一种利用氢气提高白桦细胞中总三萜和白桦脂醇含量的方法
【专利摘要】本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用氢气提高白桦细胞中总三萜和白桦脂醇含量的方法。以白桦悬浮细胞为材料，按50g/L接种量接种于100mL?B5液体培养基中，附加0.1～0.3mg/L6-BA和0.5～4.0mg/L?TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白1g/L，pH5.5～6.0。在细胞悬浮培养第8天通入氢气使其终浓度为0.5-1.5mmol/L，培养12h后收获，白桦脂醇含量最高为1.11mg/gDW，是对照组185.1％。培养24h后收获，细胞内总三萜含量达到24.37mg/gDW，为对照组的181.32％。氢气具有无毒无害的优势，方便代谢产物的分离和纯化。该发明为解决天然植物药物来源紧缺和工业化大规模生产白桦三萜和白桦脂醇药物提供了一种新途径。
【专利说明】一种利用氢气提高白桦细胞中总三萜和白桦脂醇含量的方 法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及氢气促进次生代谢物的合成，它属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】：
[0002] 氢是自然界广泛存在且分子结构最简单的元素，宇宙中90%的成分是由氢组成 的。氢气是无色、无嗅、无味、具有一定还原性的双原子气体。在潜水医学领域，氢气被广泛 应用于高深入的氢氧混合潜水过程中。氢气的溶解度比较低，且不能被机体大量吸收，所 以，人们一直没有重视氢在高等生物体内的作用。氢气的还原性是氢气最重要的化学性质， 我们在中学就学习过，氢气可以还原加热氧化铜为铜。但是许多人并不知道，氢气还具有独 特的生物学特征，过去生物学领域一直认为氢气属于生理性惰性气体，认为氢气是没有任 何生物学效应的气体。但是自2007年国际著名杂志《Nature Medicine》报道，氢气具有神 奇的选择性抗氧化作用，患者只需要呼吸35min浓度为2%的氢气，就可以非常有效地治疗 脑缺血再灌注损伤。呼吸氢气也可以治疗新生儿脑缺血缺氧后脑病。随后，氢气在植物学、 基础医学和临床转化研究方面成为新的研究热点。认为氢气的巨大应用潜力还没有真正得 到认识。
[0003] 到目前为止，国际上关于氢气生物医学的研究论文已经接近500篇，平均2天就增 加1篇。由于氢气在医学上没有可以借鉴的领域，作为一种治疗性气体，目前最有效的方式 是通过饮用氢气饱和水，临床应用可以通过呼吸氢气氧气混合气体和注射氢气饱和溶液。
[0004] 实验表明氢水，h2吸入，和腹膜内、静脉内注射氢的饱和盐水对活性氧引起的疾病 都具有保护作用。这些研究中所积累的证据表明，H 2可以保护各种细胞，组织和器官免受氧 化损伤。在细菌和藻类中H2的代谢已经进行了许多调查。一些早期的研究表明在一些高 等植物中H 2演变和吸收发光的树叶和假设存在的氢化酶。然而，在高等植物中很少有研究 审查制氢的生理作用和支持这一进程的机制。
[0005] 近年来，利用植物离体培养技术生产有用次生代谢物质的研究取得了很大的进 展，如紫草细胞生产紫草素、人参细胞培养生产皂甙、洋地黄细胞培养生产生物碱等都达到 工业化的生产规模，用长春花细胞培养生产抗癌生物碱已经达到了中试水平（刘春朝等， 1997 ;胡立勇，2004)。然而次生代谢产物的低产现象是制约细胞培养植物天然产物技术 产业化应用的核心问题之一，理解和掌握植物细胞次生代谢调控规律是解决这一问题的基 础。虽然，国内外研究者针对植物培养细胞中次生代谢物低产问题进行了研究，包括优质细 胞系的选育、培养条件的优化、培养技术改进以及活性物质合成关键酶基因的克隆等（郭 肖红等，2005 ;徐茂军，2009 ;钱丹丹等，2011)。但到目前为止，植物细胞中次生代谢物的低 产问题仍未得到很好的解决。
[0006] 白桦（Betula platyphylla suk)树叶和树皮中含有重要的次生代谢产物白 桦三萜（TBP)，主要类型包括羽扇豆烷型、达玛烷型、齐墩果烷型三萜物质（Zhang，2003)， 是极具开发潜力的抗癌、治疗心血管疾病、护肝的先锋药物（李薇，2000 ;叶银英，2000， 2001)。与初生代谢相比，植物次生代谢具有非常强的可调控性。针对植物培养细胞中天然 活性物质的低产问题，国内外研究者进行了大量的研究探索。研究探讨植物细胞中与次生 代谢产物合成有关的机制不但有助于掌握植物次生代谢的调控规律而且对生产实践中解 决植物培养细胞次生产物低产问题具有重要意义。针对能促进白桦三萜合成的作用，研究 其调控白桦悬浮培养细胞中三萜合成的分子机制，重点探讨H 2诱导对三萜合成的影响等， 建立氢气调控白桦三萜合成的技术体系，为解决植物细胞培养生产次生代谢物中低产的问 题提供可靠而稳定的技术。
[0007] 本发明的内容：
[0008] 为保护白桦自然资源，建立可持续开发利用的资源生产程序，利用无毒无害的氢 气诱导来自白桦诱导的愈伤组织和悬浮培养细胞，进行总三萜和白桦脂醇的合成与生产， 同时利用高效液相色谱法进行定量检测。为进行工业化法大规模生产总三萜和白桦脂醇类 药物的提供了新方法。
[0009] 实施方案：
[0010] (1)悬浮细胞的培养
[0011] 在超净工作台上，切下腋芽，用70%酒精浸泡5min，再用5%的次氯酸钠溶液消毒 10-20min，然后放于已灭菌的培养皿中，接种到预先经过高温高压灭菌的各种组合的培养 基上（NT+L Omg/L水解酪蛋白+3%蔗糖+0· 5?4 Omg/LBA，(λ 2?4 Omg/L NAA)进行愈伤 组织的诱导。每瓶接种大约3-5个腋芽。先用暗培养一周后进行光培养。培养约7周后， 获得愈伤组织。愈伤组织经过继代培养后，迅速增殖。
[0012] 选择细胞生长速度快，松散且总三萜物质含量高的愈伤组织，进行继代和悬浮培 养。并在有利于白桦悬浮细胞生长和次生代谢产物积累的B5+0. 1?0. 3mg/L6-BA+0. 5? 4. Omg/LTDZ悬浮培养基中培养细胞系。获得高产白桦三萜和白桦脂醇悬浮细胞系，经过滤， 烘干，粉碎，有机溶剂（95%乙醇）提取步骤，利用液相色谱方法对白桦酯醇和白桦脂醇检 测和定量分析。
[0013] ⑵白桦酯醇的提取和测定
[0014] 白桦酯醇的提取和测定采用范桂枝等2007,张泽等2004的方法。提取试剂：95% 乙醇；提取方法：超声波提取法；测定方法：高效液相色谱法，检测波长210nm，流动相为 乙腈和水（V:V = 8:2)，流速 1. OmL/min。
[0015] 本专利具有以下特点：
[0016] 1)氢气处理具有无毒无害的优势，同时生产环境不受地域、季节、水质、病虫害、气 候等自然环境的影响。
[0017] 2)生产周期短，生产过程不产生大量废渣废水，安全无污染，具有生态效益。
[0018] 3)培养的白桦悬浮细胞具有生产白桦三萜和白桦脂醇等多种物质的能力，实现了 白桦天然植物资源及其药用成分的开发利用。
[0019] 4)利用高效液相色谱方法进行白桦脂醇进行检测，方法简单，提取溶剂清洁无毒， 操作方便。
[0020] 5)为解决抗艾滋病和抗肿瘤天然药物来源紧缺，加速临床大规模应用，提供一种 新途径，具有很高的经济效益和社会效益。
【具体实施方式】
[0021] 1)植物材料来源
[0022] 白桦取自东北林业大学白桦强化种子园内的优树。选择腋芽，消毒后接种到预 先经过高温高压灭菌的各种组合的培养基上（NT+1. Omg/L水解酪蛋白+3 %蔗糖+0. 5? 4. Omg/LBA，0. 2?4. Omg/L NAA)进行愈伤组织的诱导。愈伤组织经过继代培养后，迅速增 殖。挑选生长状态良好的愈伤组织将其多次继代后转移至液体培养基悬浮培养。经过6代 以上的转接，建立稳定的悬浮培养细胞体系，悬浮培养继代周期为15d，接种量为5g细胞于 100mL液体培养基中。2)培养条件
[0023] 以白桦悬浮细胞为实验材料，按50g/L接种量接种于100mL B5液体培养基中，培 养条件为：120印111，251：，光照强度200(^，光周期1611，湿度40%?50%，培养周期为10(1。 培养基成分为B5基本培养基，附加激素及浓度为0. 0. 1-0. 3mg/L6-BA和0. 5-4mg/L TDZ，蔗 糖20g/L，酸水解酪蛋白lg/L，pH5. 5?6. 0,121°C高温高压灭菌20min。
[0024] 3)富氢水的制备添加
[0025] 将SHC型氢气发生器（购自山东塞克塞斯氢能源有限公司）的氢气输出口插入已 灭菌蒸馏水中半个小时，蒸馏水即变为99. 99%的富氢水，在白桦悬浮细胞培养至第8天时 添加入培养基中，终浓度分别为〇. 5-1. 5mmol/L，添加后12至24h收获细胞。
[0026] 4)总三萜的提取及含量测定
[0027] 精密称取0.05g细胞干样，加入2ml95%乙醇并浸泡24h。70°C水浴lh后再超声 40min，取lOOyL上清液于10ml离心管中并置于70°C水浴蒸干。加入200μ?5%香草醛-冰 乙酸和800μ L高氯酸，70°C水浴15min，冰上迅速冷却。乙酸乙酯定容至5ml后测定其在 551nm的吸光值（对照组为200 μ L5%香草醛-冰乙酸+800微升高氯酸+4ml乙酸乙酯）。
[0028] 总三萜的标准曲线以齐墩果酸为标准品进行绘制，其回归方程为y = 45. 036x+0. 0417,，相关系数R2 = 0. 9983,齐墩果酸在0. 005?0. 025mg/mL含量范围内具 有良好的线性关系。
[0029] 5)白桦脂醇的提取及含量测定
[0030] 白桦脂醇的提取参照范桂枝等2007,张泽等2004的方法法，具体方法如下：精密 称取0. 5g细胞干样，加入25mL盐酸-乙醇溶液（2 : 8)，加热回流3h，放冷，摇匀并滤过， 精密量取续滤液15mL，加蒸馏水15mL，置于80°C水浴上蒸去乙醇，然后用乙醚萃取3次，每 次20mL，合并乙醚萃取液并于40°C低温蒸干，加 lml甲醇溶解残渣，并将其用0. 45 μ m有机 滤膜滤过，此为样品检测液，然后利用高效液相色谱进行检测。
[0031] 高效液相色谱（HPLC)检测条件：用Waters公司600-717-2487色谱系统，色谱 柱HiQ sil C18V4. 6_X250mm ;流动相为乙腈：水=9 :1 ;柱温25°C ;灵敏度16AUFS ;流速 1. OmL/min ;检测波长 210nm，进样 20uL。
[0032] 白桦脂醇线性关系考察：精密吸取浓度为0. 5mg/mL的白桦脂醇标准品溶液0. 2、 0.4、0.6、0.8、11^，分别置于511^容量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2(^1^ 进样，测定其峰面积积分值。以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。白 桦脂醇回归方程为：Y = 3E+06X-128674。结果表明，白桦脂醇在0. 2?lmg/ml范围内具有 良好的线性关系。
[0033] 本发明的效果：本发明利用氢气来促进细胞生产三萜的能力，获得的白桦总三萜 和白桦脂醇含量大大提高。由上述技术方案，以白桦悬浮细胞为材料进行实验，其结果是： 氢气处理后，白桦脂醇含量最高为1. Ilmg/gDW，是对照组185. 1%。培养12-24h后收获，细 胞内总三萜含量达到24. 37mg/gDW，为对照组的181. 32%。因此，这是一种很有工业应用前 景的白桦总三萜和白桦脂醇的生产方法。
[0034] 附图1 :白桦固体愈伤组织
[0035] 附图2:白桦悬浮细胞
[0036] 附图3 :白桦脂醇标准品出峰图
[0037] 附图4 :H2处理白桦脂醇出峰图
[0038] 附图5 :总三萜含量测定的标准曲线（以齐墩果酸为标准品）
[0039] 附图6 :白桦脂醇含量测定的标准曲线。
【权利要求】
1. 本发明专利提出氢气促进白桦三萜合成技术为：以白桦悬浮细胞为实验材料，按 5〇g/L接种量接种于lOOmL B5液体培养基中，培养条件为：120rpm，25°C，光照强度20001x， 光周期16h，湿度40 %?50 %，培养周期为10d。培养基成分为B5基本培养基，附加激素 及浓度为〇. 1?〇. 3mg/L6-BA和0. 5?4. Omg/L TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白lg/L， pH5. 5?6. 0,121 °C高温高压灭菌20min。在细胞悬浮培养第8天加入富氢水使其终浓 度为0. 5-1. 5mmol/L，培养12至24h后收获，白桦脂醇含量最高为1. Ilmg/gDW，是对照组 185. 1%，细胞内总三萜含量达到24. 37mg/gDW，为对照组的181. 32%。
2. 根据权利要求书1所述的方法，其中的液体培养基为为B5基本培养基，附加激素及 浓度为〇· 1?〇· 3mg/L6-BA和0· 5?4. Omg/L TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白lg/L。
3. 根据权利要求书1所述的方法，其中的白桦细胞接种量为5g鲜细胞含50ml培养液 的100ml三角瓶中，摇床转速120r/min。
4. 根据权利要求书1所述的方法，其中富氢水是通过SHC型氢气发生器制备而得的，在 悬浮培养第八天加入，培养周期为10天，且富氢水的终浓度为〇. 5-1. 5mmol/L。
5. 根据权利要求书1所述的方法，其中的收获时间为富氢水添加12-24h后收获悬浮细 胞。
6. 根据权利要求书1所述的方法，其中氢气处理后白桦脂醇含量最高为1. Ilmg/gDW， 是对照组185. 1%。细胞内总三萜含量达到24. 37mg/gDW，为对照组的181. 32%。
【文档编号】C12P33/00GK104087644SQ201410270442
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】曾凡锁, 姜涛, 詹亚光, 辛颖, 孙丰坤, 齐凤慧, 范桂枝, 由香玲, 尹静 申请人:东北林业大学, 曾凡锁, 姜涛