多孔钛合金中骨骼细胞压应力的加载装置及加载方法
【专利摘要】本发明公开了一种多孔钛合金中骨骼细胞压应力的加载装置及加载方法，加载装置包括伺服电机、动作腔室、动作活塞、加压腔室、活动壁板、传动杆、压力、温度传感器等，伺服电机通过PC由运动控制卡控制，并与传动杆连接，传动杆与动作活塞连接，伺服电机通过传动杆带动活塞上下运动。加压腔室的前侧壁设可开合活动壁板。该装置经消毒灭菌操作后置于细胞培养箱中，将骨骼细胞悬液种植于多孔钛合金，加压系统对多孔钛合金中的细胞进行压缩载荷的刺激。系统工作时的压力、温度和湿度传感器将其实时采集的压力、温度等信号传送至数据采集卡中，通过PC端在显示器上实时显示和存储。
【专利说明】多孔钛合金中骨骼细胞压应力的加载装置及加载方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种对多孔钛合金中骨骼细胞加载压缩应力的装置及压缩应力的加载方法，以实现对种植在多孔钛合金表面的体外培养的骨骼细胞(包括成骨细胞、破骨细胞及骨细胞)施加应力载荷的刺激，并进一步研究这些骨骼细胞的力学生物学信号转导，为应力载荷协同多孔钛合金对临床上骨缺损的治疗提供科学的理论依据。
【背景技术】
[0002]骨缺损的修复和功能重建是骨科临床的常见病和难治病，其中尤以长骨的大段骨缺损的修复最为困难。我国肢体不自由患者有1500万人以上，其中由于缺乏重建手术和材料，已有约300万人截肢；我国每年大约有350万人因不同原因(包括交通和运动事故、意外伤害、人口老龄化、病变等)出现骨缺损，而骨骼不健全的人数也有上千万之多，且有日益增多的趋势。不少骨缺损病人并未实施手术，特别是大段骨缺损患者不得不实施截肢手术或用假肢替代。骨缺损给患者带来极大的痛苦，给家庭带来巨大的经济和精神负担。
[0003]临床上对于小于6cm的节段性缺损可通过传统的自体骨或人工骨移植恢复患肢的长度和功能。但大段骨缺损的修复治疗则较复杂，运用最广泛的方法为带血供的自体骨移植、同种异体骨移植和牵拉成骨技术等，但这些方法均存在各自的不足。带血管的自体骨移植愈合快而牢固，但通常受到来源的限制，且取骨量有限，并会在供区造成新的骨缺损，且取骨区有感染、疼痛等并发症发生。异体骨移植是替代自体骨移植的良好材料，多用于修复肿瘤切除所致的缺损，但其并发症及失败率较高，且还具有引发免疫排异反应和疾病传播等风险。牵拉成骨是 在牵引应力作用下，逐渐牵开两个有血供的骨表面，使骨表面之间形成新骨。但其具有时间长的缺点，而且感染、延迟愈合、肌肉挛缩和关节僵直等并发症的发生率很高。
[0004]钛合金凭借其优良的生物相容性、抗腐蚀性、综合力学性能和工艺性能已成为牙种植体、骨创伤产品以及人工关节等人体硬组织替代物和修复物的首选材料。而将钛合金制备成多孔结构后，在植入长骨中后不仅可形成体液传输通道，利于成骨细胞在钛合金孔隙中的生长并矿化形成新生的骨组织，同时能够在骨小梁水平上实现弹性模量的匹配，可以实现骨小梁与合金多孔结构的机械铆合，因此在骨缺损的修复治疗中具有广阔的临床应用前景。但在动物实验中人们发现:骨组织在多孔材料的表层长入较好，但却难以完全长入大体积多孔钛合金材料内部；在骨小梁水平上，骨组织与钛合金材料不能达到完全骨整合。
[0005]大量研究证实外源性的施加适当强度生理水平的周期载荷刺激可以显著提高骨量和骨强度。生理水平的周期应力载荷刺激能够提高正常和骨质疏松动物的骨量、改善松质骨和皮质骨的微结构、提高骨的力学强度、促进骨生成并抑制骨吸收。而对于骨折的实验动物，将骨折部位经适当固定后再施加周期性载荷刺激，能加速骨痂生长，促进骨折愈合并增加愈合处的强度和刚度。临床研究证实，力学载荷刺激(如有氧慢跑、中强度抗阻训练等)可以有效提升绝经后妇女的骨密度，抑制绝经后的高骨代谢并降低骨折风险。因此，我们提出一种将周期载荷与多孔钛合金协同作用修复治疗骨缺损的设计思想，为多孔钛合金的修复区域构建其原本缺失的力学微环境，有望在较大程度上提高骨缺损的修复效率。
[0006]针对以上设计思想，我们需要将周期载荷对植入种植体表面的骨骼细胞生物学影响进行系统研究评估，从而明确周期载荷对于成骨细胞与钛合金表面的生物兼容性的关系，为周期载荷对于改善钛植入物的骨整合作用的相关机制奠定坚实的理论基础。
【发明内容】
[0007]为深入开展种植在多孔钛合金表面的骨骼细胞力学信号转导的研究，以及为应力载荷协同多孔钛合金对临床上骨缺损治疗提供科学理论依据，本发明的目的是提供一种对种植在多孔钛合金表面的骨骼细胞进行动态压缩载荷的空气动态压加载装置及相应的压应力加载方法，以实现对骨骼细胞在其适宜的生长环境下施加应力载荷的刺激。
[0008]为达到以上目的，本发明是采取如下技术方案予以实现的:
[0009]一种多孔钛合金中骨骼细胞压应力的加载装置，其特征在于，包括一个矩形的加压腔室，其前侧设有一可开合的活动壁板，加压腔室上面连通一个筒形的动作腔室，其中设置动作活塞，该动作活塞上面连接一传动杆，传动杆通过传动组件连接伺服电机，该伺服电机由一台PC通过运动控制卡控制该伺服电机通过传动组件驱动传动杆带动动作活塞在动作腔室进行上下运动，进而在加压腔室中产生压缩载荷，并最终作用于事先放置于加压腔室中的多孔钛合金骨骼细胞试样，加压腔室中至少设置有压力传感器和温度传感器。
[0010]上述方案中，所述的动作腔室和加压腔室均由热传导性能良好、且透明的聚甲基丙烯酸甲酯材料制成。
[0011]一种多孔钛合金中骨骼细胞压应力的加载方法，采用前述多孔钛合金中骨骼细胞压应力的加载装置完成，其特征在于，包括下述步骤:
[0012](I)将压应力加载装置用钴60放射性消毒，置于37°C、5% CO2的细胞培养箱中；
[0013](2)将多孔钛合金进行消毒处理，置于细胞培养板中，随后将经传代消化处理的骨骼细胞悬液滴入多孔钛合金中，将细胞培养板于细胞培养箱中静置3小时待细胞完全粘附于多孔钛合金表面；
[0014](3)随后加入细胞培养液覆盖多孔钛合金，静置12小时后，将细胞培养板经活动壁板放入加压腔室中；
[0015](4)在PC端设置需要的周期载荷的加载强度、频率和加载时间，通过运动控制卡控制伺服电机，伺服电机按照设定参数通过传动组件驱动传动杆带动动作活塞对加压腔室内的多孔钛合金表面的骨骼细胞施加周期载荷；
[0016](5)PC端通过数据采集卡实时动态的采集各传感器的信号，并通过显示器将信号的变化以曲线形式显现出来。
[0017]上述方法中，步骤(4)所述周期载荷的加载强度为60kPa，加载频率为0.5Hz，加载时间为每天lh，连续3天。
[0018]本发明的优点是，操作 简单，能够使种植在多孔钛合金表面的骨骼细胞在其适宜的生长环境中对细胞进行动态的压缩应力载荷的刺激，可显著提高实验的稳定性和可重复性，并可较真实的模拟骨骼细胞在其原位骨骼生长环境的受力状况。对于细胞所受应力及其周围温度、湿度的实时数据采集、监测和存储可以提高实验的精确性。该应力加载系统可用于研究应力载荷对种植在多孔钛合金中的骨骼细胞的力学信号转导的相关机制，为应力载荷协同多孔钛合金应用于临床治疗修复骨缺损提供重要的理论依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为发明装置的结构图。图中:1、伺服电机；2、动作腔室；3、动作活塞；4、加压腔室；5、活动壁板；6、传动杆；7、传感器(包括压力、温度和湿度传感器)。
[0020]图2为图1加载装置中多孔钛合金骨骼细胞试样应力加载的信号采集、处理及控制的原理框图。
[0021]图3为实验组和对照组成骨细胞在多孔钛合金中的细胞增殖情况(490nm下的吸光值)的比较。
[0022]图4为图1加载装置进行加压的过程中加压系统压力传感器与标准测压计所测的压力值的比较图。
【具体实施方式】
[0023]以下结合附图及具体实例对本发明作进一步的详细描述。
[0024]如图1所示，本发明多孔钛合金中骨骼细胞压应力的加载装置包括一个矩形的加压腔室4，其前侧设有一可拆卸活动壁板5，可以方便细胞培养器皿的取放。加压腔室上面连通一个筒形的动作腔室2，其中设置动作活塞3，该动作活塞上面连接一传动杆6，传动杆通过齿轮连接伺服电机I的转动轴。伺服电机采用MCAC706-N全数字交流伺服型电机，由基于PC的LabVIEW软件控制程序通过运动控制卡DMC1380 (图2)从而控制交流伺服电机，保证获得精确的运动控制。交流伺服电机通过齿轮驱动传动杆进而带动动作活塞3在动作腔室2中进行上下运动，最后在加压腔室4中产生压缩载荷。动作腔室和加压腔室均由热传导性能良好、且透明度高的聚甲基丙烯酸甲酯材料制成。加压腔室中设有多个传感器7(可包括压力、温度、湿度三个传感器)，系统在工作时，压力传感器、温度传感器和湿度传感器将其实时采集的电信号传送至数据采集卡(NI USB-6008)，通过基于PC端的LabVIEW软件控制程序在PC上实时显示和存储压力、温度、湿度信号。
[0025]参见图1图2，本发明多孔钛合金中骨骼细胞压应力加载的方法，包括下述步骤:
[0026](I)将图1装置用钴60放射性消毒，置于37°C、5% CO2的细胞培养箱中；
[0027](2)将多孔钛合金(--2448)进行高温、高压的消毒处理，置于24孔的细胞培养板中，随后将经传代消化处理的离体鼠胫骨骨骼细胞悬液滴入多孔钛合金中，将细胞培养板于细胞培养箱中静置3小时待细胞完全粘附于多孔钛合金表面；
[0028](3)随后加入细胞培养液覆盖多孔钛合金，静置12小时后，将细胞培养板经活动壁板5放入加压腔室4中；
[0029](4)在PC端通过LabVIEW软件控制程序设置需要的周期载荷的加载强度、频率和加载时间，通过控制运动控制卡驱动交流伺服电机，保证获得精确的运动控制，交流伺服电机I按照设定参数通过传动杆6带动动作活塞3对加压腔室内的多孔钛合金表面的骨骼细胞施加周期载荷；
[0030](5) PC端通过LabVIEW软件控制程序由数据采集卡实时动态的采集压力、温度和湿度传感器的信号，并通过显示器将压力、温度和湿度信号的变化以曲线形式显现出来。
[0031]加压和不加压的对比试验[0032]取新生乳鼠颅骨组织，采用组织块法分离原代培养的成骨细胞，加入10%胎牛血清的MEM培养基，置于37°C、5% CO2的细胞培养箱中，通过测定碱性磷酸酶特异性表达及矿化结节鉴定成骨细胞，取传代2~4代的成骨细胞作为实验细胞。细胞分实验组和对照组，两组均以2X 104/ml的密度接种于多孔钛合金表面并分别置于24孔细胞培养板中，实验组放入图1应力加载装置的加压腔室中，该装置置于细胞培养箱中使细胞在5% CO2浓度，37°C条件下生长，实验组施加60kPa空气动态周期压缩载荷刺激，加压频率为0.5Hz。每天加压lh，连续作用3天。对照组细胞放入加压腔室中，但不给予应力加载的刺激。3天后取出细胞，先用PBS洗去多孔钛合金中未黏附的细胞，每孔加入5g/L的ΜΤΤ200μL，37°C孵育4h后吸弃上清，加入ImL的DMSO溶解生成结晶物，每孔吸取200 μ L溶解液转移至96孔细胞培养板，使用酶标仪测量490nm下的吸光值，结果参见图3。
[0033]由图3所示，相比于对照组，空气动态周期压缩载荷刺激下的细胞其在490nm下的吸光值显著升高(η = 10,Ρ<0.05)，表明空气动态周期压缩载荷刺激对成骨细胞在多孔钛合金中的细胞增殖具有显著的促进作用。
[0034]加载装置加压腔室压力校准方法:
[0035]将德国菲索AFRISO公司的手持式测压仪放入图1装置的加压腔室4中，通过动作腔室2、动作活塞3对加压腔室施加载荷，伺服电机每旋转25圈(动作活塞向下运动)，PC端的LabVIEW软件控制程序进行一次压力数据的采集，同时读取手持式测压所测量的压力值，对所采样的数据点进行直线线性拟合，比较加载装置进行加压的过程中加压系统压力传感器与标准测压计所测的压力值。测量结果如图4所示，由图可见本发明的应力加载系统与标准测压计所测的压力值具有良好的匹配性，证实了该加压装置的良好工作精确性。
【权利要求】
1.一种多孔钛合金中骨骼细胞压应力的加载装置，其特征在于，包括一个矩形的加压腔室，其前侧设有一可开合的活动壁板，加压腔室上面连通一个筒形的动作腔室，其中设置动作活塞，该动作活塞上面连接一传动杆，传动杆通过传动组件连接伺服电机，该伺服电机由一台PC通过运动控制卡控制该伺服电机通过传动组件驱动传动杆带动动作活塞在动作腔室进行上下运动，进而在加压腔室中产生压缩载荷，并最终作用于事先放置于加压腔室中的多孔钛合金骨骼细胞试样，加压腔室中至少设置有压力传感器和温度传感器。
2.如权利要求1所述的多孔钛合金中骨骼细胞压应力的加载装置，其特征在于，所述的动作腔室和加压腔室均由热传导性能良好、且透明的聚甲基丙烯酸甲酯材料制成。
3.—种多孔钛合金中骨骼细胞压应力的加载方法，采用权利要求1所述的多孔钛合金中骨骼细胞压应力的加载装置完成，其特征在于，包括下述步骤: (1)将压应力加载装置用钴60放射性消毒，置于37°C、5%CO2的细胞培养箱中； (2)将多孔钛合金进行消毒处理，置于细胞培养板中，随后将经传代消化处理的骨骼细胞悬液滴入多孔钛合金中，将细胞培养板于细胞培养箱中静置3小时待细胞完全粘附于多孔钛合金表面； (3)随后加入细胞培养液覆盖多孔钛合金，静置12小时后，将细胞培养板经活动壁板放入加压腔室中； (4)在PC端设置需要的周期载荷的加载强度、频率和加载时间，通过运动控制卡控制伺服电机，伺服电机按照设定参数通过传动组件驱动传动杆带动动作活塞对加压腔室内的多孔钛合金表面的骨骼细胞施加周期载荷； (5)PC端通过数据采集卡实时动态的采集各传感器的信号，并通过显示器将信号的变化以曲线形式显现出来。
4.如权利要求3所述的多孔钛合金中骨骼细胞压应力的加载方法，其特征在于，步骤(4)所述周期载荷的加载强度为60kPa，加载频率为0.5Hz，加载时间为每天lh，连续3天。
【文档编号】C12N5/077GK103992947SQ201410228727
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】景达, 罗二平, 刘戈, 佟世超, 翟明明, 申广浩 申请人:中国人民解放军第四军医大学