Hedgehog信号通路过表达转基因家蚕细胞系及所用重组转座载体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组转座载体PXL-BACⅡ-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor的构建方法，包括以下步骤：1)设计家蚕Hedgehog基因扩增引物；2)克隆Hedgehog基因：以纯种P50家蚕为材料，提取总RNA；反转录合成得到cDNA；再以此cDNA为模板，PCR合成Hedgehog基因；PCR产物直接连接到pMD18-T载体上，测序确认；3)构建Hh基因过表达重组转座载体PXL-BACⅡ-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor。本发明采用RT-PCR方法合成家蚕Hedgehog基因，测序后构建转座载体，并通过转座载体插入家蚕细胞的基因组，获得Hedgehog信号传导通路过表达的转基因家蚕细胞系，用于研究Hedgehog基因功能。
【专利说明】Hedgehog信号通路过表达转基因家奋细胞系及所用重组转座载体
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于Hedgehog信号传导通路过表达研究的转基因家蚕细胞系的构建。具体地讲，本发明采用RT-PCR方法合成家蚕Hedgehog基因，测序后构建转座载体，并通过转座载体插入家蚕细胞的基因组，获得Hedgehog信号传导通路过表达的转基因家蚕细胞系，用于研究Hedgehog基因功能。
【背景技术】
[0002]从脊椎动物到无脊椎动物，Hh信号通路广泛存在并高度保守，在动物胚胎多种组织器官的发育中发挥重要作用。Hh以及它下游信号分子的变异与多种癌症等疾病的发生有关。因此，研究Hh信号通路的转导机制对于了解动物体的生长发育机制以及某些疾病的发
生都有着重要意义。
[0003]Hh信号通路包括具有信号传递活性的分泌型信号糖蛋白Hh、12次跨膜蛋白受体Patched(Ptch)、7次跨膜效应蛋白Smoothened(Smo)和下游可入核参与信号转导的锌指转录因子C1、微管驱动蛋白Costal2 (Cos2),丝氨酸/苏氨酸激酶Fused(Fu)等。
[0004]家蚕不仅是重要的经济昆虫，而且也是鳞翅目昆虫的典型模式生物，同时也是开发新一代生物反应器的重要材料。脂肪体是家蚕体内重要的组织器官，具有类似哺乳动物肝脏和肾脏的功能， 它既是糖类、脂类和蛋白质等物质的合成和代谢中心，还具有贮存营养、解毒以及为生命周期活动提供各种生物合成的代谢产物等生理功能。脂肪体内贮存物质丰富与否与幼虫生长发育及变态、成虫产卵量和卵质量好坏都有密切关系。构建Hedgehog信号传导通路过表达转基因细胞系，研究其Hh信号通路对于家蚕脂肪细胞分化发育的调控作用，具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供构建Hedgehog信号传导通路过表达研究的转基因细胞系，研究其Hh信号通路对于家蚕脂肪细胞分化发育的调控作用。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明提供一种重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor的构建方法，包括以下步骤:
[0007]I)、设计家蚕Hedgehog基因扩增引物；
[0008]2)、克隆 Hedgehog 基因:
[0009]以纯种P50家蚕为材料，提取总RNA ;反转录合成得到cDNA ;再以此cDNA为模板，PCR合成Hedgehog基因；PCR产物直接连接到pMD18_T载体上，测序确认；
[0010]3)、构建 Hh 基因过表达重组转座载体 PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor0
[0011]作为本发明的重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor的构建方法的改进，包括以下步骤:
[0012]①、利用家蚕基因组数据库(http://silkworm.genomics.0rg.cn/)和NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的 EST 数据库设计家香 Hedgehog 基因扩增引物(在上下游引物两端加上BamHI和EcoRI酶切位点)；
[0013]②、以纯种P50家蚕为材料，取50_100mg家蚕组织，提取总RNA进行反转录，合成cDNA ；以上述合成的cDNA为模板，并以上述步骤①设计并合成的引物，进行PCR扩增；
[0014]③、以回收纯化试剂盒将上述Hedgehog基因目的片段进行回收，直接连接到PMD18-T载体上，转染大肠杆菌感受态细胞DH5 α，取100 μ I质粒菌液进行测序、确认序列；克隆获得的Hedgehog基因目的片段长度为834bp ；
[0015]④、取PXL-BAC I1-ZsGFP_BmU6 和 pMD18T_Hh 载体分别用 BamHI 和 EcoRI 这两种限制性内切酶进行双酶切反应；将回收所得产物采用T4连接酶，16°C连接过夜；连接产物转化DH5 α感受态细胞，培养单菌落，并提取质粒进行BamHI和EcoRI双酶切鉴定，得到PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh 载体；
[0016]⑤、用EcoRI酶切PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6_Hh，酶切产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带，并将与预期大小(约7000bp)相符的目的片段进行回收；将 ie-NecZ-poly (A)EcoRI 酶切回收产物克隆到上述 PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh 的EcoRI酶切回收产物中，经过转化感受态，培养单菌落并鉴定后，得到重组转座质粒PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor0
[0017]备注说明:重组 转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmUe-Hh-Nec/用于Hedgehog信号传导通路过表达研究。
[0018]作为本发明的重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor的构建方法的改进:
[0019]家蚕Hedgehog基因扩增引物为:
[0020]Hh-cDNA-F: cgcggatccgcgATGAACCAGTGGCCGGGAGT
[0021]Hh-cDNA-R:cggaattccgTCGATATCTATACGATGCTGo
[0022]本发明还同时提供了一种用于Hedgehog信号传导通路过表达研究的转基因家蚕细胞系的构建方法，包括以下步骤:
[0023]I)将重组转座载体 PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor 质粒和 Helper 质粒按照 1:1的质量比混匀，采用转染试剂lipofectamineTM2000转染家蚕细胞BmN，转染24小时后观察荧光蛋白的表达情况；
[0024]2)通过不同浓度的G418筛选培养基确定BmN对G418的敏感度，从而确定BmN细胞最佳筛选浓度为800 μ g/mL ；
[0025]3)将重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor转染BmN细胞，培养24小时后加入药物新霉素类似物G418(试验确定最佳筛选浓度800 μ g/ml),连续筛选一个月后可以看到阴性细胞已全部死亡，视野中全部为发出绿色荧光的阳性细胞；所得到的转基因细胞系既有抗G418能力，又能表达绿色荧光蛋白。
[0026]本发明还同时公开了转基因细胞系中Hh信号通路及其靶基因AP2的表达情况，SPHedgehog基因功能分析,包括以下步骤:
[0027]I)、在上述转基因家蚕细胞系中，Hh基因的表达水平极高，Smo, Ci和Fu的表达水平也随之升高，但是Ptch和Cos2的表达水平反而降低，这说明了在转基因细胞系中Hh基因得到极其有效的过表达，从而使Hh信号通路激活，SmoXi和Fu是Hh信号通路的正调控因子，表达激活，表达量增加，而PtCh和Cos2作为Hh信号通路的负调控因子，在此时表达受到抑制，表达量降低；
[0028]2)、在上述转基因家蚕细胞系中，AP2基因的表达量也有明显降低，因为AP2是脂肪标记蛋白，脂质伴侣，因此Hh信号通路抑制脂肪形成。
[0029]综上所述，本发明主要技术内容包括以下步骤:
[0030]1)设计家蚕Hedgehog基因扩增引物。
[0031]2)克隆Hedgehog基因。以纯种P50家蚕为材料，提取总RNA ;反转录合成得到cDNA ;再以此cDNA为模板，PCR合成Hedgehog基因；PCR产物直接连接到pMD18_T载体上，测序确认。
[0032]3)构建Hh基因过表达重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor0
[0033]4)重组转座载体转染家蚕BmN细胞。上述重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh_Neor 用 I ipofectamine?2000Reagent (Invitrogen)转染试剂转染家蚕BmN细胞，转染24小时后观察荧光蛋白的表达情况。
[0034]5)建立转基因细胞系。按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基进行筛选，根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3-5天更换一次筛选培养基。一个月后，得到稳定的转基因细胞系。
[0035]6)分析转基因细胞系中Hh信号通路和AP2基因的表达情况。
[0036]本发明的具体技术方案如下:
[0037]步骤(1):设计家蚕Hedgehog基因扩增引物
[0038]利用家香基因组数据库(http://silkworm.genomics.0rg.cn/)和NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的EST数据库设计家蚕Hedgehog基因扩增引物。
[0039]步骤(2):克隆Hedgehog基因
[0040]2-1:以纯种P50家蚕为材料，取50~10mg家蚕组织，按Takara的RNA提取试剂盒(RNAizol Plus)的说明书操作，提取总RNA。
[0041]2-2:将提取的总RNA用反转录试剂盒PrimcScriptli RT Master Mix Perfect RealTime (DRR036A, TAKARA)进行反转录，合成 cDNA。
[0042]2-3:以上述合成的cDNA为模板，并以上述设计并合成的引物(在上下游引物两端加上BamHI和EcoRI酶切位点)，进行PCR扩增。克隆获得的Hedgehog基因目的片段长度为 834bp。
[0043]2-4:以上海生物工程有限公司琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒将上述Hedgehog基因目的片段进行回收，直接连接到PMD18-T载体上，转染大肠杆菌感受态细胞(DH5 α )，取100 μ I质粒菌液送至上海生物工程有限公司测序、确认序列。
[0044]步骤(3):构建Hh基因过表达重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor
[0045]3-1:载体与目的基因片段的获取:取PXL-BAC I1-ZsGFP_BmU6和pMD18T_Hh载体分别用BamHI和EcoRI这两种限制性内切酶进行双酶切反应。37°C水浴3h后对产物进行I %琼脂糖凝胶电泳。PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6酶切产物回收载体片段，pMD18T-Hh回收Hh基因片段。
[0046]3-2 =PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6_Hh载体的构建:将回收所得产物采用T4连接酶，16°C连接过夜。连接产物转化DH5a感受态细胞，培养单菌落，并提取质粒进行BamHI和EcoRI 双酶切鉴定，得到 PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh 载体。
[0047]3-3 =PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh_Neor 载体构建:用 EcoRI 酶切PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh，反应体系同上，酶切产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带，并将与预期大小(约7000bp)相符的目的片段进行回收。将Ie-Neolr-P0Iy(A)Ec0RI酶切回收产物克隆到上述PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh的EcoRI酶切回收产物中，经过转化感受态，培养单菌落并鉴定后，得到重组转座质粒PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor0
[0048]步骤(4):重组转座载体转染家蚕BmN细胞
[0049]4-1:转染步骤按照 lipofectamine?2000Reagent (Invitrogen)说明书进行。转染前24h接种BmN细胞(2 X 15)于2ml细胞培养皿，28°C条件下培养，待细胞培养24h后细胞汇合度达到60-80%,可做转染。取出4°C保存的转染试剂lipofectamine?2000Reagent,震荡混匀。取两个灭菌的1.5ml离心管中各加入10ml不含G418的无血清培养基。取其中一管加入4 μ I转染试剂，混匀；另一管中以1:1的质量比转染PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor重组转座质粒和Helper质粒,混匀。室温温育5min。将两管混合,室温温育混合物20min。将细胞培养皿从恒温箱中取出，吸去上清，用无血清培养基洗涤两次，加入1.8ml无血清培养基，将混合物加入培养皿中。轻轻混匀后立即把细胞培养皿放入恒温箱培养。孵育4-5h后更换转染培养基，将无血清培养基换为含10%胎牛血清的TClOO培养基。
[0050]4-2:转染24小时后观察荧光蛋白的表达情况。
[0051]步骤(5):建立 转基因细胞系
[0052]5-1:筛选确定BmN对G418的敏感度。(I)取G418 (5g)在无菌状态下加入10ml超纯水制成 50mg/ml 原液，于-20°C|C存备用。(2)按 400 μ g/ml>600 μ g/ml>800 μ g/ml、1000 μ g/ml、1200 μ g/ml、1400 μ g/ml，1600 μ g/ml 梯度浓度用 TC-1OO 昆虫培养基稀释G418制成筛选培养基。(3)根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3-5天更换一次筛选培养基。连续筛选10-14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
[0053]5-2:通过不同浓度的G418筛选培养基确定BmN对G418的敏感度，确定BmN细胞最佳筛选浓度为800 μ g/mL。
[0054]5-3:上述转座载体转染BmN细胞，培养24小时后加入药物新霉素类似物G418 (试验确定最佳筛选浓度800 μ g/ml)，连续筛选一个月后可以看到阴性细胞已全部死亡，视野中全部为发出绿色荧光的阳性细胞。所得到的转基因细胞系既有抗G418能力，又能表达绿色荧光蛋白。
[0055]步骤(6):分析转基因细胞系中Hh信号通路和AP2基因的表达情况
[0056]在转基因细胞系中，Hh基因的表达水平极高，Smo, Ci和Fu的表达水平也随之升高，但是Ptch和Cos2的表达水平反而降低，这说明了在转基因细胞系中Hh基因得到极其有效的过表达，从而使Hh信号通路激活，Smo, Ci和Fu是Hh信号通路的正调控因子，表达激活，表达量增加，而Ptch和Cos2作为Hh信号通路的负调控因子，在此时表达受到抑制，表达量降低。
[0057]另外在转基因细胞中，AP2基因的表达量也有明显降低，因为AP2是脂肪标记蛋白基因，因此Hh信号通路抑制脂肪形成。
[0058]本发明的有益效果如下:
[0059]研究Hh信号通路的传导机制对于了解动物体的生长发育机制以及某些疾病的发生都有着重要意义。家蚕作为模式动物，阐明Hedgehog信号通路在脂肪细胞生长发育过程中的作用及其分子机制将对于人们认识脂肪细胞分化的调控机制具有重要意义。构建Hedgehog信号传导通路过表达转基因细胞系，研究其Hh信号通路对于家蚕脂肪细胞分化发育的调控作用，具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0060]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0061]图1是家蚕Hh基因的cDNA序列及推导的氨基酸序列；
[0062]图2 是 PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6_Hh 载体示意图；
[0063]图3 是 PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor 载体示意图；
[0064]图4是筛选一个月后的家蚕转基因细胞系；
[0065]左图为家蚕转基因细胞在紫外光下呈现绿色荧光；
[0066]右图为非转基因家蚕细胞在紫外光下无绿色荧光。
[0067]图5是转基因家蚕细胞基因组PCR扩增Nec/，GFP和Hh基因鉴定；
[0068]泳道1-3分别为:以转基因细胞基因组为模板，Neo1^GFP和Hh引物进行PCR扩增。泳道4-6分别为:以对照细 [0069]图6是Hh信号通路基因及AP2基因在转基因细胞系和正常细胞系中的表达。
【具体实施方式】
[0070]实施例1:克隆合成家蚕Hedgehog基因
[0071]利用家香基因组数据库(http://silkworm.genomics.0rg.cn/)和NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的EST数据库设计家蚕Hedgehog基因扩增引物。
[0072]家蚕Hedgehog基因扩增引物序列:
[0073]Hh-cDNA-F: cgcggatccgcgATGAACCAGTGGCCGGGAGT
[0074]Hh-cDNA-R: cggaattccgTCGATATCTATACGATGCTG
[0075]以纯种P50家蚕为材料，取50~10mg家蚕组织，按Takara的RNA提取试剂盒(RNAizol Plus)的说明书操作，提取总RNA。
[0076]将提取的总RNA 用反转录试剂盒 PrimcScriplR RT Master Mix Perfect Real
Time (DRR036A, TAKARA)进行反转录，合成 cDNA。
[0077]RT-PCR扩增体系为:
[0078]①在Microtube中配制下列混合液。
【权利要求】
1.重组转座载体PXL-BACI1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor的构建方法，其特征在于包括以下步骤: 1)、设计家蚕Hedgehog基因扩增引物； 2)、克隆Hedgehog基因: 以纯种P50家蚕为材料，提取总RNA ;反转录合成得到cDNA ;再以此cDNA为模板，PCR合成Hedgehog基因；PCR产物直接连接到pMD18_T载体上，测序确认； 3)、构建Hh基因过表达重组转座载体PXL-BACI1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor0
2.根据权利要求1所述的重组转座载体PXL-BACI1-ZsGFP-BmUe-Hh-Neolr的构建方法，其特征在于包括以下步骤: ①、利用家蚕基因组数据库和NCBI的EST数据库设计家蚕Hedgehog基因扩增引物； ②、以纯种P50家蚕为材料，取50-100mg家蚕组织，提取总RNA进行反转录，合成cDNA；以上述合成的cDNA为模板，并以上述步骤①设计并合成的引物，进行PCR扩增； ③、以回收纯化试剂盒将上述Hedgehog基因目的片段进行回收，直接连接到PMD18-T载体上，转染大肠杆菌感受态细胞DH5a，取100 μ I质粒菌液进行测序、确认序列；克隆获得的Hedgehog基因目的片段长度为834bp ； ④、取PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6 和 pMD18T_Hh 载体分别用 BamHI 和 EcoRI 这两种限制性内切酶进行双酶切反应；将回收所得产物采用T4连接酶，16°C连接过夜；连接产物转化DH5 α感受态细胞，培养单菌落，并提取质粒进行BamHI和EcoRI双酶切鉴定，得到PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh 载体； ⑤、用EcoRI酶切PXL-BACI1-ZsGFP-BmU6-Hh，酶切产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带，并将与预期大小相符的目的片段进行回收；将ie-NecZ-poly (A)EcoRI酶切回收产物克隆到上述PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh的EcoRI酶切回收产物中，经过转化感受态，培养单菌落并鉴定后，得到重组转座质粒PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor0
3.根据权利要求1或2所述的重组转座载体PXL-BACI1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor的构建方法，其特征在于: 家蚕Hedgehog基因扩增引物为:
Hh-cDNA-F:cgcKgatccgcgATGAACCAGTGGCCGGGAGT
Hh-cDNA-R:cg￡aattccgTCGATATCTATACGATGCTGo
4.用于Hedgehog信号传导通路过表达研究的转基因家蚕细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将重组转座载体PXL-BACI1-ZsGFP-BmUe-Hh-Neolr质粒和Helper质粒按照1:1的质量比混匀，采用转染试剂lipofectamineTM2000转染家蚕细胞BmN，转染24小时后观察荧光蛋白的表达情况； 2)通过不同浓度的G418筛选培养基确定BmN对G418的敏感度，从而确定BmN细胞最佳筛选浓度为800 μ g/mL ； 3)将重组转座载体PXL-BACI1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor转染BmN细胞，培养24小时后加入G418，连续筛选一个月后可以看到阴性细胞已全部死亡，视野中全部为发出绿色荧光的阳性细胞；所得到的转基因细胞系既有抗G418能力，又能表达绿色荧光蛋白。
5.转基因细胞系中Hh信号通路及其靶基因AP2的表达情况，其特征在于包括以下步骤: 1)、在权利要求3所述的转基因家蚕细胞系中，Hh基因的表达水平极高，Smo,Ci和Fu的表达水平也随之升高，但是Ptch和Cos2的表达水平反而降低，这说明了在转基因细胞系中Hh基因得到极其有效的过表达，从而使Hh信号通路激活，Smo, Ci和Fu是Hh信号通路的正调控因子，表达激活，表达量增加，而Ptch和Cos2作为Hh信号通路的负调控因子，在此时表达受到抑制，表达量降低； 2)、在权利要求3所述的转基因家蚕细胞系中，AP2基因的表达量也有明显降低，因为AP2是脂肪标记 蛋白，脂质伴侣，因此Hh信号通路抑制脂肪形成。
【文档编号】C12N5/10GK104031939SQ201410243657
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月31日 优先权日:2014年5月31日
【发明者】缪云根, 梁爽 申请人:浙江大学