用于检测毒麦的引物对、探针及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及农业和植物检验检疫【技术领域】，提供一种用于检测毒麦的引物对和探针，其序列分别为：核酸引物F：5’-GAATCCCGCGAACCATCGAG-3’或其互补链、核酸引物R：5’-TAAAGCGAGGTCGCCTACCA-3’或其互补链，核酸分子探针P：5’-FAM-CACCCCACTAACTTGGTGT-TAMRA-3’或其互补链。本发明还提供利用该引物对和探针检测毒麦的实时荧光PCR检测方法。利用本发明提供的引物对和探针，通过实时荧光PCR检测技术，能在半个工作日内完成毒麦的检测，不仅检测时间大大缩短，检测的灵敏度也显著提高。
【专利说明】用于检测毒麦的引物对、探针及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业和植物检验检疫【技术领域】，具体涉及一种利用分子生物学检测技术检测毒麦(L.temulentum)的引物对和探针，本发明还涉及利用该引物对和探针检测毒麦的实时荧光PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]黑麦草属(Lolium L.)，为禾本科植物，目前在国内外文献中常出现的黑麦草属的植物有:毒麦(L.temulentum)、多年生黑麦草(L.perenne)、多花黑麦草(L.multiflorum)、硬直黑麦草(Lrigidum)等。由于黑麦草属许多种被广泛地用于牧草和饲料，因此，该属许多种在世界各地包括我国均有大量栽培，导致该属在世界范围内广泛分布。
[0003]黑麦草属的各种植物的籽实极为相似，但是其危害性及检疫地位各有不同。黑麦草属中的毒麦(L.temulentum)为有毒植物，世界上每年都会发生因误食毒麦导致的人畜中毒事件。在进口货物如小麦中，经常可截获有毒和有害杂草毒麦，但由于黑麦草属各种植物以及羊茅属(Festuca L.)等的籽实极为相似，其种子鉴定易发生混淆。
[0004]毒麦的传统鉴定方法是利用种子形态学特征、细胞生物学特征等进行鉴定。外观形态鉴定因能便捷地根据不同植物的外部特征对不同种植物进行分类而成为口岸检疫杂草的重要手段之一。但在实际工作中，农产品中夹杂的黑麦草杂草种子的外观特征往往会因运输受到磨损与变形，同时由于环境、气候、栽培条件的影响、种子成熟度的不同等引起个体差异，更为形态鉴定增 加了难度，而细胞生物学方法等需要的周期比较长且难以准确鉴定。迄今为止，尚未有分子水平的研究成果可用于鉴定毒麦。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的在于克服上述现有技术中在形态鉴定和细胞生物学鉴定方法中存在的困难，提出采用分子生物学的方法，对核糖体内转录间隔区(InternalTranscribed Spacers, ITS)序列差异设计毒麦的检测用引物、探针。
[0006]本发明的另一个目的在于建立毒麦(L.temulentum)的实时突光PCR检测方法。
[0007]本发明提供的检测毒麦的核酸引物对和探针是基于毒麦与其近似种在rDNA内转录间隔区序列上的差异设计的。18S~26S核核糖体DNA(nrDNA)的内转录间隔区ITS分为ITSl和ITS2两部分，ITS区在植物核基因组中是高度重复的，全部nrDNA重复单位包括4万个拷贝以串联重复(tandemr印eats)方式出现在一个或多个染色体基因位点上。在被子植物中，ITS区既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，说明这些间隔区的序列很容易在近缘类群间排序，而且丰富的变异可在较低的分类阶元上(如:属间和种间)解决植物系统发育问题。通过对不同生物类群的ITS序列(自生物学数据库)的比较得出:被子植物大多数科属的ITS序列的种间差异值为1.2%~10.2%,属间差异值为9.6%~28.8%，这对系统发育研究来说都是较合适的范围。
[0008]本发明首先提供一种用于检测毒麦的引物对，其序列为:[0009]核酸引物F，即上游引物:5’ -GAATCCCGCGAACCATCGAG-3’ (SEQ ID No I)或其互补链，
[0010]核酸引物R，即下游引物:5’ -TAAAGCGAGGTCGCCTACCA-3’ (SEQ ID No2)或其互补链。
[0011]本发明还提供一种用于检测毒麦的探针，其序列为:
[0012]核酸分子探针P:5’ -CACCCCACTAACTTGGTGT-3’ (SEQ ID No3)或其互补链，该核酸分子探针P为Taqman荧光探针，其5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，所述荧光基团可以是:羧基荧光素(FAM)，所述淬灭基团可以是:羧基四甲基落罗丹明(TAMRA)。
[0013]根据核苷酸碱基配对规则可以推知，与本发明提供的核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P核酸序列完全互补的核酸链组成的一组核酸组合物也适用于本发明当中。
[0014]进一步地，本发明提供一种用于检测毒麦的核酸组合物，包含上述核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P:
[0015]核酸引物F，即上游引物:5’ -GAATCCCGCGAACCATCGAG-3’ (SEQ ID No I)或其互补链，
[0016]核酸引物R，即下游引物:5’ -TAAAGCGAGGTCGCCTACCA-3’ (SEQ ID No2)或其互补链。
[0017]核酸分子探针 P:5’ -CACCCCACTAACTTGGTGT-3’ (SEQ ID No3)或其互补链，该核酸分子探针P为Taqman突光探针，其5’端标记突光基团，3’端标记洋灭基团。
[0018]上述荧光基团可以是:羧基荧光素(FAM)，上述淬灭基团可以是:羧基四甲基落罗丹明(TAMRA)。
[0019]本发明还提供上述包含核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P的核酸组合物在对毒麦进行实时荧光PCR检测中的用途。
[0020]更进一步地，本发明提供一种用于检测毒麦的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤:
[0021](I)设计合成引物和探针:所述引物为上述的核酸引物F和核酸引物R，所述探针为上述的核酸分子探针P;
[0022](2)样品 DNA 提取；
[0023](3)采用步骤(1)设计的引物和探针进行实时荧光PCR扩增。
[0024]上述步骤(1)中，核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P的序列分别为:
[0025]核酸引物F，即上游引物:5’ -GAATCCCGCGAACCATCGAG-3’ (SEQ ID No I)或其互补链，
[0026]核酸引物R，即下游引物:5’ -TAAAGCGAGGTCGCCTACCA-3’ (SEQ ID No2)或其互补链。
[0027]核酸分子探针P:5’ -CACCCCACTAACTTGGTGT-3’ (SEQ ID No3)或其互补链，该核酸分子探针P为Taqman突光探针，其5’端标记突光基团，3’端标记洋灭基团。
[0028]上述荧光基团可以是:羧基荧光素(FAM)，上述淬灭基团可以是:羧基四甲基落罗丹明(TAMRA)。
[0029]上述步骤(2)中:样品DNA提取采用本领域内的常规方法进行。
[0030]上述步骤(3)中:实时荧光PCR扩增反应体系为25 μ I:2 XPremix ExTaqTM12.5yL，核酸引物F和核酸引物R各lyL，核酸分子探针PlyL，DNA模板I μ L，50 X ROX Reference Dye 110.5 μ L,灭菌蒸懼水补至25 μ L。反应程序为:预变性95°C IOs ；然后以95°C 15s，65°C Imin进行40个循环。
[0031]本发明是在提取种子的DNA后，利用核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P进行实时荧光PCR检测，PCR扩增后的阳性样品能检测到荧光信号，PCR扩增后的阴性样品及空白对照无法检测到有荧光信号的增加，由此可以区分毒麦和其它黑麦草属的样品。
[0032]毒麦的传统鉴定方法是利用种子形态学特征、细胞生物学特征等进行鉴定，但外观形态鉴定存在不确定性，细胞生物学方法不仅需要较长的周期，而且仅依据染色体的形态仍难以鉴定。本发明采用核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探针P及其互补核酸链形成的核酸组合物，采用实时荧光PCR检测技术实现对毒麦的特异性区分，能在半个工作日内完成检测，大大缩短了检测时间，并且能特异敏感准确快速地鉴定毒麦及其近似种，有利于口岸检验检疫、农业生产和植物保护等领域对目标样品的快速准确的检测鉴定。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为利用本发明的引物和探针对【具体实施方式】中毒麦及其近似品种样品(见表I)中的部分受检样品进行实时荧光PCR检测结果示意图。
[0034]图中，曲线O为空白 对照；
[0035]曲线1、2、3分别为【具体实施方式】样品表1中黑麦草属序号为21,23,24的毒麦样品的扩增曲线；
[0036]曲线4为【具体实施方式】样品表1中黑麦草属序号为I的多花黑麦草的扩增曲线；
[0037]曲线5为【具体实施方式】样品表1中黑麦草属序号为2的多年生黑麦草的扩增曲线。
[0038]图1中，阳性样品检测曲线1、2、3随PCR扩增次数增加，其荧光信号强度显示明显增加；而阴性样品检测曲线4、5及空白对照曲线O没有显示荧光信号的增加。
[0039]图2为利用本发明的引物和探针对【具体实施方式】中毒麦及其近似品种样品(见表I)的另一部分受检样品进行实时荧光PCR检测结果示意图。
[0040]图中，曲线O为空白对照；
[0041]曲线I为【具体实施方式】样品表1中黑麦草属序号为21的毒麦样品的扩增曲线；
[0042]曲线2为【具体实施方式】样品表1中黑麦草属序号为10的多年生黑麦草的扩增曲线.-^4 ，
[0043]曲线3为【具体实施方式】样品表1中黑麦草属序号为18的多花黑麦草的扩增曲线；
[0044]曲线4为【具体实施方式】样品表1中黑麦草属序号为19的硬直黑麦草的扩增曲线；
[0045]曲线5为【具体实施方式】样品表1中羊茅属序号为25的苇状羊茅的扩增曲线。
[0046]图2中，阳性样品检测曲线I随PCR扩增次数增加，其荧光信号强度显示明显增加；而阴性样品检测曲线2、3、4、5及空白对照曲线O没有显示荧光信号的增加。
【具体实施方式】
[0047]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式进行详细的阐述。[0048](I)设计合成引物和探针
[0049]引物F，即上游引物:5’ -GAATCCCGCGAACCATCGAG-3’ ；
[0050]引物R，即下游引物:5 ’ -TAAAGCGAGGTCGCCTACCA-3 ’ ；
[0051 ]核酸分子探针 P: 5 ’ -FAM-CACCCCACTAACTTGGTGT-TAMRA-3 ’。
[0052]上述引物对和探针分别委托上海生工生物科技公司和基康生物公司进行合成。
[0053](2).样品 DNA 提取
[0054]3粒种子液氮研磨粉碎,用试剂盒法(天根公司的DP320植物DNA提取试剂盒)提取 DNA。 [0055](3).实时荧光PCR检测
[0056]实时荧光PCR扩增体系25 μ I =Premix Ex TaqTM (2 X) 12.5 μ L,上、下游引物(5 μ mol/L)各 I μ L，TaqMan 核酸分子探针 P (5 μ mol/L) I μ L, DNA (10 ~20ng/ μ L)模板 I μ L，ROX Reference Dye II (50 X) 0.5 μ L，灭菌蒸馏水补至 25 μ L，在 ABI7500 型 FastReal-Time PCR System上进行实时荧光PCR扩增。反应程序为:预变性95°C IOs ;然后以950C 15s，65°C Imin 进行 40 个循环。
[0057]采用上述相同的检测步骤，对来自于不同地区的毒麦及其近似品种的样品(见表I)进行检测，检测结果见表2:
[0058]表1 PCR扩增所用材料及其来源
[0059]
【权利要求】
1.一种用于检测毒麦的引物对，其特征在于，其序列为: 核酸引物 F:5’ -GAATCCCGCGAACCATCGAG-3’ (SEQ ID Nol)或其互补链； 核酸引物 R:5’ -TAAAGCGAGGTCGCCTACCA-3’ (SEQ ID No2)或其互补链。
2.一种用于检测毒麦的探针，其特征在于，其序列为: 核酸分子探针P:5’ -CACCCCACTAACTTGGTGT-3’ (SEQ ID No3)或其互补链，其5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的用于检测毒麦的探针，其特征在于，所述荧光基团为羧基荧光素。
4.根据权利要求2所述的用于检测毒麦的探针，其特征在于，所述淬灭基团为羧基四甲基落罗丹明。
5.一种用于检测毒麦的核酸组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的核酸引物F、核酸引物R和权利要求2所述的核酸分子探针P。
6.权利要求5所述的核酸组合物在对毒麦进行实时荧光PCR检测中的用途。
7.一种用于检测毒麦的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)设计合成引物和探针:所述引物为权利要求1所述的核酸引物F和核酸引物R，所述探针为权利要求2所述的核酸分子探针P ； (2)样品DNA提取； (3)采用步骤(1)设计的引物和探针进行实时荧光PCR扩增。
8.根据权利要求7所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系为25 μ I:2 XPremix Ex TaqTM12.5 μ L，核酸引物F和核酸引物R各I μ L，核酸分子探针Pl μ L, DNA 模板 I μ L, 50 X ROX Reference Dye 110.5 μ L，灭菌蒸馏水补至 25 μ L。
9.根据权利要求7所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为:预变性95°C IOs;然后以95°C 15s，65°C Imin进行40个循环。
【文档编号】C12N15/11GK104017875SQ201410243569
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】印丽萍, 吴申懋, 傅怡宁, 薛华杰 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局