一种水培液中微生物基因组dna的提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种水培液中微生物基因组DNA的提取方法，属于生物【技术领域】。本发明的提取方法先将水培液中的杂质通过定性滤纸进行过滤去除，进一步0.22μm的滤膜收集水体微生物，用液氮/65℃水浴的冻融方法破碎微生物细胞，再加入SDS及溶菌酶裂解细胞，CTAB结合蛋白质及多聚糖、游离核酸，加入酚、氯仿混合物萃取后，萃取液用异丙醇沉淀，最终获得水体微生物基因组DNA。利用该方法提取的核酸纯度较高，且产量较高。试验证明，此法提取的水体微生物DNA，完整性好，纯度较高，进一步纯化后可用于下游的基因组文库构建、qPCR、高通量测序等。
【专利说明】一种水培液中微生物基因组DNA的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水培液中微生物基因组DNA的提取方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 水培种植法作为无土栽培的重要形式，具有节肥、节水、省工、省药、高产、优质、洁 净等优点。由于其不受时间限制，可供植物利用的营养充分、均匀等优点，因而在现代农业 设施生产过程中逐渐被大范围采用。在这些水培种植系统中，微生物也广泛存在于水培液 中，这些微生物能够对溶液中的矿质营养元素以及植物根系释放的次生物质进行转化，在 植物与矿质养分之间起到了重要的媒介作用，因而是水培种植条件下，植物能够正常生长 发育的重要因子。因此，研究水培液中微生物的结构组成与数量分布，能够为优化植物的最 佳水培种植条件提供重要基础。然而，由于传统的微生物研究方法存在着无法获得环境中 全部微生物的限制因素，由此导致对相应环境中微生物遗传背景信息的了解也不全面，从 而也限制了水体微生物宏基因组信息的深入发掘。利用现代生物技术，如高通量测序技术， 以及基于PCR的末端限制性长度态性（T-RFLP)技术、单链构型多态性（SSCP)、变性/温度 梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE)技术，长度多态性（AFLP)技术则克服了传统培养方法所造成的 土壤微生物信息大量丢失的弊端，更加全面、精确地揭示出水体微生物群落结构和功能的 多样性。
[0003] 对于此，如何简便快捷地从水培液中获得微生物的DNA是深入研究水培液中微生 物组成的关键，由于水培液的相对体积大，微生物分布分散，直接提取往往会因为样品初始 体积、微生物数量低而导致提取效率低下，因此需要研制适用于水体微生物DNA提取的方 便、快捷、实用的方法，解决使用常规方法所获得的微生物总量少、细胞裂解率低、DNA产量 低的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种水培液中微生物基因组DNA的提取方法，利用该方法提取的核酸 纯度较高，且产量较高。
[0005] -种水培液微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤： (1) 水体样品杂质的去除：取l〇(T250ml的水培液用定性滤纸过滤:Γ5次，并收集滤 液；进一步用孔径为〇. 22 μ m的滤膜进行超滤，通过滤膜收集水体中的菌体，剪碎滤膜并置 于10ml的离心管中； (2) 水体微生物细胞裂解：往步骤（l)10ml的离心管中加入500 μ 1无菌水，漩涡震荡， 然后在液氮2?3 min和65°C水浴5min中反复冻融:Γ5次，冻融结束后，于4°C 13000rpm 下离心lOmin，弃上清，收集沉淀，加入ΙΟΟμΙ 1XTE，重悬沉淀，加入30μ1 50mg/ml的溶 菌酶，37°C温浴1?3h，再加入500 μ 1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C温浴 T2h ； (3) 核酸游离及沉淀：步骤（2)温浴结束后加入200 μ 1 5M的NaCl，加入100 μ 1 65°C 预热的3XCTAB/NaCl，65°C温浴lh，待冷却后，加入等体积的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的体 积比为（1:1)，4°C llOOOrpm离心lOmin，取上清，再加入等体积的酚、氯仿混合液，酚、氯 仿的体积比为（1:1)，4°C llOOOrpm离心lOmin，将上清移至新管并加入等体积预冷的异 丙醇，-20°C放置lh，然后4°C llOOOrpm离心20min，弃上清，沉淀用70%乙醇重悬并于 4°C llOOOrpm下离心lOmin，弃上清，沉淀于超净工作台中吹干后溶于3(T50ul的无菌水 中，-80°C保存。
[0006] 所述水培液微生物基因组DNA的提取方法，优选的步骤如下： (1)水体样品杂质的去除：取l〇〇ml的水溶液用定性滤纸重复过滤3次，以去除水体中 含有的杂质，并收集滤液；进一步用孔径为〇. 22 μ m的滤膜进行超滤，通过滤膜收集水体中 的菌体，剪碎滤膜并置于l〇ml的离心管中。
[0007] 水体微生物细胞裂解：往离心管中加入500 μ 1无菌水，漩涡震荡，液氮冻2min后 置于65°C水浴锅中温浴5min，如此反复冻融3次。冻融结束后，样品于4°C 13000rpm下离 心10min，弃上清，收集沉淀。加入100μ1 1XTE，重悬沉淀。加入30μ1 50mg/ml的溶菌 酶，37°C温浴lh。加入500μ 1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C温浴lh。
[0008] 核酸游离及沉淀：加入200μ 1 5M的NaCl，加入100μ 1 65°C预热的3XCTAB/ NaCl，65°C温浴lh。待冷却后，加入等体积酚氯仿，酚、氯仿的体积比为（1:1)，4°C llOOOrpm离心10min，取上清，再加入等体积的酚氯仿，4°C llOOOrpm离心10min，将上清 移至新管。加入等体积的预冷异丙醇，_20°C放置lh，4°C llOOOrpm离心20min，弃上清。 沉淀用70%乙醇于4°C llOOOrpm下离心10min，弃上清，沉淀于超净工作台中吹干后溶于 30ul的无菌水中。
[0009] 本发明的提取方法先将水培液中的杂质通过定性滤纸进行过滤去除，进一步 0. 22 μ m的滤膜收集水体微生物，用液氮/65°C水浴的冻融方法破碎微生物细胞，再加入 SDS及溶菌酶裂解细胞，CTAB结合蛋白质及多聚糖、游离核酸，加入酚、氯仿混合物萃取后， 萃取液用异丙醇沉淀，最终获得水体微生物基因组DNA。所得的核酸的纯度可达1.758,浓 度达15. 3 μ g/ μ 1。对提取的DNA进行纯化，可进行16srDNA的扩增和荧光定量PCR分析， 结果见图3、4、5,证实本发明的方法提取水体微生物DNA的有效性。反复试验证明，此法提 取的水体微生物DNA，完整性好，纯度较高，进一步纯化后可用于下游的基因组文库构建、 qPCR、高通量测序等。
[0010] 本发明的显著优点： 1.适合于不同来源的水培液以及水体，具有广谱适用性。
[0011] 2.所得的DNA完整性好、纯度较高。
[0012] 3.提取便捷、无需复杂的处理工艺，提取的条件不严格。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为不同水稻水培液中微生物DNA的电泳检测结果，其中1-4泳道为水稻品种 Lemont水培液中的微生物DNA; 5-8为水稻品种PI312777水培液中的微生物DNA。
[0014] 图2为稗草水培液中水体微生物DNA的电泳检测结果，其中1-3泳道为稗草的酚 酸水培液中的微生物DNA; 4-6为稗草的萜类水培液中的微生物DNA。
[0015] 图3为以水培液微生物DNA为模板进行16srDNA的PCR扩增产物电泳检测结果， 其中1表示以水稻品种Lemont水培液中的微生物DNA为模板的PCR扩增产物，2表示以水稻 品种PI312777水培液中的微生物DNA为模板的PCR扩增产物，3表示lOObp DNA Marker， 4表示以稗草Lemont水培液中的微生物DNA为模板的PCR扩增产物。
[0016] 图4为以水稻水培液微生物DNA为模板进行16srDNA的定量PCR检测结果。
[0017] 图4 (1)表示定量PCR的扩增曲线。
[0018] 图4 (2)表示定量PCR的熔解曲线。
[0019] 图5为以水稻水培液微生物DNA为模板进行ITS的定量PCR检测结果。
[0020] 图5 (1)表示定量PCR的扩增曲线。
[0021] 图5 (2)表示定量PCR的熔解曲线。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1 本发明的水培液微生物基因组DNA的提取方法，具体步骤如下： (1) 原料：水稻的水培液，来自福建福州(福建农林大学教学农场）； (2) 水体样品杂质的去除：取100ml的水稻水溶液用定性滤纸进行过滤，以去除水体中 含有的杂质，重复过滤3次，收集滤液；进一步用孔径为0. 22 μ m的滤膜进行超滤，通过滤膜 收集水体中的菌体，剪碎滤膜并置于l〇ml的离心管中，用于提取基因组DNA。
[0023] ⑶水体微生物细胞裂解：往离心管中加入500 μ 1无菌水，漩涡震荡，液氮冻2min 后置于65°C水浴锅中温浴5min，如此反复冻融3次。冻融结束后，样品于4°C 13000rpm下 离心lOmin，弃上清，收集沉淀。加入ΙΟΟμΙ 1XTE，重悬沉淀。加入30μ1 50mg/ml的溶 菌酶，37°C温浴lh。加入500μ 1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C温浴lh。
[0024] (4)核酸游离及沉淀：加入200 μ 1 5M的NaCl，加入100 μ 1 65°C预热的CTAB/ NaCl(3X)，65°C温浴lh。待冷却后，加入等体积酚氯仿，4°C llOOOrpm离心10min，取上 清，再加入等体积的酚氯仿，4°C llOOOrpm离心10min，将上清移至新管。加入等体积的 预冷异丙醇，-2〇°C放置lh，4°C llOOOrpm离心20min，弃上清。沉淀用70%乙醇于4°C llOOOrpm下离心10min，弃上清，沉淀于超净工作台中吹干后溶于30ul的无菌水中。取 5μ1 DNA水溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。检测结果见图1，其中1-4泳道均为水稻 品种Lemont水培液中的微生物DNA; 5-8均为水稻品种ΡΙ312777水培液中的微生物DNA， 从图中可见各个泳道中的DNA条带清晰，条带亮度，泳道中的杂质背景淡，重复性好，提取 效果佳。以此DNA模板，利用qPCR对细菌、真菌的数量进行检测，其中细菌16srDNA的qPCR 扩增曲线见图4(1)，图中A箭头指示以水稻品种PI312777水培液DNA为模板进行qPCR的 扩增曲线，B箭头指示以水稻品种Lemont水培液DNA为模板进行qPCR的扩增曲线，两种 DNA模板的扩增过程中CT值重复性好。图4(2)表示细菌16srDNA熔解曲线，箭头C指示 16srDNA熔解曲线形成的峰。真菌ITS的qPCR扩增曲线见图5(1)，图中D箭头指示以水 稻品种PI312777水培液DNA为模板进行qPCR的扩增曲线，E箭头指示以水稻品种Lemont 水培液DNA为模板进行qPCR的扩增曲线，两种DNA模板的扩增过程中CT值重复性好。图 5(2)表示细菌ITS熔解曲线，箭头F指示ITS熔解曲线形成的峰。从图中可以看出各熔解 曲线主峰单一，并明显高于基线。上述试验结果表明运用此方法提取得到的DNA能够用于 下游的试验，进一步对水培液中的微生物数量进行计算，结果显示每毫升PI312777水培液 中约有细菌1200个，真菌1465个；每毫升Lemont水培液中约有细菌490个，真菌190个。
[0025] 实施例2 (1) 原料：稗草的水培液，来自福建福州(福建农林大学教学农场）； (2) 水体样品杂质的去除：取100ml的稗草水溶液用定性滤纸进行过滤，以去除水体中 含有的杂质，重复过滤3次，收集滤液；进一步用孔径为0. 22 μ m的滤膜进行超滤，通过滤膜 收集水体中的菌体，剪碎滤膜并置于l〇ml的离心管中，用于提取基因组DNA。
[0026] ⑶水体微生物细胞裂解：往离心管中加入500 μ 1无菌水，漩涡震荡，液氮冻2min 后置于65°C水浴锅中温浴5min，如此反复冻融3次。冻融结束后，样品于4°C 13000rpm下 离心lOmin，弃上清，收集沉淀。加入ΙΟΟμΙ 1XTE，重悬沉淀。加入30μ1 50mg/ml的溶 菌酶，37°C温浴lh。加入500μ 1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C温浴lh。
[0027] (4)核酸游离及沉淀：加入200 μ 1 5M的NaCl，加入100 μ 1 65°C预热的CTAB/ NaCl(3X)，65°C温浴lh。待冷却后，加入等体积酚氯仿，4°C llOOOrpm离心10min，取上 清，再加入等体积的酚氯仿，4°C llOOOrpm离心10min，将上清移至新管。加入等体积的 预冷异丙醇，-2〇°C放置lh，4°C llOOOrpm离心20min，弃上清。沉淀用70%乙醇于4°C llOOOrpm下离心10min，弃上清，沉淀于超净工作台中吹干后溶于30ul的无菌水中。取 5 μ 1 DNA水溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。检测结果见图2,其中1-3泳道为稗草的酚 酸水培液中的微生物DNA; 4-6为稗草的萜类水培液中的微生物DNA，从图中可见DNA的条 带清晰，条带亮度，泳道中的杂质背景淡，重复性好，提取效果佳。以此DNA模板，利用qPCR 对其中粘细菌的数量进行检测，结果显示稗草的酚酸水培液中每毫升最高含有粘细菌800 个，稗草的萜类水培液中每毫升最高含有粘细菌260个。
[0028] 此外，分别以实例1、实例2中的水稻品种PI312777、Lemont以及稗草水培液中微 生物的DNA为模板进行细菌16srDNA的PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果如 图3,其中泳道1是以水稻品种Lemont水培液中的微生物DNA为模板的PCR扩增产物，泳道 2是以水稻品种PI312777水培液中的微生物DNA为模板的PCR扩增产物，泳道是4以稗草 Lemont水培液中的微生物DNA为模板的PCR扩增产物，从图中可以看出16srDNA条带清晰， 亮度高，此结果再次说明了运用此方法提取得到的DNA能够用于下游的试验。
【权利要求】
1. 一种水培液中微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述方法具体包括以下 步骤： (1) 水体样品杂质的去除：取l〇(T250ml的水培液用定性滤纸过滤:Γ5次，并收集滤 液；进一步用孔径为〇. 22 μ m的滤膜进行超滤，通过滤膜收集水体中的菌体，剪碎滤膜并置 于10ml的离心管中； (2) 水体微生物细胞裂解：往步骤（l)10ml的离心管中加入500 μ 1无菌水，漩涡震荡， 然后在液氮2?3 min和65°C水浴5min中反复冻融:Γ5次，冻融结束后，于4°C 13000rpm 下离心lOmin，弃上清，收集沉淀，加入ΙΟΟμΙ 1XTE，重悬沉淀，加入30μ1 50mg/ml的溶 菌酶，37°C温浴1?3h，再加入500μ1的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37°C温浴 T2h ； (3) 核酸游离及沉淀：步骤（2)温浴结束后加入200 μ 1 5M的NaCl，加入100 μ 1 65°C 预热的3XCTAB/NaCl，65°C温浴lh，待冷却后，加入等体积的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的体 积比为（1:1)，4°C llOOOrpm离心10min，取上清，再加入等体积的酚、氯仿混合液，酚、氯 仿的体积比为（1:1)，4°C llOOOrpm离心10min，将上清移至新管并加入等体积预冷的异 丙醇，-20°C放置lh，然后4°C llOOOrpm离心20min，弃上清，沉淀用70%乙醇重悬并于 4°C llOOOrpm下离心10min，弃上清，沉淀于超净工作台中吹干后溶于3(T50ul的无菌水 中，-80°C保存。
【文档编号】C12N15/10GK104087573SQ201410270513
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】方长旬, 林文雄, 李程勋, 李颖哲, 林威鹏 申请人:福建农林大学