冷冻原肠中微生物基因组dna的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种冷冻原肠中微生物基因组DNA的提取方法，在细胞裂解以前结合采用人工破碎、震荡洗脱、金属网过滤和梯度离心的方法同时对较多样品（10g）进行前处理。本发明既富集了细胞，解决了样品中微生物含量相对偏低的问题，也有效的去除了污染物的干扰，提高了DNA提取的效率和纯度。本发明具有较好的通用性，提取的冷冻原肠微生物基因组DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近标准值，可直接进行基因扩增和微生物多样性分析。
【专利说明】冷冻原肠中微生物基因组DNA的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种冷冻原肠中微生物基因组DNA的提取方法。
【背景技术】
[0002]原肠(intestine)是未经刮制的健康牲畜的小肠，它是生产天然肠衣(naturalcasings)并用于灌制香肠的重要原料之一。为了防止腐败变质，原肠必须在冷冻的条件下进行保存和运输，故又被称为冷冻原肠。目前国内外生产、加工天然肠衣所用的冷冻原肠主要为猪和羊的小肠。冷冻原肠来自于动物肠道，在屠宰场经过去粪、清洗和包装后再集中运往肠衣企业进行生产、加工，因此，冷冻原肠污染肠道内和外界的微生物是不可避免的，菌落总数可达到104~107 cfu/g，许多在公共卫生方面具有重要意义的微生物，如链球菌、沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌0157:H7、亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌等也包括在内。如果生产、加工场所卫生状况不良或保存温度过高，原肠携带微生物的数量在加工、运输过程中甚至会出现增加，这很容易给动物疫病防控和公共卫生安全造成威胁，也容易在肠衣进出口贸易中引起国际争端，影响我国肠衣生产、加工行业的健康发展。因此，对冷冻原肠中微生物多样性的研究 已逐渐引起人们的重视。目前，对冷冻原肠中微生物多样性的研究多为可培养微生物的研究，不仅周期长、工作量大，而且对于大量不可培养微生物也无能为力，因此很难全面真实地反映冷冻原肠中微生物的群落组成及结构。
[0003]近年来，随着现代分子生物学技术特别是核酸技术的发展，PCR、RELP, SSCP, DGGE等技术已在环境微生物生态学研究中广泛使用，而微生物基因组DNA的提取技术又是开展这些工作的前提和基础。但是，截至目前国内尚未见提取冷冻原肠中微生物基因组DNA的研究和报道。虽然近年来对动物肠道微生物基因组DNA的提取技术有很多研究报道，但是对于体型较大的动物如东北虎、熊猫、鼠类等，多选择动物肠道内容物(粪便)作为研究对象；而对于形体较小的动物，如虾、蝇类、桑天牛、思茅松毛虫等则多采用肠道及其内容物一起作为DNA提取样品。目前国外已有少量直接有从人、马和猪新鲜肠管中提取微生物基因组DNA进行微生物多样性研究的报道，但多采用锆珠或玻璃珠等结合研磨珠均质器(minibead beater)对样品进行处理,实验条件要求较高且后续的提取方法繁琐,不利用推广使用。另外，由于新鲜动物肠管及其内容物中微生物数量极大，如鼠类肠道细菌数量可达到1013~1014个，因此上述方法往往只要处理少量样品(0.2~2 g)即可提取到足量的微生物基因组DNA样品。与此不同的是，冷冻原肠中不仅粪便含量极少、动物肠道组织含量较多，而且原肠在去粪、清洗过程中细菌数量会有显著下降，因此，上述方法无法完全适用于冷冻原肠中微生物基因组DNA的提取工作。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种通用性好、可靠性高、操作简单的冷冻原肠中微生物基因组DNA的提取方法。
[0005]本发明的技术解决方案是:一种冷冻原肠中微生物基因组DNA的提取方法，其特征是:包括下列步骤:
(1)常温解冻冷冻原肠样品，在超净工作台内用高压灭菌处理过的剪刀、镊子将原肠纵向剪开，再剪碎，搅拌混匀；
(2)称取混匀后的样品10g加入无菌的250 mL三角烧瓶，再向三角烧瓶加入10 mL含
0.1% Tween80的灭菌生理盐水，密封三角烧瓶；
(3)将三角烧瓶震荡Imin，然后立即置冰上2 min ;重复本步骤3次；
(4)在超净工作台内用高压灭菌处理过的100目金属滤网过滤样品，收集滤液；
(5)将滤网中肠衣样品重新移回三角烧瓶，再向三角烧瓶加入10mL含0.1% Tween80的灭菌生理盐水,密封三角烧瓶；重复步骤(3)~(4) I次；
(6)弃去肠衣样品，将两次收集的滤液合并混匀，分装至灭菌离心管中，4°C,400 rpm离心5 min ；
(7)转移上清至新的灭菌离心管中,40C, 8000 rpm离心5 min,弃去上清,在沉淀中并加入总体积为2 mL的灭菌超纯水；
(8)重悬沉淀,4°C, 12 000 rpm离心5 min,弃去上清,保留沉淀；重复本步骤I次；
(9)在沉淀中加入总体积为800μ L的灭菌超纯水，重悬沉淀，分装入2个1.5 mL灭菌Eppendorf 管中；
(10)在2个Eppendorf管中分别加入与悬液等体积的酹、氯仿、异戍醇混合液,且体积比酹:氯仿:异戍醇为25:24:1,颠倒混匀6~10次,4 °C, 12 000 rpm离心10 min,小心将上清液分别转移至新的1.5 mL灭菌Eppendorf管中；重复本步骤I次；
(11)将上述步骤(10)获得的上清液加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，-20 °C静置2 h, 12 000 rpm离心10 min,弃去上清；
(12)加入70%乙醇600μ L洗涤沉淀，4 °C，12 000 rpm离心5 min，弃去上清，保留沉淀，在室温下充分干燥后，用20~40 μ L的TE缓冲液溶解沉淀，-20 1:保存备用。
[0006]其中，上述提取方法中，所述含0.1% Tween80灭菌生理盐水()中0.1%为体积比。
[0007]所 述酚为国产Tris饱和酚(Tris-phenol，pH 7.8~8.0)，氯仿和异戊醇为国产分析纯化学试剂。关于“室温下充分干燥”是指在空气中自然干燥30 min左右。
[0008]所述TE 缓冲液由 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), I mM EDTA (pH 8.0)组成。
[0009]本发明优点和效果:
(I)本发明是在细胞裂解以前结合采用人工破碎、震荡洗脱、金属网过滤和梯度离心的方法同时对较多样品(10 g)进行前处理，既富集了细胞，解决了样品中微生物含量相对偏低的问题，也有效的去除了污染物的干扰，提高了 DNA提取的效率和纯度。
[0010](2)本发明所提供的冷冻原肠中微生物基因组DNA的提取方法，具有较好的通用性，提取的冷冻原肠微生物基因组DNA的0D260/0D230及0D260/0D280接近标准值，可直接进行基因扩增和微生物多样性分析。
[0011](3)实验条件要求不高，所使用的设备和试剂均为实验室常规设备和常用试剂，一般生物化学或微生物学实验室均可完成，其成本远低于进口及国产同类产品试剂盒。
[0012](4)操作步骤简单，试验周期短，既节省了人力、物力和财力，又有效降低操作过程中对样品的污染和DNA分子的损坏，提取的基因组DNA具有较高的完整性和特异性。【专利附图】
【附图说明】
[0013]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0014]图1是冷冻羊原肠中微生物基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。其中泳道M为DNA分子量标准DL2 000 ;泳道1-2为冷冻羊原肠中微生物基因组DNA提取产物。
[0015]图2是冷冻羊原肠中细菌16S rDNA的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。其中泳道M为DNA分子量标准DL2 000 ;泳道1_3为冷冻羊原肠中细菌16S rDNA的PCR扩增产物。
【具体实施方式】
[0016]Tween80 (吐温80)、Tris (三羧基甲基氨基甲烷)、EDTA (乙二胺四乙酸)和Tris饱和酹(Tris-phenol, pH 7.8~8.0)均为国产试剂,NaC、无水乙醇、氯仿和异戍醇等均为国产分析纯化学试剂，PCR试剂盒(16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit)为宝生物工程(大连)公司产品(货号:D310)，金属滤网为浙江上虞市道墟张兴纱筛厂产品。
[0017](I)从冰箱取出密封、冰冻的羊原肠样品，置常温下解冻，在超净工作台内用高压灭菌处理过的剪刀、镊子先将原肠纵向剪开再充分剪碎，用镊子反复搅拌混匀。
[0018](2)称取混匀后的样品10 g加入无菌的250 mL三角烧瓶，再向三角烧瓶加入10mL灭菌生理盐水(含0.1% Tween80)，密封三角烧瓶。
[0019](3)将三角烧瓶漩涡震荡I min，立即置冰上2 min。重复本步骤3次。
[0020](4)在超净工作台内用 高压灭菌处理过的100目金属滤网过滤样品，收集滤液。
[0021](5)将滤网中肠衣样品重新移回三角烧瓶，再向三角烧瓶加入10 mL灭菌生理盐水(含0.1% Tween80)，密封三角烧瓶。重复步骤(3)~(4) I次。
[0022](6)弃去肠衣样品，将两次收集的滤液合并混匀，分装至灭菌离心管中，4 °C,400rpm 离心 5 min。
[0023](7)转移上清至新的灭菌离心管中,4 0C, 8000 rpm离心5 min,弃去上清,在沉淀中并加入总体积为2 mL的灭菌超纯水。
[0024](8)重悬沉淀,4 °C, 12 000 rpm离心5 min,弃去上清,保留沉淀。重复本步骤I次。
[0025](9)在沉淀中加入总体积为800 μ L的灭菌超纯水，重悬沉淀，分装入2个1.5 mL灭菌Eppendorf管中。
[0026](10)在2个Eppendorf管中分别加入与悬液等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),颠倒混匀6~10次,4 °C, 12 000 rpm离心10 min,小心将上清液分别转移至新的1.5 mL灭菌Eppendorf管中。重复本步骤I次。
[0027](11)将上述步骤(10)获得的上清液加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，-20 V静置2 h, 12 000 rpm离心10 min,弃去上清。
[0028](12)加入70%乙醇600 μ L洗漆沉淀,4 °C, 12 000 rpm离心5 min,弃去上清，
保留沉淀，室温下充分干燥后，用20~40 μ L的TE缓冲液溶解沉淀，-20 1:保存备用(参加图1)。
[0029]用分光光度计测定0D230、0D260、0D280,结果表明 0D260/0D230=2.04，0D260/0D280=1.83接近标准值(0D260/0D230标准值为2.0, 0D260/0D280标准值为1.8)，可直接
应用于微生物基因扩增和多样性分析。[0030]以上述提取的基因组DNA 为模板，用 16S rDNA Bacterial Identification PCRKit (宝生物工程(大连)公司产品，货号:D310)扩增细菌16S rDNA，PCR反应体系和条件参见试剂盒说明书进行，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳(参加图2)。
[0031]从上述结果可以看出，本发明方法不仅操作简单，成本低廉，而且可以获得高质量的DNA，用本方法提取的微生物基因组DNA为模板进行PCR，能成功扩增与预计大小一致的约I 700 bp的产物，条带亮度强，特异性好，可直接应用于微生物多样性分析。
[0032]最后需要指出的是，此处所描述的具体实施例仅用以说明本发明的技术方案，并不用于限定本发明。此外应理解，本领域技术人员可以对发明的技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本发明 技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
【权利要求】
1.一种冷冻原肠中微生物基因组DNA的提取方法，其特征是:包括下列步骤: (1)常温解冻冷冻原肠样品，在超净工作台内用高压灭菌处理过的剪刀、镊子将原肠纵向剪开，再剪碎，搅拌混匀； (2)称取混匀后的样品10g加入无菌的250 mL三角烧瓶，再向三角烧瓶加入10 mL含.0.1% Tween80的灭菌生理盐水，密封三角烧瓶； (3)将三角烧瓶震荡1min，然后立即置冰上2 min ;重复本步骤3次； (4)在超净工作台内用高压灭菌处理过的100目金属滤网过滤样品，收集滤液； (5)将滤网中肠衣样品重新移回三角烧瓶，再向三角烧瓶加入10mL含0.1% Tween80的灭菌生理盐水,密封三角烧瓶；重复步骤(3)~(4) I次； (6)弃去肠衣样品，将两次收集的滤液合并混匀，分装至灭菌离心管中，4°C,400 rpm离心5 min ； (7)转移上清至新的灭菌离心管中,40C, 8000 rpm离心5 min,弃去上清,在沉淀中并加入总体积为2 mL的灭菌超纯水； (8)重悬沉淀,4°C, 12 000 rpm离心5 min,弃去上清,保留沉淀；重复本步骤I次； (9)在沉淀中加入总体积为800μ L的灭菌超纯水，重悬沉淀，分装入2个1.5 mL灭菌Eppendorf 管中； (10)在2个Eppendorf管中分别加入与悬液等体积的酹、氯仿、异戍醇混合液,且体积比酹:氯仿:异戍醇为25:24:1,颠倒混匀6~10次,4 °C, 12 000 rpm离心10 min,小心将上清液分别转移至新的1.5 mL灭菌Eppendorf管中；重复本步骤I次； (11)将上述步骤(10)获得的上清液加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，-20 °C静置.2 h, 12 000 rpm离心10 min,弃去上清； (12)加入70%乙醇600μ L洗涤沉淀，4 °C，12 000 rpm离心5 min，弃去上清，保留沉淀，在室温下充分干燥后，用20~40 μ L的TE缓冲液溶解沉淀，-20 1:保存备用。
【文档编号】C12N15/10GK103981174SQ201410243617
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】仇保丰, 宋鸿雁, 陈 峰, 邵义祥, 刘文斌, 顾炳泉, 高逢结, 李建 申请人:中华人民共和国南通出入境检验检疫局, 南通大学