一种通过分子改造前肽获得的高表达量脂肪酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明为一种通过分子改造前肽获得的高表达量脂肪酶基因及其应用，公开了一种高表达量的脂肪酶基因，其DNA序列如以下1)或2)所示；1)DNA序列为SEQ?ID?NO：2所示核苷酸序列；2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白质的DNA分子。本发明具体提供的截短后的脂肪酶基因，在巴斯德毕赤酵母中的表达量较亲本华根霉脂肪酶得到了提高，用于表达后，可显著提高时空产率。
【专利说明】一种通过分子改造前肽获得的高表达量脂肪酶基因及其应 用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种脂肪酶基因，特别是一种高表达量的脂肪酶基因，通过分子生物 学技术对脂肪酶基因序列进行改造获得，以实现脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达 的方法。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶（EC3. 1. 1. 3)不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯化、 酸解等反应，被广泛地应用于化学，食品，制药和洗涤剂或生物能源工业中。微生物是工业 脂肪酶的一个重要来源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今，已有超过30种根 霉脂肪酶实现了商品化生产。
[0003] 在脂肪酶试剂市场上，脂肪酶的工业生产量直接关系到市场竞争力。提高宿主 细胞中外源基因表达量的途径主要有两种，宿主菌方面：通过宿主菌的发酵优化、高产 菌株的诱变筛选以及蛋白酶缺陷表达菌株的构建等提商菌株对于外源蛋白的表达和分 泌；外源基因方面：通过启动子的选择、密码子优化、融合基因的构建、定向进化、基因剂 量的控制等方法提高外源基因的表达和分泌水平（Shu Zheng-Yu et al.J Mol Catal B:Enzym2010, 62(1):1-8) 〇
[0004] 很多蛋白质在体内是以前体的形式合成的，前肽是蛋白质N端的一段肽链，能够 辅助蛋白的折叠和加工，在蛋白质折叠成熟后，前肽则被相应的蛋白酶识别、切除。前肽的 功能主要分为两类，I类主要参与多肽链的延伸和正确折叠，如枯草杆菌素（Subtilisin)、 α水解蛋白酶（a Lytic protease)等；II类的功能主要参与蛋白在胞内的转运和 定位，并不直接参与蛋白质的折叠，如生长激素抑制素 Π (somatostatin II)、绿过氧 物酶（myeloperoxidase)等，在前肽中包含了蛋白质分选的信息，引导蛋白质的正确分 泌。另外，前肽对成熟蛋白质的稳定性、底物选择性等方面都有着影响。有文献报道，将 l，3-l，4-i3-D-葡聚糖酶的肽链C端截短后，其比活力提高了 4-5倍（Wen Tuan-Nan et al .Biochemistry, 2005. 44(25) :9197-9205.)。但通过截短5'端基因提高脂肪酶的表达量，目 前则无报道。
[0005] 发明人在前期研究中成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶 的华根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC M201021菌株，并从该菌株中首次克隆得到脂肪酶 基因序列，实现了该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)中的高水平分泌表达（Yu Xiao-Wei et al.J Mol Catal B:Enzym, 2009, 57:304_311)，并且通过构建组成型表达质 粒，实现了该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母的组成型分泌表达。本发明以华根霉脂肪酶基因为 模板，利用分子生物学技术对前肽序列进行剪切修饰，获得了表达量提高的脂肪酶基因。 [0006]定义：
[0007] 氨基酸和DNA核酸序列的命名法
[0008] 使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认 IUPAC命名法。
[0009] 脂肪酶基因的命名
[0010] 亲本脂肪酶基因命名为pr〇RCLC，5'端前肽序列截短后的脂肪酶基因分别为DFQ， TTG，NKS，DTE，mRCLC。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供一种高表达量的脂肪酶基因，其DNA序列如以下1)或2) 所示；
[0012] 1)DNA序列为SEQ ID N0 :2所示核苷酸序列；
[0013] 2)在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白质的 DNA分子。
[0014] 所述高表达量的脂肪酶基因通过逐级截短亲本脂肪酶前肽基因序列，从而获得在 毕赤酵母中表达量提商的脂肪酶基因序列。
[0015] 含有权利要求1所述脂肪酶基因的表达载体也为本发明要求保护的范围。
[0016] 所述表达载体优选分泌型载体。
[0017] 含有所述脂肪酶基因和/或表达载体的转基因细胞系/基因工程菌也为本发明要 求保护的范围。
[0018] 所述脂肪酶基因或表达载体在酶制剂生产中的应用也属于本发明的保护范围。
[0019] 本发明的技术方案：
[0020] 华根霉脂肪酶亲本基因序列为SEQ ID N0:1。
[0021] 脂肪酶表达量提高的截短基因，其特征在于对编码亲本华根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶的基因 （SEQ ID N0:1)上的N端前肽序列进行部分剪切， 获得表达量提高的截短基因 DFQ(SEQ ID N0:2)。
[0022] SEQ ID NO: 1
[0023] 华根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC M201021 脂肪酶亲本基因序列
[0024] gllcclgllg ctgglcaiaa aggttcagtc aaggcaacta atggcactga cttccaactc 60 cclcclcica tctctagccg tiglactcct ccttcccaic clgaaaccac aggtgaiccc 120 gaigccgaag cllacialai taacaagagc gtlcaatggl accaagctca cgglggcaac 180 iacacigcic Itatcaagcg tgatacigaa accgtcggig gtaigaccil ggaittgccc 240 gagaaccctc clcclaitcc igccacgtcc actgciccca gctctgatic aggigaagtt 300 gtcacagcca ctgctgcica aatcaaagag ctcactaact acgctgglgt tgctgctact 360 gcUacIgic giaglglcgl tccaggtacc aagigggacl gtaagcaaig ictcaaglat 420 giicclgalg gtaagcttat caagaccttc acllclcllc tcactgatac caaiggctu 480 alellgagaa gigatgctca aaagaccatc tatgttactt tccgtggtac taallcctlc 540 agaagcgcta ttactgacat ggtcllcacc ittactgatt atlctcctgt caagggcgcc 600 aaagtlcacg cigglllcci ttcclcatac aaccaagttg tcaaagaeta cttccccglc 660 glicaagacc aaltgaccgc Itaccctgac lataaggica tcgtcaccgg ccacictcic 720 gglgglgccc aagccllgct cgctggtatg gatctciacc aacgigaaaa gagaitaict 780 cceaagaact tgagcaicia lactgttggt igfccicglg icggiaacaa tgcattcgct 840 laclacgitg acagcaccgg aattccctic caccgtaccg tfcacaagcg tgatatcglc 900 cclcatgltc ctcclcaagc citcggtiat cllcaecccg glglcgaatc iiggalcaag 960 gaagacccig cigalgiica aalctgLacl iccaacatlg aaaccaaaca aigcagtaac 1020
[0025] ictatcgttc ctttcacctc tategctgat eaettaaeet actttggtat taacgaagga 1080 agelgutgtaa 1092
[0026] SEQ ID NO :2
[0027] 前肽序列截短的华根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶基因序列 DFQ
[0028] gacttccaac tccctcctct catctctagc cgttgtactc ctccttccca tcclgaaacc 60 acagglgaic ccgatgccga agcuaciat aiiaacaaga gcgitcaatg gtaccaagci 120 cacgglggca aciacaclgc tctlalcaag cglgalactg aaaccgicgg tggialgacc 1 80 llggailtgc ccgagaaccc iccicclait cctgccacgl ccaclgclcc cagclcigal 240 icaggtgaag ttgtcacagc cactgctgct caaalcaaag agctcactaa ctacgctggi 300 gitgctgcta ctgcttactg tcgtagtgic gllccaggta ceaaglggga ctglaagcaa 360 Iglclcaagi atgUcclga tggtaagctt atcaagacct icacllclct tctcactgal 420 accaalggct itaictlgag aagtgatgci caaaagacca icialgliac lllccglggt 480 actaattcct tcagaagcgc tattactgac atggtcttca cctttactga ttattctcct 540 glcaagggcg ccaaagtica cgctgglttc clttcclcal acaaccaagt tgicaaagac 600 lacllccccg Icgltcaaga ccaattgacc gcilaccctg aclalaaggt caicgtcacc 660 ggccaclclc tcggiggtgc ccaagccltg clcgctggla tggalcicta ccaacglgaa 720 aagagallal cicccaagaa cttgagcatc tatacigttg gu glee teg igtcggtaac 780 aalgealteg ctliictacgl Igacagcacc ggaaltccct iccaccglac cgllcacaag S40 cgigaiaicg iccctcatgt iccicclcaa gccttcggtt atcltcaccc cggtgicgaa 900 Iciiggalca aggaagaccc Igclgatgit caaaictgia ctlccaacal Igaaaccaaa 960 caatgcagla actclatcgi icclilcacc iciaiegeig atcacltaac ctactttggt 1 020 attaaegaag g a a g c t g1 l I g i a a 10 4 4
[0029] 本发明还公开了一种高效表达脂肪酶的方法，逐级截短亲本脂肪酶前肽基因序 列，将其克隆到表达载体后，转化宿主进行表达。
[0030] 用于表达所述脂肪酶的表达载体为pGAPKW，构建表达质粒pGAPKW-proRCLC所需 的质粒为pGAPK-proRCL (朱珊珊等.毕赤酵母组成型表达脂肪酶及其高通量筛选方法.微 生物学通报，2012.39(6):873-881.)和？？比91(11'〇1?(^(￥11乂丨3〇-^丨6七31.1]\1〇10&七 &1 B:Enzym, 2009, 57:304-311)〇
[0031] 用于所述的表达载体转化的微生物宿主细胞为巴斯德毕赤酵母。
[0032] 本发明的有益效果：运用分子生物学方法对华根霉脂肪酶亲本基因上的N端进行 部分剪切，提高了华根霉脂肪酶在巴斯德毕赤酵母中的表达量。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 为了详细描述本发明的结果，以相应的附图作为参考：
[0034] 图1巴斯德毕赤酵母表达质粒pGAPKW-proRCLC如图所示。
[0035] 图2脂肪酶产胞外酶活曲线。
[0036] 图3 SDS-PAGE电泳检测脂肪酶表达情况，37KD大小的条带为目标酶蛋白，条带 1 至 7 对应的表达质粒依次为：pGAPKW-proRCLC、pGAPKW-DFQ、pGAPKW-TTG、pGAPKW-NKS、 pGAPKW-DTE、pGAPKW-mRCLC、pGAPKW。
【具体实施方式】
[0037] 实施例中涉及到的培养基及试剂配方如下：
[0038] 10XYNB母液（w/v) :YNB(无氨基酸、无硫酸铵）13. 4%，过滤除菌，4°C保存；
[0039] LB 液体培养基（w/v) :Trypton 1 %，Yeast Extract 0· 5%，NaCl 1 %，ρΗ7· 0,
[0040] LB 固体培养基（w/v) :Trypton 1 %，Yeast Extract 0· 5 %，NaCl 1 %，ρΗ7· 0, Agar2%，氨节青霉素 50mg · mL-1，ρΗ7· 0 ;
[0041] YPD 培养基（w/v) :Yeast Extract 1 %, Trypton 2%, Dextrose 2%。若制作平 板，贝1J另加入Agar 2%。
[0042] MD 固体培养基（w/v) :Dextrose 2%，lXYNB，Agar 2%。用于筛选G418 抗性时加 入G418至终浓度为0· 25mg · ml/1，即YPD-G418平板。
[0043] 实施例1 :PCR方法构建表达脂肪酶的亲本基因组成型表达质粒。
[0044] (1)组成型启动子pGAP的获得：以质粒pGAPK-proRCL (朱珊珊等.毕赤酵母组成 型表达脂肪酶及其高通量筛选方法.微生物学通报，2012. 39(6) :873-881.)为模板，BF/ BWR为引物PCR扩增出pGAP和S片段（pGAP-S)，该片段不含Bglll酶切位点，上游含有 BamHI酶切位点，下游含有SnaBI酶切位点。引物BF和BWR序列如下：
[0045] BF ：5/ -CGGATCCGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCC-3 '(下划线为 BamHI 酶切 位点）
[0046] BWR ：5/ ~TTACGTAAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAGATACC3,(下划线为 SnaBI 酶切 位点）
[0047] (2)脂肪酶基因的获得：以质粒pPIC9K-proRCL(Yu Xiao-Wei et al. J Mol Catal B: Enzym, 2009, 57:304-311)为模板，50bpFNEW/ProRCLCR为引物PCR扩增出目的基因片段 proRCLC，该基因上游含有SnaBI酶切位点，下游含有His标签和Notl位点。
[0048] 引物和序列如下：
[0049] 50bpFNEW:5'-AAAGAAGAAGGGGTATCTCTC-3'
[0050] ProRCLCR: 5' AATTCCAGTGCGGCCGCTTA ATGATGATGATi ； AT( TG AGAAGAACCCAA ACAGCTTCCTTCGTTAATACC(下划线为Notl酶切位点，加粗部分为His标签）
[0051] (3)组成型表达质粒的构建：BamHI和SnaBI双酶切片段pGAP-S，SnaBI和Notl双 酶切基因 proRCLC，BamHI和Notl双酶切载体pGAPK-proRCL并回收大片段，连接上述3个 片段构建成表达质粒pGAPKW-proRCLC。
[0052] (4)空白对照载体pGAPKW的构建：proRCLC上游和基因中分别含有一个EcoRI位 点，将质粒pGAPK-proRCL用EcoRI进行酶切、自连接后构成pGAPKW。
[0053] 实施例2 :PCR方法构建表达截短脂肪酶基因的组成型表达质粒。
[0054] 表达亲本脂肪酶基因的质粒pGAPKW-proRCLC如图1所示。华根霉脂肪酶前肽基 因序列编码的94个氨基酸序列。结构预测表明氨基酸D17位至E35位为α螺旋结构，该 结构可能对前肽发挥分子伴侣功能具有重要作用，截去Ν端16个氨基酸（DFQ)考察前16 个氨基酸对前肽功能的影响；截去Ν端36个氨基酸（TTG)考察α螺旋结构对前肽功能的 影响；氨基酸Ν48位是前肽上的预测糖基化位点之一，截去Ν端47个氨基酸（NKS)考察该 位点对前肽功能的影响；K66R67为Kex2蛋白酶切位点，截去Ν端67个氨基酸（DTE)考察 受宿主细胞加工剪切掉的67个氨基酸链对前肽功能的影响；完全截去前肽（mRCLC)则考察 整段前肽的作用。
[0055] 以pGAPKW-proRCLC为模板，根据proRCLC基因上前肽序列的不同部位，设计5条 上游引物（下划线为SnaBI酶切位点）和1条下游引物。
[0056] DFQ F ：5/ -CATATGTACGTAGACTTCCAACTCCCTCCTCT-3 ;
[0057] TTG F ：5/ -CATATGTACGTAACCACAGGTGATCCCGATG-3 ;
[0058] NKS F：5/ -CATATGTACGTAAACAAGAGCGTTCAATGGTAC-3 ;
[0059] DTE F ：5/ -CATATGTACGTAGATACTGAAACCGTCGG-3 ;
[0060] MRCLC F ：5/ -CATATGTACGTATCTGATTCAGGTGAAGTTGTC-3;
[0061] 50bpRNEW : 5，-CCCAACTTGAACTGAGGAAC-3 '
[0062] 以DFQ F和50bpRNEW为一对引物，PCR扩增出前肽序列截短后的脂肪酶基因片段 DFQ。
[0063] 片段DFQ PCR体系
[0064]
【权利要求】
1. 一种高表达量的脂肪酶基因，其DNA序列如以下1)或2)所示； 1. DNA序列为SEQ ID NO :2所示核苷酸序列； 2) 在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白质的DNA分 子。
2. 权利要求1所述的高表达量的脂肪酶基因的获得方法，其特征在于逐级截短亲本脂 肪酶如肤基因序列，从而获得在毕赤酵母中表达量提1?的脂肪酶基因序列。
3. 含有权利要求1所述脂肪酶基因的表达载体。
4. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为分泌型载体。
5. 含有权利要求1所述脂肪酶基因或权利要求3所述表达载体的转基因细胞系。
6. 含有权利要求1所述脂肪酶基因或权利要求3所述表达载体的基因工程菌。
7. 权利要求1所述脂肪酶基因或权利要求3所述表达载体在酶制剂生产中的应用。
8. -种提高脂肪酶表达量的方法，其特征在于逐级截短亲本脂肪酶前肽基因序列，将 其克隆到表达载体后，转化宿主进行表达。
9. 权利要求8所述的方法，其特征在于所述表达载体为分泌型表达载体，宿主优选巴 斯德毕赤酵母。
10. 权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述表达载体为pGAPKW。
【文档编号】C12N15/81GK104099356SQ201410280742
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】喻晓蔚, 徐岩 申请人:江南大学