ATCG) GT (GA) TA CAT—3
反应组分加入量终浓度模板cDNA缓冲液(10 X)(含20mmol/LMgCl2)5 LIXdNTP(2. 5,1/L)0. 4mmol/l引物l(10iimol/L)0. 4u mol/L引物2(10iimol/L)0. 4 mol/LT叫ase (5u/ li U1 ii L5u/反应H。0总体积扩增条件94t:变性5min，再用94°Clmin ;55°C lmin — 72 °Clmin进行3个循
环，然后94°C lmin ;52°C lmin -+ 72°C lmin进行30个循环，最后72。C10min。琼脂糖凝
胶电泳检测结果显示，扩增得到大小约180bp的片段，用DNA凝胶回收试剂盒(鼎国生物技 术有限公司产品)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pGEM-T easy(Promega公司产品) 中；连接产物转化到用CaCl2法处理的大肠杆菌DH5a ，在含氨苄青霉素(终浓度为100iig/ ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓 度为60iig/ml)的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook， et al. ，1989， Molecular Cloning, a Laboratory Ma皿al， coldSpring Harbor Laboratory, NewYork， pl9_21]提取质粒，经EcoR I酶切和PCR扩增鉴定正确，测序(上海生工生物工 程技术服务有限公司)。测序结果显示所扩增得到的片段大小为174bp，通过其核苷酸序列 和其编码的氨基酸序列在Genbank数据库中用Blast程序进行同源检索，检索结果表明与 该片段已报道的八9延长酶序列十分相似，但并不完全相同，证明所扩增片段为潜在八9延 长酶基因的片段。 根据所获得的部分序列设计基因特异性引物(引物3、引物4和引物5)，利用 RACE(Clontech公司)的方法获得包含上述片段的基因的3—和5—末端序列。先提取细胞 总RNA，，以2 ii L总作为模板，按照Clontech SMART RACE cDNAAmplif ication Kit提供 的方法反转录得到5' RACE cDNA和3' RACE cDNA，然后以3' RACE cDNA作为模板，以试剂 盒提供的UPM引物分别与引物3、4和5配对，扩增获得3'下游序列；以5' RACE cDNA作为 模板，以试剂盒提供的UPM引物分别与引物6、7和8配对，扩增获得5'上游序列。
引物3 :5—-GACACGGCCTGGCTGGTGCTCAAGGG-3— ， (SEQ ID NO :3)
引物4 :5—-GAAGAACGTCTCTTTCCTCCAGGC-3— (SEQ ID NO :4)
引物5 :5—-ATGTGTATTTGGGCATCCGGCTC-3— ， (SEQ ID NO :5) 模板3'RACE cDNA 3 ii L、缓冲液(10X) 5 ii L、 dNTP(50X) 1 y L、弓|物 UPM(10ii mol/L) 5 ii L、引物3/4/5 (10 ii mol/L) 5 ii L、Taq酶2 ii L、H20 29iiL。扩增条件 先94。C变性5min，进入94。C 30sec， 72°C 3min进行5个循环；再94°C 30see， 70°C 30sec， 72°C 3min进行5个循环，然后94°C 30sec， 68°C 30sec， 72°C 3min进行25个循环，最后 72°C 10min。将PCR扩增产物稀释50倍后作为模板，以引物UPM和引物4进行PCR，94°C 30sec，68。C 30sec，72。C 3min进行25个循环，最后72°C 10min，再将产物稀释IOO倍，以引 物UPM和引物5进行PCR验证，若获得特异性条带，将该带连接pGEM-T easy并转化测序，获得3'下游序列1220bp。 引物6 :5—-GAGGCCGTAGTAGGTGTACATTATGGTG-3—， (SEQ ID NO :6)
引物7 :5—-TATGGTGTGAATGAATGAGTTGAAAA-3— (SEQ ID NO :7)
引物8 :5—-ACATGAAGATCCACACGCCCTC-3— (SEQ ID NO :8) 模板5'RACE cDNA 3 ii L、缓冲液(10X) 5 ii L、 dNTP(50X) 1 y L、弓|物 UPM(10iimol/L) 5iiL、引物6/7/8(10iimol/L) 5 ii L、Taq酶2 ii L、H20 29iiL。扩增条件 先94。C变性5min，进入94。C 30sec，72。C 3min进行5个循环；再94。C 30sec， 70°C 30sec， 72°C 3min进行5个循环，然后94°C 30sec， 68°C 30sec， 72°C 3min进行25个循环，最后 72°C 10min。将PCR扩增产物稀释50倍后作为模板，以引物UPM和引物7进行PCR，94°C 30sec，68。C 30sec，72。C 3min进行25个循环，最后72°C 10min，再将产物稀释100倍，以引 物UPM和引物8进行PCR验证，若获得特异性条带，将该带连接pGEM-T easy并转化测序， 获得5'上游序列561bp。 用序列分析软件DNAstar将三个片段进行拼接并进行分析，得到如SEQ ID NO :1 所示的核苷酸序列，其中45-830bo (ATG一一TAG)为潜在的开放阅读框，编码262个氨基酸。 根据两个末端序列，设计基因特异性引物(引物9和引物10)按上述条件PCR扩增、测序，
所得结果和拼接结果一致。 引物9 :5—-ATGGCGACGGAGGCGACCGCATC-3— (SEQ ID NO :9);
引物10 :5—-TGATGGAAGCCAATGAACAAGATTTC-3— (SEQ ID NO :10);
实施例2 :所分离核苷酸序列的同源性搜索 将分离的A 9延长酶的核苷酸序列在Genbank上进行同源性搜索，与已经报道的 A9延长酶(BaoxiuQia. et al. 2002， FEBS Letters)的核苷酸序列(AF390174)相似性最 高，达氨基酸相似性最高，达92%。这说明本发明的新的核苷酸序列所编码的酶具有八9延 长酶的功能。 实施例3 :酿酒酵母重组表达载体的构建 根据SEQ ID N0:1所示编码区序列，设计出一对基因特异性扩增引物(引物ll和 引物12)分离其潜在开放阅读框序列 引物11 :5-TTGGATCCAACACAATGGCGACGGAGGCGACCGC-3— (SEQ ID NO :11);
引物12 :5—-AAGCATGCTTACTACAGGGCCTTGCCTCCCT-3— (SEQ ID NO :12);
此两个引物的5—端黑体分别含有BamH I和Sph I酶切位点。所用的扩增条件和 反应组分同上，扩增产物的测序结果显示和SEQ ID N0:l所示40-830bp的序列一致。然 后取50 L PCR产物和1 LpYES2. 0分别进行双酶切，回收酶切大片段，并用T4连接酶在 16t:水浴锅中过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5 a ，通过质粒提取和PCR筛选阳性克 隆，并进行测序鉴定。质粒构建结果见附图2，所构建的含有A9延长酶基因的酵母表达质 粒命名为pYASE。该质粒是由pYES2. O(Invitrogen公司)和引物11和引物12的PCR产物 构建而成。 实施例4 :重组表达载体转化酿酒酵母细胞 挑取酿酒酵母菌株INVScl单菌落于10ml YEPD液体培养基中、3(TC摇床过 夜培养，检测菌液的0D6。。值，取适量菌液稀释于50ml，使0D6。。为0. 4 ;继续培养2到 4h后，2500rpm离心沉淀细胞，以40ml 1 XTE重悬菌体，2500rpm离心沉淀细胞，以2mllXLiAc/0. 5XTE悬浮细胞，并在室温下放置10min，此细胞即为感受态细胞；取100 制备好的酵母感受态细胞，加入1 P g重组质粒pYASE和100 ii g变性鲑精DNA，混匀，加入 700 ii 1 lXLiAc/40% PEG-4000/1 XTE并混匀，于30。C温育30min ;然后，加入88ii 1 DMSO 混匀，于42t:水浴中热激7min ;离心10s沉淀细胞，加入lml 1 X TE悬浮细胞并再次离心沉 淀细胞，最后加入100 重悬细胞，全铺于SC-Ura (无尿嘧啶)选择培养基平板，置3(TC培 养48-72h，筛选出重组转化子。
实施例5 :酵母工程菌的诱导表达 挑取实施例4中SC-Ura(无尿嘧啶)选择培养基平板上出现的阳性转化，接种于 10ml SC-Ura选择培养基(含2% (w/v)的葡萄糖)，28。C摇菌过夜培养，以适宜的接种量加 入含有2% (w/v)半乳糖的50ml SC-Ura培养基，使其0D600约0. 4，并加入亚油酸和a亚 麻酸作为底物，并加入NP-40促进底物的吸收，20°C继续培养72h ;2500rpm收集菌体，用去 离子水洗涤三次，50。C烘干，研碎，取100mg加入5ml 5% (w/v)的KOH_CH3OH溶液，70。C反 应2-3h ;反应结束，冷却到室温，用6mol/L的盐酸调节溶液的pH值到2. O，加入4ml 14% (v/v)BF3-CH30H，7(TC反应1. 5h，合成脂肪酸甲酯；再加入饱和的NaCl溶液10ml，剧烈震荡 混匀，并转移到分液漏斗中，用8ml 1 : 4的氯仿己烷抽提两次，合并提取液；加入适量 无水Na2S04干燥提取液，静置lh，去掉Na2S04，把含有脂肪酸甲酯的上清液用氮气吹干，用 200 ii L的正己烷回溶样品，后用0. 45mm的微孔滤膜过滤。
实施例6 :脂肪酸气相色谱分析
按如下条件进行 仪器为岛津GC-7A，柱子弹性石英毛细管柱，0.32X30m，固相支持物聚二乙二 醇丁二酸酯(Poly-diethylene glycol succinate, DEGS)镀膜物聚酰亚胺。载气^，线 速8cm/s。分流比IOO : l，气化室温度280。C，柱温180。C，尾吹50ml/min，检测器氢 火焰离子化检测器。以CAYMAN CHEMICAL公司生产的PUFAs甲酯化后为标准品，把上述实施 例5的方法制备的脂肪酸甲酯化的样品，进行GC分析，上样量为1 y L ;分析软件Anstar， 分析之星色谱工作站。色谱分析结果见附图2，附图2显示LA、 ALA、 EDA、 EtrA标准物(2A)、含pYES2. 0
空载体的转基因酵母(2B)和含重组质粒pYASE的转基因酵母(2C)的气相色谱图。通过
与已知的脂肪酸甲基酯标准物的保留时间进行比较鉴别出各个峰。图2C中保留时间为
21. 344min、23. 534min对应的峰即为A9延长酶催化产生的EDA和EtrA。 序列表 SEQUENCE LISTING 〈110>南开大学 〈120〉球等鞭金藻A 9延长酶的核苷酸序列及其应用
〈130>20091201
〈160>12 〈170>PatentIn version 3. 5
〈210>1
〈211>1653
〈212>DNA
9
〈213〉球等鞭金藻(Isochrysis galbana)
〈400〉 1ggggg腿g3ggg卿g卿ggg郷gacgcgccgctcgcgacgatggcg 3Cgg郷Cg360ccgcatctatctgggccgcagtgagcgatccagagatcctgatcggcaca ttctcatett120tgctgctcaagcctettctccgcagctcggggctcgtcgatgag皿g皿g ggcgccteca180ggacatcgatgatctggtecaacgteattctegcgctcttctccgcaacg agcttttecg240tcacggcgacggctcttggatgggactetggragtggcgagtggctgcgt郷ct雄gg300gcgacacgccgcagccactgtttcagtgcccgtccagagtatgggattct aaactcttcg360tgtggaccgc皿3ggcattctettettccaagtecgtggaateccttgac accgcatggc420tggtgctteagggg皿g雄gtctctttcctccaggcattccatcacttc ggcgcgccgt■gggatgtgtetttgggcatccggctccagaacg郷gcgtgtggatcttc atgtttttca540actcattcattcacaccateatgtecacctattecggcctcactgctgcg ggcteteaga600tc朋ggcteagccgctcatc3C3gCg3tgC皿3teagcc3attcatgggc ggcttcatcc660tcgtctgggactecatcaatattccatgcttccgctctgateacggc皿g gtgtttegct720gggtettc朋ctetgcttetgtcggcttcgtgttcttgttgttctgccac ttcttcteca7803gg3C朋CCttgcctcteag皿gCC3gCg3ggccctgteg agagateggt840gcaacttctegctctgcgaaacacctctga3gC3tgggC3teggacgaat acttggcctc■tg卿卿tgcggcattecctcctecatggacgcgccacgC3CCg3gg3g agtcgcgctg960cccctgcaacgccgcctegcggctgaccggggccgggatggtgtatccgt tgttgacgat1020gggccccgcttcatgtagcatattgatcgattcgtattgccatctgtttt gagcategca1080tecgccgcatcgctgaatecgttgtgcggcttegcttgcatgtcatcggc ctgccgcatt1140ctctgcaggccgtcgcteccccgcgagcgcgttgaccttgag皿tgggte cggcggcctt1200gagccatgcgccgccctgttgctggc皿ggctetttggacg3g3ttCg3C 3C3C3CC3Cg1260cagtgccacacgctttggcttteagaggacgcga朋ga皿tcttgttcat tggcttccat1320caacgatggggtcatgcgggatgctggagcratgcgggatgcaccgcc皿3Cg朋tg3Cg1380cggctetgtgagtttcategtgc皿ggccacgaacgttcgragtgcttgg g郷3tgCg314403gCg朋CC3Cttgtgcactcccgacggcatgagtecgatctgcaatcaat caatecggct15003tgg3CC3tgtcaacggactcagatetetggatcttgtggtgttggtgga tggatggtcg1560tggactecggcggcggtetgttggtcggggtgtcgacttt皿g朋agc皿tgcarattcc16201653〈210〉2〈211〉261〈212〉PRT〈213〉球等鞭金藻(Isochrysis galbana)〈400〉2Met Ala Thr Glu Ala Thr Ala Serlie Trp Ala Ala Val Ser Asp Pro151015Glu lie Leu lie Gly Thr Phe Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Pro lie Leu202￡> 30Gly Leu ValAsp Glu Lys Lys GlyAlaTyrArgThrSer354045MetlieTrpTyr Asn Vallie LeuAla Leu PheSerAlaThrSerPhe505560TyrValThrAla Thr AlaLeu GlyTrp Asp TyrGlySerGlyGluTrp65707580LeuArgArgLeu Thr GlyAsp ThrPro Gin ProLeuPheGinCysPro859095SerArgValTrp Asp SerLys LeuPhe Val TrpThrAlaLysAlaPhe100105110TyrTyrSerLys Tyr ValGlu TyrLeu Asp ThrAlaTrpLeuValLeu115120125
LysGlyLysAsn Val SerPhe LeuGin Ala PheHisHisPheGlyAla130135140ProTrpAspVal Tyr LeuGly lieArg Leu GinAsnGluGlyValTrp145150155160liePheMetPhe Phe AsnSer Phelie His ThrlieMetTyrThrTyr165170175TyrGlyLeuThr Ala AlaGly TyrLys lie LysAlaLysProLeulie180185190ThrAlaMetGin lie SerGin PheMet Gly GlyPhelieLeuValTrp195200205
AspTyrlieAsn lie ProCys PheArg Ser AspAsnGlyLysValPhe210215220SerTrpValPhe Asn TyrAla Tyr Val Gly PheValPheLeuLeuPhe225230235240CysHisPhePhe Tyr LysAsp Asn Leu Ala SerLysLys Pro Ala Lys
245250255GlyGlyLysAla Leu260〈210>3〈211>26〈212>DNA〈213〉球等鞭金藻(Isochrysis galbana)〈400>3gacacggcct ggctggtgct caaggg26〈210>4〈211>24〈212>DNA
〈213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana) 〈400>4 gaagaacgtc tctttcctcc aggc 〈210>5 <211>23 〈212〉DNA 〈213>球等鞭金藻(Isochrysis galb,) 〈400>5 atgtgtattt gggcatccgg etc <210>6 〈211〉28 〈212>DNA 〈213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana) 〈400>6 gaggcegtag taggtgtaca ttatggtg 〈210>7 〈211>26 〈212>DNA 〈213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana) 〈400>7 t;atggtgtga atg朋tgagt tgaaaa 〈210〉8 〈211>22 〈212>DNA 〈213>球等鞭金藻(Isochrysis galb,) 〈400>8 acatgaagat ccacacgccc tc 〈210>9 〈211>23 〈212>DNA 〈213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana) <400>9 atggcgacgg aggcgaccgc ate 〈210>10 〈211>26 〈212>DNA 〈213〉球等鞭金藻(Isochrysis galbana) 〈400〉 10 tgatggaagc caatgaacaa gatttc
24
23
28
26
22
23
2611/11页
〈210>11 〈211>34 〈212>DNA
〈213〉球等鞭金藻(Isochrysis galbana) 〈400>11
ttggatccaa cacaatggcg acggaggcga ccgc 34
<210>12
〈211>31
〈212>DNA
〈213〉球等鞭金藻(Isochrysis galbana) 〈400>12
aagcatgctt actacagggc cttgcctccc t 31
1权利要求
一种产DHA的球等鞭金藻的Δ9延长酶的核苷酸序列，其特征在于它包括(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2. 按照权利要求l所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是选自(a) 编码为SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列多肽的核苷酸序列；(b) 与核苷酸序列(a)互补的核苷酸序列；(c) 核苷酸序列(a)的核苷酸突变序列。
3. —种多肽，其特征在于它是SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的多肽。
4. 一种重组表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。
5. 按照权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于它是pYES2. O-ASE或pX952A。
6. —种基因工程化的宿主细胞，其特征在于它是选自于下列一种宿主细胞(a) 它是用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞(b) 它是用权利要求5所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。
7. 按照权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。
8. 权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求3所述的氨基酸序列或权利要求4所述的重组表达载体应用于多不饱和脂肪酸的生产。
全文摘要
本发明涉及一种从产DHA的球等鞭金藻中分离的编码Δ9延长酶的核苷酸序列及其应用。它是具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或编码具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列及其多肽。本发明包括编码Δ9延长酶的核苷酸序列与表达载体连接而成的进行功能性表达的重组表达载体以及含有本发明重组表达载体的酵母细胞、霉菌细胞及其后代细胞。用上述的核苷酸序列直接或与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码Δ9延长酶或直接利用多肽序列产生多不饱和脂肪酸的方法和应用。
文档编号C12P7/64GK101724637SQ20091024503
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月23日 优先权日2009年12月23日
发明者李明春, 欧秀元, 邢来君, 魏东盛, 黎明 申请人:南开大学