一种人类嗅粘膜间充质干细胞的分离培养方法
【专利摘要】本发明提供了一种人类嗅粘膜间充质干细胞的分离培养方法。包括以下步骤：1、配制由DMEM和F12以1∶1混合而成的基础培养液；2、即时采集病员AS；3、将采集的AS加入配制出的人嗅粘膜间充质干细胞培养基中，在35℃～38℃、加3～7％的CO2。本发明可以高效快速的获得高纯度的嗅粘膜间充质干细胞，这群细胞具有较强的克隆形成能力、自我更新能力和多向分化潜能，本发明方法获得的嗅粘膜细胞具有较强的成脂能力、成骨能力、成神经干细胞能力和成神经元的能力，为在体外获取大量的具有干细胞运用于细胞和组织再生提供了新的方法。
【专利说明】一种人类嗅粘膜间充质干细胞的分离培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养【技术领域】，涉及一种人类嗅粘膜间充质干细胞的分离培养方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类来源于发育早期中胚层及外胚层的多能干细胞，具有能自我更新、多向分化的能力。目前研究的MSCs主要来源于成人骨髓以及脐带血。对于成人骨髓来源的间充质干细胞，由于其数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，且病毒感染率较高，加之供者的骨髓采集需进行骨髓穿刺术，故其获取受到一定的限制。
[0003]嗅粘膜间充质干细胞(olfactorymucosa mesenchymal stem cells, OM-MSCs)也称为外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells, 0E-MSC)。又因为定位于嗅粘膜固有层中，所以也称嗅粘膜固有层间充质干细胞(lamina propria mesenchymal stem cell,LP-MSCs)。1998年Huard JM等人首次发现在人嗅粘膜中存在干细胞且能够向神经元与非神经元细胞分化。大量研究证明=OM-MSCs具有与骨髓间充质干细胞相似的生物学特性及类似的免疫表型，而且在体外能够向脂肪细胞、成骨细胞、神经细胞、平滑肌细胞等分化，将嗅粘膜细胞植入鸡胚中，还能分化出典型的心脏，肌肉，肝脏，脑，脊髓等组织。OM-MSCs具有以下优点:①具有更强大的增殖效率和更短的传代时间；②位于鼻腔中，易于取材；③来源稳定，嗅粘膜终生可更新；④可自体移植，无免疫排斥反应；⑤安全性高，染色体核组分析和肿瘤基因分析显示体外 无限传代后没有基因变异；⑥无伦理道德问题。因此OM-MSCs在组织工程、细胞移植和基因治疗中将具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种人类嗅粘膜间充质干细胞的分离培养方法，本发明的有益效果是提取和培养的人类嗅粘膜间充质干细胞在传至10代后仍能维持干细胞的活性，保持干细胞的增殖和多项分化潜能。
[0005]本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行:
[0006]步骤1:配制人嗅粘膜间充质干细胞基础培养基；
[0007]步骤2:米集病员本人 AS (autologous serum)；
[0008]步骤3:将病员本人AS加入到人嗅粘膜间充质干细胞基础培养基中；
[0009]步骤4:鼻嗅粘膜获取；
[0010]步骤5:鼻粘膜放入培养皿中，用青霉素与生理盐水配比1:1清洗3遍，清洗残余血迹；
[0011]步骤6:在培养皿中用无菌剪刀将步骤中洗浄的嗅粘膜剪成面积为1mm3组织块；
[0012]步骤7:将组织块置于离心管中与培养基充分混合振荡种植于细胞培养瓶中，并置于37°C，5% CO2培养箱中培养；[0013]步骤8:细胞爬出之后换液，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养。
[0014]进一步，所述步骤I中配制人嗅粘膜间充质干细胞基础培养基的步骤为:a:取DMEM和F12按1:1混合而成的培养粉末，加纯净水至浓度为10~25g/L，并充分搅拌溶解，制得细胞的一般基础培养液，b:以I~10当量浓度的氢氧化钠调pH为7.0~7.5，c:层流细胞培养室抽滤消毒，4°C储存备用。
[0015]进一步，所述步骤2采集过程为:a、准备玻璃离心管、一次性无菌注射器、酒精棉；b、常规消毒、前臂静脉取血，不加任何抗凝剂；c、将静脉血置于无菌玻璃离心管中，室温或4°C条件下,离心1800~2000rmp,15分钟,可得到病员AS,并收集。
[0016]进一步，所述步骤4鼻嗅粘膜获取，a:获取嗅粘膜组织前三天，病员准备，鼻毛清理滴加氯霉素；b:获取前鼻内麻醉，丁卡因与生理盐水的比值1.2% -1.5%的纱棉片用枪状镊塞入病员鼻腔中，麻醉2次，每次5-8min ；c:使用筛窦咬钳取中鼻甲靠上部外侧粘膜组织；d:用注射器针头将组织块拨入试管内；e:将试管放入冰盒中，立即带回培养室培养。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1嗅粘膜间充质干细胞的流式细胞结果示意图；
[0018]图2嗅粘膜间充质干细胞光镜图片(40X)；
[0019]图3嗅粘膜间充质干细胞成骨图片(100X)；
[0020]图4嗅粘膜间充 质干细胞成脂图片(100X)。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0022]本发明采用的技术方案包括如下步骤:
[0023]1、配制人嗅粘膜间充质干细胞基础培养基，a:取DMEM和F12按1:1混合而成的培养粉末，加纯净水至浓度为10~25g/L，并充分搅拌溶解，制得细胞的一般基础培养液，b:以I~10当量浓度的氢氧化钠调pH为7.0~7.5 ;c:层流细胞培养室抽滤消毒，4°C储存备用。
[0024]2、采集病员本人AS，采集步骤为:a、准备玻璃离心管、一次性无菌注射器、酒精棉；b、常规消毒、前臂静脉取血，不加任何抗凝剂；c、将静脉血置于无菌玻璃离心管中，室温或4°C条件下,离心1800~2000rmp, 15分钟,可得到病员AS,并收集；
[0025]3、取步骤I配制出的人嗅粘膜间充质干细胞完全培养基，取步骤2即时采集病员本人AS加入到人嗅粘膜间充质干细胞基础培养基中，AS的含量为培养基的10~15% ;将加人嗅粘膜间充质干细胞完全培养基置于4°C冰箱中保存。
[0026]4、鼻嗅粘膜获取，a:获取嗅粘膜组织前三天，病员准备，鼻毛清理滴加氯霉素；b:获取前鼻内麻醉，丁卡因与生理盐水的比值1.2% -1.5%的纱棉片用枪状镊塞入病员鼻腔中，麻醉2次，每次5-8min，c:使用筛窦咬钳取中鼻甲靠上部外侧粘膜组织；d:用注射器针头将组织块拨入试管内:将试管放入冰盒中，立即带回培养室培养。
[0027]5、鼻粘膜从试管中取出放入培养皿中，用青霉素与生理盐水配比1:1清洗3遍，清洗残余血迹。
[0028]6、在培养皿中用无菌剪刀将步骤中洗浄的嗅粘膜剪成面积为1mm3组织块。[0029]7、将步骤(6)中的组织块置于离心管中与培养基充分混合振荡种植于细胞培养瓶中，并置于37°C，5% CO2培养箱中培养。
[0030]8、细胞爬出之后换液，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养。
[0031]当细胞融合面积达80%即可传代或继续其他实验。
[0032]本发明优点是提供的人嗅粘膜间充质干细胞的提取和培养方法能快速获得大量嗅粘膜间充质干细胞，并且能长时间维持嗅粘膜间充质干细胞的增殖和分化能力，在传代至第10代后获得的细胞仍然具有干细胞活性，本发明方法简单，可重复性强，操作简便易行，为嗅粘膜间充质干细胞的应用于临床治疗，起到不可估量的作用。
[0033]下面列举具体实施例对本发明进行说明:
[0034]实施例1:
[0035]获取嗅黏膜组织块(大小2 X 3mm) 2块，无菌条件下用I %青霉素反复冲洗3遍，去除残留血迹。在完全培养基中用无菌眼科剪将其剪成长约Imm3的组织块，组织块置于15ml离心管与完全培养基混合震荡均匀种植于细胞培养皿中，并置于37°C，5% C02培养箱中。培养第7天，细 胞爬出显微镜下观察到贴壁的梭形或多边形的细胞，之后每隔3天更换一次培养基。培养第15天，细胞约80%融合，按1: 3传代，之后可达到每1.5-2天传一代，最终得到充足的间充质干细胞。
[0036]实施例2:
[0037]获取嗅黏膜组织块(大小2X2mm)3±；fe，无菌条件下用1%青霉素反复冲洗，去除残留血迹。在完全培养基中用无菌眼科剪将其剪成长约Imm3的组织块，组织块置于15ml离心管中与完全培养基混合震荡均匀种植于细胞培养皿中，并置于37°C，5% C02培养箱中。培养第8天，显微镜下观察到贴壁的梭形或多边形的细胞，之后每隔3天更换一次培养基。培养第14天，细胞约80%融合，按1: 3传代，之后每3天传一代，最终得到充足的间充质干细胞。
[0038]实施例3:
[0039]获取嗅黏膜组织块(大小2X2mm)2±；fe，无菌条件下用1%青霉素反复冲洗，去除残留血迹。在完全培养基中用无菌眼科剪将其剪成长约Imm3的组织块，组织块置于15ml离心管中与完全培养基混合震荡均匀种植于细胞培养皿中，并置于37°C，5% C02培养箱中。培养第6天，显微镜下观察到贴壁的梭形或多边形的细胞，之后每隔3天更换一次培养基。培养第14天，细胞约80%融合，按1: 3传代，之后每3天传一代，最终得到充足的间充质干细胞。
[0040]将培养出的嗅黏膜间充质干细胞进行镜检、流式细胞仪检测特征表面标记及成骨成脂诱导并染色，图1为特征表面标记的流式图，细胞高表达间充质干细胞阳性标记物⑶105、⑶90、⑶73，不表达造血干细胞标记物⑶34、⑶45。检测结果显示为(1)^34-，(2)⑶45-，(3)⑶105+，(4)⑶73+，(5)⑶90+，证明所获得的细胞为间充质干细胞。图2为镜检照片。图3为骨组织诱导后茜素红染色钙盐沉积。图4为脂肪组织诱导后油红O染色脂滴。
[0041]以上对本发明结合实施例做了具体说明，但本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
【权利要求】
1.一种人类嗅粘膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于按照以下步骤进行: 步骤1:配制人嗅粘膜间充质干细胞基础培养基； 步骤2:采集病员本人AS ； 步骤3:将病员本人AS加入到人嗅粘膜间充质干细胞基础培养基； 步骤4:鼻嗅粘膜获取； 步骤5:鼻粘膜放入培养皿中，用青霉素与生理盐水配比1:1清洗3遍，清洗残余血迹； 步骤6:在培养皿中用无菌剪刀将步骤中洗浄的嗅粘膜剪成面积为1mm3组织块； 步骤7:将组织块置于离心管中与培养基充分混合振荡种植于细胞培养瓶中，并置于37°C,5% CO2培养箱中培养； 步骤8:细胞爬出之后换液，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养。
2.按照权利要求1所述一种人类嗅粘膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于:所述步骤I中配制人嗅粘膜间充质干细胞基础培养基的步骤为:a:取DMEM和F12按1:1混合而成的培养粉末，加纯净水至浓度为10~25g/L，并充分搅拌溶解，制得细胞的一般基础培养液，b:以I~10当量浓度的氢氧化钠调pH为7.0~7.5，c:层流细胞培养室抽滤消毒，4°C储存备用。
3.按照权利要求1所述一种人类嗅粘膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于:所述步骤2采集过程为:a、准备玻璃离心管、一次性无菌注射器、酒精棉；b、常规消毒、前臂静脉取血，不加任何抗凝剂；c、将静脉血置于无菌玻璃离心管中，室温或4°C条件下，离心1800~2000rmp，15分钟，可得到病员AS，并收集。
4.按照权利要求1所述一种人类嗅粘膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于:所述步骤4鼻嗅粘膜获取，a:获取嗅粘膜组织前三天，病员准备，鼻毛清理滴加氯霉素；b:获取前鼻内麻醉，丁卡因与生理盐水的比值1.2% -1.5%的纱棉片用枪状镊塞入病员鼻腔中，麻醉2次，每次5-8min ；c:使用筛窦咬钳取中鼻甲靠上部外侧粘膜组织；d:用注射器针头将组织块拨入试管内:将试管放入冰盒中，立即带回培养室培养。
【文档编号】C12N5/0775GK104031881SQ201410228728
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】卢明, 葛丽特, 段答 申请人:卢明