‘南通小方柿’DkGA2ox2 基因及其表达载体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，涉及‘南通小方柿’DkGA2ox2基因及其表达载体和应用。本发明首次从‘南通小方柿’克隆得到了一个新的DkGA2ox2基因，将其导入烟草，DkGA2ox2在烟草中过量表达；DkGA2ox2转基因烟草具有较强的矮化能力，可使植株矮化至野生型植株的32.11％。
【专利说明】‘南通小方柿’ DkGA2ox2基因及其表达载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及‘南通小方柿’ DkGA2ox2基因及其表达载体和应用。
【背景技术】
[0002]矮化植株株型紧凑，冠幅小，抗倒伏，且生产管理方便，丰产性能好。通过基因工程的手段利用矮化性状可以显著提高小麦和水稻等作物的产量，从而引发了上世纪响誉全球的“绿色革命”,从而使矮化育种成为植物育种的发展趋势。赤霉素(gibberellin，GA)是一类四环二萜羧酸，作为五大植物激素之一，影响着高等植物生长发育的各个阶段，如种子萌发、茎的伸长、花的诱导分化和性别决定、果实坐果等。早在1926年被日本植物病理学家发现，目前已发现赤霉素类物质 136 种(http://www.plant - hormones, info/gibberellins.htm)。其中，只有GA1、GA3、GA4、GA5、GA7等少数赤霉素具有生物活性，其余为合成前体或降解产物。赤霉素2-氧化酶(GA2i3 -羟化酶，GA2ox)是植物体内赤霉素代谢过程中的关键酶，是由多基因编码的双加氧酶，作用于有生物活性的GA1和GA4,使其在C - 2位羟基化转变成无活性的GA8和GA34,令植物体内GAs的活性降低而使植物节间缩短，产生矮化性状。其矮化功能已在拟南芥、烟草、小麦、茄科植物、百喜草、水稻、杨树、李树、长寿花和矮牵牛中得到验证。果树的矮化栽培更具有早果、质优、更新快、效益高的优点。柿(Diospyroskaki)最早栽培于我国，已有2000多年历史，我国亦是其原产地之一。但我国柿品种多为高大乔木，不便于管理栽培。‘南通小方柿’(Diospyros kaki Linn.cv.Nantongxiaofangshi)是 1982年在江苏省进行果树资源普查时于南通市发现的珍稀矮生型柿树品种。干性弱，无明显中心干，树姿开张，表现出明显的矮生性状；成年树高仅3.5 - 4米，为同等条件下生长的乔化品种的60%。但有关该品种矮生特性的分子层面的研究却尚未开展，是否与GA相关也还不了解。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一个新的‘南通小方柿’ DkGA2ox2基因。
[0004]本发明的又一目的是提供含有该基因的重组表达载体。
[0005]本发明的又一目的是提供该基因的应用。
[0006]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0007]‘南通小方柿’ DkGA2ox2基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]含有所述的DkGA2ox2基因的重组表达载体。
[0009]所述的重组表达载体优选将所述的DkGA2ox2基因插入到表达载体pYH4215的BamHI和SacI酶切位点之间所得。
[0010]含有所述的DkGA2ox2基因的宿主。
[0011 ] 所述的宿主优选农杆菌。
[0012]所述的DkGA2ox2基因在创制矮化新种质和/或植物品种改良中的应用。[0013]所述的含有DkGA2ox2基因的重组表达载体在创制矮化新种质和/或植物品种改良中的应用。
[0014]有益效果:
[0015]由于现有技术中尚未有柿科DkGA2ox2同源基因的报道，本发明通过同源克隆的方法，根据Genbank中其他物种中已知同源序列的保守区设计引物，经多次试验筛选引物及利用梯度PCR的方法对退火温度的进行不断优化得到了 DkGA2ox2的中间片段。本发明首次从‘南通小方柿’克隆得到了一个新的DkGA2ox2基因，通过blast将DkGA2ox2核苷酸序列与NCBI上登录的其它物种进行序列比对，DkGA2ox2与牵牛花(⑶189414.2)、苹果(FJ571521.1)、夹竹桃(AY594292.1)、毛白杨(JX102472.1)、梨(JF441168.1)、酸模(DQ641499.1)、葡萄(KC898179.1)、矮牵牛(⑶059939.1)烟草(AB125232.1)、陆地棉(HQ891931.1)的一致性分别为 75 % ,76 % ,74 % ,75 % ,75 % ,75 % ,74 % ,74 % ,73 %,73%。‘南通小方柿’DkGA2ox2氨基酸序列的同源性分析和比对结果表明，本发明所获得的DkGA2ox2与其他物种已知基因之间同源性较低，说明两基因在不同物种间保守性不高，在进化过程中所发生的变异程度也不同。
[0016]本发明还构建了 DkGA2ox2的重组表达载体，将其导入烟草，DkGA2ox2在烟草中过量表达；DkGA2ox2转基因烟草具有较强的矮化能力，可使植株矮化至野生型植株的32.11%。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1转DkGA2ox2基因烟草PCR检测
[0018]其中M表示marker，CK表示非转基因对照植株，P表示阳性对照(质粒)，I _ 21表示DkGA2ox2转基因烟草株系
[0019]图2转DkGA2ox2基因烟草RT - PCR检测
[0020]其中M表示marker，CK表示非转基因对照植株，P表示阳性对照(质粒)，2 - 12表示DkGA2ox2转基因烟草株系
[0021]图3移栽80天的转基因烟草株系的表型观察。
[0022]其中，WT:非转基因烟草株系；2 - 1，2 - 4:转DkGA2ox2基因烟草株系(下同)。
[0023]图4转基因烟草株系的株高变化情况。
[0024]图5外源喷施GA3可恢复转基因烟草表型
[0025]其中，A:喷施6^前；B:喷施6^后
[0026]图6转基因植株叶片GA1+3含量。
[0027]图7转基因和对照株系不同叶位上叶片的叶绿素含量。
[0028]其中横坐标4，10，16分别代表植株由下往上第4，10，16叶位叶片。
[0029]图8过量表达DkGA2ox2基因诱导烟草NtGA20ox、NtGA3ox和基因的表达。
[0030]图9pYH4215质粒图谱。
【具体实施方式】
[0031]实施例1
[0032]取‘南通小方柿’叶片，参考蔡斌华等改进的CTAB法提取RNA。根据GenBank中公布的GA2ox基因cDNA序列保守区域设计一对简并引物。GA2ox-F - AAYGGYGATRTBGGHTGGRTYGAATA - 3’ (SEQ ID N0.2) ；GA2ox-R:5’ - TGCYTYACRCTYTTAAAYCTYCCATTWGTCA - 3，(SEQ ID N0.3)。其中，Y:代表 C 或 T ;R 代表A或G ;B代表C、T或G ;H代表A、T或C ;W代表A或T。
[0033] 中间片段的获得
[0034]总RNA 中 DNA 的消化:(TaKaRa code: D2270A)。反转录参照 PrimeScript? RTreagent Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa code: RR037A)。PCR 扩增体系:100ng/ μ LcDNAl μ L, 10XPCR Buffer2.5 μ L, MgCl2 (25mM) 1.5μ L, dNTP (2.5mM) 2 μ L,上下游引物(GA2ox-F/GA2ox-R)各 I μ L，0.15 μ L rTaq 酶，用水补足至 25 μ L。PCR 程序为:94°C 4min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 40s，35个循环;72°C延伸IOmin0产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。回收目的片段并连接到PMD19-T载体上转化DH5a感受态细胞随机筛选白色菌落进行测序。
[0035]末端的获得
[0036]反转录时将PrimeScript? RT reagent Kit中Ramdom6替换为接头引物Rl 1466:5’ -GCAGGACTGCAGCTGACTGACTACT30VN-3’ 其中 V 代表 A 或 G 或 C，N 代表:A、T、C或G(SEQ I D N0.4)，反转录反应的温度从37 °C调至42 °C，反转录酶的失活反应的温度从85°C调至95°C )。PCR程序及体系亦同于中间片段的获得。以通用引物 R16326:5’ - GGTGGTAGAGCTCGCAGGACTGCAGCTGACTG - 3’ (SEQ ID N0.5)和特异外侦^引物 GA2ox23 ' GSP-1:5’ - TTGATGGACGAGCAGAGCG - 3’ (SEQ ID N0.6)进行第一轮扩增，反应体系及程序如下:PCR扩增体系:IOOng/μ L cDNAl μ L, 10XPCR Buffer2.5 μ L,MgCl2(25mM)1.5yL, dNTP (2.5mM) 2 μ L，上下游引物各 lyL,0.15 μ L rTaq 酶，用水补足至25 μ L0 PCR 程序为:94°C 4min ；94°C 30s，61。。30s, 72°C 40s, 35 个循环；72°C延伸 IOmin0将第一轮PCR产物稀释10倍后做模板，以内侧引物R16324:5’ - AGAGCTCGCAGGACTGCAGCAGCTGACTGACTAC - 3，(SEQ ID N0.7)与 GA2ox23' GSP-2:5’ - CATCTCCGTTCTAAGATCCAACA -3，(SEQ ID N0.8)进行第二轮扩增，
[0037]体系同上。
[0038]51末端的获得
[0039]cDNA 的获得参照 SMARTer? RACE cDNA amplification kit (Clontech,Cat.Nos.634923&634924)。利用 UPM 和特异的外侧引物 GA2ox25 ' GSP-1:
5’ - AGTTCTGGTCGGGCGGGACG - 3 ’ (SEQ ID N0.9)进行降落 PCR 的第一轮扩增，反应体系及程序如下:10 X Ex Taq buffer2.5 μ L, MgCl2 (25mM) 1.5 μ L，IOOng/ μ L cDNAl.0 μ L，GSP-10.5 μ L，UPM2.0 μ L，dNTP (2.5mM) 0.5 μ L, Ex Taq0.2 μ L, ddH2017.8 μ L,终体积25.0 μ L0
[0040]反应条件为:94°C5min ；94°C 30s，70°C 降落到 68°C 30s (每循环降低 0.5°C )，72°C 2min，5 个循环；94°C 30s，68°C 30s，72°C，90s，共 30 个循环；72°C lOmin。将第一轮PCR产物稀释 10 倍后做模板，以内侧引物 GA2ox25' GSP-2:5’ - GCCCTTCCGCCATTAACTCCAGTA -3’ (SEQ ID N0.10)与NUP进行第二轮扩增，体系同上。产物用I %琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收目的片段进行T/A克隆后测序。
[0041]利用DNAMAN对5'端、3'端及中间片段正确克隆的序列进行拼接，得到基因的全长序列，如SEQ ID N0.1所示。用BLAST进行相似性检索，发现DkGA2ox2核苷酸序列与牵牛花(⑶ 189414.2)、苹果(FJ571521.1)、夹竹桃(AY594292.1)、毛白杨(JX102472.1)、梨(JF441168.1)、酸模(DQ641499.1)、葡萄(KC898179.1)、矮牵牛(⑶059939.1)烟草(AB125232.1)、陆地棉(HQ891931.1)的一致性分别为 75 % ,76 % ,74 % ,75 % ,75 % ,75 %,74%,74%,73%,73% ,属于 DkGA2ox2 属于 GA2-氧化酶家族。
[0042]实施例2
[0043]根据载体和DkGA2ox2基因的酶切位点，设计含有BamHI和SacI基因特异引物，DkGA2ox2B-F:5’ -CGGGATCCATGGTGGTATTGTC-3’ (SEQ ID N0.11) ；DkGA2ox2S-R:5’ -CGAGCTCCTAAGTTAACGAGGCTGC-3’ (SEQ ID N0.12);以‘南通小方柿’全长 cDNA 为模板，进行 PCR扩增，PCR 反应体系为:IOOng/μ L cDNAl μ L, 10XPCR Buffer2.5 μ L, MgCl2 (25mM) 1.5μ L,dNTP (2.5mM) 2 μ L，上下游引物各IyL, 0.15 μ L rTaq酶，用水补足至25 μ L。PCR程序为:940C 4min ；94°C 30s, 62°C 40s, 72°C 70s，35 个循环；72°C延伸 lOmin。产物在 I %琼脂糖凝胶电泳分析。回收目的片段并连接到PMD19-T载体上转化DH5a感受态细胞随机筛选白色菌落进行测序。
[0044]将原始的pYH4215载体及经测序验证正确后的pMD19_T载体中DkGA2ox2基因利用BamHI和SacI进行双酶切。割胶回收载体和基因片段，连接5h后转化大肠杆菌。菌液PCR鉴定阳性克隆，随机挑取3个单克隆送样测序，以确保产物的准确性及特异性。提取质粒，PCR和酶切鉴定。将大肠杆菌质粒用冻融法转入农杆菌EHA105感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性克隆。
[0045]实施例3
[0046]冻融法将重组质粒转化农杆菌EHA105，调取单菌落于50ml含Km50mg.L—1的YEB液体培养基中，280C，200rpm摇床培养至0D600值约0.5时，5000rpm离心10min，倒去上清。菌体用50ml MS不含激素，不调pH的液体培养基重新悬浮，摇床培养Ih ;取30d苗岭生根健壮烟草祖培苗，从顶部剪取第4和5片完全展开叶，将烟草叶片剪成l_2cm2的叶块放入上述培养基中，不断轻摇浸泡3min ;用镊子取出叶片，放在无菌滤纸上吸去多余菌液，接种于共培养培养基(MS+BA1.0mg.L、NAA0.2mg.L-1 ρΗ5.8)中，28°C暗培养2_3d ;结束后，将烟草叶片转入筛选培养基(MS+6-BA1.0mg.L -1,NAA0.2mg.L ^hygSOmg.L- 1+cb200mg mL-l,ρΗ5.8)中，直接置于25°C下光照培养,光暗周期16h/8h,光强为40-50 μ mol.moL-2.84,每两周继代培养一次，直至愈伤组织分化出抗性植株。待抗性芽长至3-5cm时，剪下接入生根培养基(1/2MS+IBA0.2mg.L -1hygSOmg.L 1+Cb200mg.L1, ρΗ5.8)中诱导生根。一个月后打开瓶盖，进行自然光照，温度控制在20-25°C，炼苗I周。再将转基因苗移栽至育苗杯中，保持环境湿润，待可健壮生长后置于室外自然条件下培养。
[0047]实施例4转基因烟草株系的检测
[0048]在超净工作台上剪取转基因烟草及未侵染的野生型烟草叶片，浸入10μ I⑶S染液中，放置37°C培养箱中过夜后，使用70%乙醇脱色观察染色结果。对染色结果为蓝色的植株提取基因组DNA和总RNA，进行PCR和RT-PCR的检测。
[0049]4.1基因组DNA和总RNA的提取
[0050] 基因组DNA和总RNA的提取参考蔡斌华等(2008)和张计育等(2010)的方法，并稍作修改，具体方法如下:取幼苗叶片约0.3g于液氮中迅速研磨成粉末，加入含有900 μ LCTAB裂解液的2mL离心管中，65°C水浴30min (每IOmin轻轻颠倒混匀一次)，加入等体积的氯仿:异戍醇(24:1),轻轻上下颠倒混匀；4°C, 12000rpm离心15min,取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，轻轻上下颠倒混匀；4°C，12000rpm离心15min，取上清，重复抽提一次；转移上清至新的1.5mL离心管中，加入两倍体积的-20°C预冷的无水乙醇和1/10的3M的NaAc (pH5.2)(提取DNA)或者加入等体积的IOM LiCl (提取总RNA)，- 20°C静置直至絮状沉淀出现，4°C，12000rpm离心15min ;70%乙醇洗涤沉淀1- 2次，超净工作台上干燥，溶于50 μ L DEPC处理过的ddH20中。取I μ L的总核酸，用I %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
[0051]4.2PCR 检测
[0052]取上述提取的总核酸20 μ L进行基因组中RNA的消化，具体参照佟照国等(2008)的方法。将消化后的基因组DNA溶解于20 μ L的ddH20中，取I μ L的核酸，用I %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。DNA在Bio - photometer上检测浓度，体系为I μ L DNA样加入49 μ LddH20, DNA浓度、0D280/0D260直接从仪器上读取。
[0053]PCR检测模板:转基因植株DNA、阳性质粒样品、非转基因对照植株DNA ;PCR引物参照表 I ;扩增反应体系:IOOng/μ L cDNAl μ L, 10XPCR Buffer2.5 μ L, MgCl2 (25mM) 1.5μ L,dNTP(2.5mM)2 μ L,引物 DkGA2ox2B_F(SEQ ID N0.11)和 DkGA2ox2S_R(SEQ ID N0.12)各lyL,0.15 μ L rTaq 酶，用水补足至 25 μ L。PCR 程序为:94 °C 4min ；94°C 30s, 62 °C 40s,72°C 70s，35个循环；72°C延伸lOmin。产物在I %琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图1。
[0054]4.3RT - PCR 检测
[0055]将提取的总RNA在Bio - photometer上检测浓度，体系为I μ L RNA样加入49 μ LddH20, RNA 浓度、0D280/0D260、0D260/0D230 直接从仪器上读取；取 I μ L 的总 RNA，用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，剩余的总RNA进行DNA消化后反转录成cDNA，具体方法参考说明书(TaKaRa DRR047A)进行，合成后的cDNA于-20°C保存备用。
[0056]RT - PCR检测模板:转基因植株cDNA、阳性质粒样品、非转基因对照植株cDNA ;其余同PCR检测，结果见图2。
[0057]实施例5转基因烟草矮化性状分析
[0058]5.1转基因烟草植株形态指标的测定
[0059]转基因植株在茎和叶的形态上发生了显著变化(图3)，移栽后80d野生型烟草对照株系已到达盛花期，而转基因株系2 -1刚进入开花初期，但花序数量明显减低。2 - 4则还未有花期的迹象，表现出花期延迟的现象。且植株明显矮小，叶型紧凑。为了更精确的量化这些现象，对移栽80天的对照和转基因烟草株系进行株高、节间、茎粗、叶片长度(从叶基部到叶尖)和叶片宽度(叶片最宽距离)的测量，计算叶片长宽比。表1结果显示2个转基因株系株高均与对照有极显著差异，2 - 1、2 - 4的株高为对照的59.31%和32.11%。另外，转基因株系节间距离缩短，为野生型烟草的82.64%和32.23% ;茎粗增粗，比野生型烟草增长34.30%和64.98% ;叶片长度缩短，为野生型烟草的66.21 %和52.94% ;叶片宽度增大，比野生型烟草增长30.16%和4.37% ;以上指标均到达极显著差异水平。
[0060]野生型烟草和转基因株系的生长趋势大体相同，在移栽后20d之前长势区别不大。但在移栽后60d-80d野生型烟草快速增长的期间，转基因株系的株高并没有大幅度的提高，而继续保持和缓的生长趋势(图4)。
[0061]于移栽后30d对转基因烟草植株及对照喷施100mg/L的GA3。每周两次，连续喷施。30天后观察表型发现，通过施用外源GA3处理，转基因植株节间迅速伸长，能够正常开花，可恢复正常表型如图5。
[0062]表1转DkGA2ox2基因植株形态指标的测定
[0063]
【权利要求】
1.‘南通小方柿’ DkGA2ox2基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.含有权利要求1所述的DkGA2ox2基因的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体是将所述的DkGA2ox2基因插入到表达载体pYH4215的BamHI和SacI酶切位点之间所得。
4.含有权利要求1所述的DkGA2ox2基因的宿主菌。
5.根据权利要求4所述的宿主菌，其特征在于所述的宿主菌为农杆菌。
6.权利要求1所述的DkGA2ox2基因在创制矮化新种质和/或植物品种改良中的应用。
7.权利要求2所述的含有DkGA2ox2基因的重组表达载体在创制矮化新种质和/或植物品种改良中的应用 。
【文档编号】C12N1/21GK103993024SQ201410243661
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】渠慎春, 屠煦童, 辛璐, 宋少华, 蔡斌华, 余心怡, 候应军, 章镇 申请人:南京农业大学