TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法
【专利摘要】本发明提供一种TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法，选取杆菌样巴尔通体特异的一段基因序列，基于该特异基因序列，设计PCR引物与TaqMan探针，并建立了杆菌样巴尔通体的实时荧光探针定量PCR检测方法。该方法具有很好的特异性和稳定性，能够满足一般临床样品要求，不会出现假阳性反应。所设计的探针具有极高的敏感性，最低检测限可达到每个PCR反应检出3个拷贝的目的基因。本发明建立的实时荧光探针定量PCR方法可为杆菌样巴尔通体引起一系列疾病的早期临床诊断、疾病监测和筛查以及流行病学调查提供一种高效的实验室检测手段。
【专利说明】TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种TaqMan实时荧光定量PCR 检测杆菌样巴尔通体的方法。 【背景技术】
[0002] 早在1905年，秘鲁的微生物学家艾尔伯特?巴顿（Alberto Barton)在红细胞 中发现人类巴尔通体病（Bartonellosis)的致病因子，此病又称为卡瑞恩病（Carrion's disease)，急性期为奥罗亚热（Oroya fever)，慢性期为秘鲁抚（Verruga Peruana或 Peruvian Wart)。1919 年，泰勒马克?巴蒂斯梯尼（Tel6maco S.Battistini)和野口英 世（Hideyo Noguchi)分离出该病原体，他们为纪念巴顿医生首次发现这种微生物，将其 命名为杆菌样巴尔通体（B. bacilliformis，Bb)。这种细菌主要分布在秘鲁、哥伦比亚和 厄瓜多尔等南美安第斯山脉地区，人是唯一的宿主，主要通过当地的一种白蛉（Lutzomyia verrucarum)传播。这种白蛉只栖息于安第斯山麓的丘陵地区，该生境被称为"抚症地带 (verruga zone) ",卡瑞恩病与这种传播媒介地理分布一致，为一种地方性流行病。近年来 报道在秘鲁乌鲁班巴（Urubama)地区发生一起卡瑞恩病暴发流行，并没有在所谓的"疣症 地带"且Lutzomyia verrucarum也不是当地白蛉的优势种，此外传播该疾病的媒介据报道 还有sandfly和另外一种白蛉（Lutzomyia columbiana)，由此推测可能还存在其他传播媒 介或未知的传播方式。因此，带菌人群的流动及非疫区适宜传播媒介的孳生都可能会引起 此病的暴发流行。与当地人群相比，外来人群对此病易感且病情更为严重，随着南美旅游热 度的增加，特别是前往此病流行区的游客将成为高危人群。对于Bb引起的卡瑞恩病，及早 的诊断治疗可以显著降低病死率。此外，到流行区旅游，适当个人防护对避免白蛉叮咬十 分重要。
[0003] 目前，对此菌检测方法主要是分离培养、血清学检测和常规PCR检测。Bb生长缓 慢、营养条件要求苛刻而难于分离培养，判断结果时只靠肉眼观察，没有足够可靠依据，降 低实验的准确性。血清学检测通常用ELISA和IFA法检测巴尔通体抗体，有些种如汉赛巴尔 通体（B. henselae)和五日热巴尔通体（B. quintana)有市售的检测试剂盒，对于Bb国外仅 有个别实验室能够进行，此外IFA法判读有一定的主观性，灵敏度不高。常规PCR虽然避免 了上述两类方法的缺陷，但是存在引物结合缺乏特异性、实验室污染和临床样品中PCR抑 制物存在造成假阴性等问题，限制了在临床诊断上的推广应用。探针法实时荧光PCR技术 依据序列特异性探针区别物种，增加了实验特异性和敏感性，结果准确率提高，能够很好地 解决上述问题，在传染病病原检测上日渐普及。Bb引起的疾病严重影响人类健康，急性期病 死率高，慢性期可造成毁容，给病人带来身心痛苦，造成社会卫生经济负担。近年来，我国与 南美洲国家交往日益加深，贸易往来及工程合作方兴未艾，加之国内赴南美旅游不断升温， 使得我国此病的高危人群不断增加，输入病例的可能性越来越大，因此，有必要建立一种特 异性强、灵敏度高、稳定性好的方法，能够快速准确地检测Bb，以辅助临床实验室诊断。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明选取杆菌样巴尔通体特有的一段未知功能的基因 (BARBAKC583_1366)为目标序列，设计特异性PCR引物和探针，利用TaqMan探针技术建立检 测该菌的实时荧光定量PCR方法。
[0006] 本发明提供用于检测杆菌样巴尔通体的TaqMan实时荧光定量PCR引物及探针，
[0007] 所述引物包括：
[0008] 上游引物 Bb2F :5' -CAATTATCATCATTATTTGCTCCTGG-3'
[0009] 下游引物 Bb2R :5，-TACTGCTGAGGTTGGGCGA-3，
[0010] 所述探针为：
[0011] 探针 BbT : 5 ' -F-AGAAGACGATCCGTTACAT-Q-3 '
[0012] 其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
[0013] 优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为MGB。
[0014] 本发明还提供含有上述引物及探针的用于TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样 巴尔通体的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg 2+、PCR反应缓冲液等中的 一种或多种。
[0015] 优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0016] 本发明还提供TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法，其是利用引 物Bb2F和Bb2R及探针BbT，或所述试剂盒对杆菌样巴尔通体进行TaqMan实时荧光定量PCR 检测。
[〇〇17] 前述方法包括以下步骤：
[0018] 1)提取样品组织中的总DNA ;
[0019] 2)以步骤1)中的总DNA为模板，Bb2F和Bb2R为引物，BbT为探针，进行PCR扩增 反应；
[0020] 3)分析PCR产物。
[0021] 其中，PCR反应体系以20 μ 1计为：
[0022]
[0023]
【权利要求】
1. 用于检测杆菌样巴尔通体的TaqMan实时荧光定量PCR引物及探针，其特征在于， 所述引物包括： 上游引物 Bb2F :5' -CAATTATCATCATTATTTGCTCCTGG-3' 下游引物 Bb2R : 5' -TACTGCTGAGGTTGGGCGA-3' 所述探针为： 探针 BbT : 5，-F-AGAAGACGATCCGTTACAT-Q-3， 其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
2. 根据权利要求1所述的引物及探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧 光淬灭基团为MGB。
3. 含有权利要求1所述引物及探针的用于TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔 通体的试剂盒。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
5. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。 6. TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法，其是利用权利要求1或2所 述引物及探针，或权利要求3-5任一项所述试剂盒对杆菌样巴尔通体进行TaqMan实时荧光 定量PCR检测。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取样品组织中的总DNA; 2) 以步骤1)中的总DNA为模板，Bb2F和Bb2R为引物，BbT为探针，进行PCR扩增反 应； 3) 分析PCR产物。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20 μ 1计为：
9. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95°C 2分钟，单个循 环；95°C 3秒，60°C 3秒，共40个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK104087661SQ201410270487
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】栗冬梅, 刘云彦, 杜鹏程, 宋秀平, 刘起勇 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所