来自冬虫夏草中国被毛孢的精氨酸酶、编码基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与尿素循环机制机理的精氨酸酶(Arginase)，编码这个酶的基因及其应用。所述精氨酸酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其编码基因核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明从原理上对L-精氨酸合成尿素进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与尿素循环机制机理的精氨酸酶及其编码基因，本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节催化L-精氨酸制备相应的尿素的酶对应编码基因的表达，赋予宿主精氨酸酶的高表达性，为扩大精氨酸酶的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。
【专利说明】来自冬虫夏草中国被毛孢的精氨酸酶、编码基因及其应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一个来自"百令"生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与尿素循环机制机理 的精氨酸酶（Arginase)，编码这个酶的基因及其应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 冬虫夏草（Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鱗翅目 (Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫（Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸 体上的复合体（包括子座和虫体）。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产 物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其 多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾 二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳 痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏 草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物 活性。
[0003] 冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段（无性型）和子囊孢 子阶段（有性型）。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草 菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、 活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证 明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。
[0004] 但是，对冬虫夏草中国被毛孢中尿素循环的研究几乎为空白，尤其在参与中国被 毛孢尿素循环的精氨酸酶的研究上。
[0005] 精氨酸酶（EC:3. 5. 3. 1)是尿素循环中的一种酶，可催化精氨酸水解产生鸟氨酸 和尿素，在机体氮代谢方面起着重要的作用。精氨酸作为一种半必须氨基酸，仅为快速增长 的组织尤其是肿瘤组织所必需。一般含于产生尿素的动物（哺乳类、板鳃鱼类、两栖类、海 龟类）的肝脏、肾脏、精巢中，作为尿素循环的一个环节而起作用。这种酶在肝细胞的核里 特别多，也含于植物的种子、酵母和霉菌中。可为Fe 2+、Co2+、Mn2+等二价金属离子所激活，而 Hg2+、Ag2+、柠檬酸和硼酸等可使之失活，另外可为赖氨酸、鸟氨酸所抑制，最适pH = 9. 8。精 氨酸酶通过分解精氨酸对肿瘤细胞进行营养剥夺，对正常组织影响较小，因此是一种良好 的抗肿瘤药物，众多体内实验证明，精氨酸酶有着显著的抑制肿瘤细胞分裂的作用。
[0006] 1987年，Y Haraguchi等人利用Oligo (dT)随机引物和大鼠中精氨酸酶探针从人 的肝脏细胞的cDNA文库中筛选和克隆到了两个精氨酸酶，分别命名为拉姆达hARG6和拉姆 达hARG109,它们包含一个重叠的并且编码322个氨基酸残基开放读码框的cDNA序列。
[0007] 1996年，Jos印h G.Vockley等人PCR扩增出并克隆到了人II型精氨酸酶基因，这 是有关哺乳动物非肝脏的精氨酸酶基因的首次报道。但是同源性比对后发现这个酶属于I 型精氨酸酶，而精氨酸酶的活力数据，和用anti-All抗体的免疫沉淀作用也同样证实该基 因和I型精氨酸酶的同源性。Northern印迹分析表明这个酶在脑，前列腺和肾中存在差异 表达。
[0008] 2007年，杨成丽等人PCR扩增出了人I型精氨酸酶基因（hAI)，插入大肠杆菌表达 载体pET30a中，构建重组表达质粒pET30a-hAI，转化到大肠杆菌宿主菌BL21 (DE3)中，构建 了大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3) (pET30a-hAI)，IPTG诱导后表达，菌体酶活为每克湿菌 体34. 6U，分析表明，他们所克隆的目的蛋白大小大约为35kDa。
[0009] 2011年，刘巧林等人根据三角帆蛘消减杂交cDNA文库获得的EST序列，运用cDNA 末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得了三角帆蛘精氨酸酶 基因的全长cDNA序列。运用生物信息学方法分析表明精氨酸酶基因 cDNA序列长1720bp， 开放阅读框（65-1072) 1008bp，编码335个氨基酸，5'端非编码区为64bp，3'端非编码区为 648bp，软件推测其编码蛋白相对分子量为36. 81kD。研究采用实时荧光定量PCR方法分析 该基因在不同组织中的表达规律，结果表明，该基因在肝脏、胃、肠、鳃、心脏、外套膜、斧足 共7个组织中都有表达，但主要集中在肝脏、胃和肠消化器官中表达。这可能说明低等的无 脊椎动物三角帆蛘的精氨酸酶兼具有I型和II型精氨酸酶的特征和功能，既可以参与尿素 循环，又可以在生理和病理过程中发挥重要作用，但还需进一步验证。
[0010] 但是，目前NCBI数据库中目前还检索不到中国被毛孢中精氨酸酶的基因相关信 肩、。 (三）
【发明内容】
[0011] 本发明目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对"百令"生产菌冬 虫夏草中国被毛孢尿素循环中的酶及其编码基因进行深入研究，提供了 "百令"生产菌冬虫 夏草中国被毛孢尿素循环机制的一种精氨酸酶、编码基因及其应用。
[0012] 本发明采用的技术方案是：
[0013] 一种参与中国被毛孢尿素循环的精氨酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示 (记为argA蛋白）。该酶可催化L-精氨酸制备相应的尿素。
[0014] SEQ ID No. 1 序列如下：MAFRGFNPRA GINPYQSWAK IVDCGDIPIT PFDNDIAREQ MTQALKSLGE RASVSSLSPK PRLVTLGGDH SLTLPALRAL NHVYGRPVRV LHFDAHLDTff NPEAYPSHWG ATQFTHGSMF WMAKREGLLS NSSSEPSVHA GLRTRLSGDA WADYEDDGSQ NWIRFAADDI DDRGTAGIIA GIMEALGTED PVYLSVDIDV LDPAFAPGTG TPEPGGWTTR ELIRVLRGIE GLDLVGADVV EVSPAYQGRG EETALAAAQV VYEGLTSM*
[0015] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的肽蛋白的片 段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体 与前述氨基酸序列同源性在90%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包 括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基 酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保 守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0016] 由L-精氨酸经过精氨酸酶的催化获得对应尿素的路径如下所示：
[0017]
【权利要求】
1. 一种来自冬虫夏草中国被毛孢的精氨酸酶，其特征在于所述精氨酸酶的氨基酸序列 如 SEQ ID No. 1 所示。
2. 如权利要求1所述的精氨酸酶在生物催化L-精氨酸生成尿素中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含精氨酸酶基因的重组工 程菌经诱导培养后的湿菌体用PH8. 0磷酸盐缓冲液悬浮，超声破碎，取破碎混合液离心，取 上清液为催化剂，以〇. 1M的L精氨酸水溶液为底物，于pH值为7. 0的磷酸盐缓冲液中，37°C 下反应，反应结束后，将反应液离心，取上清液，获得含尿素的混合液。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述底物的初始浓度为0.033M，所述催化剂 的用量以超声破碎前湿菌体的质量计，终浓度为8. lg/L。
5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含精氨酸酶 基因的重组工程菌接种于含终浓度50 μ g/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37°C、250r/ min培养过夜，取培养物，以体积浓度2%的接种量转接于含有50 μ g/ml Kan抗性的LB液 体培养基中，37°C、250r/min培养至菌体浓度0D600为0. 6?0. 8,向培养物中加入终浓度 0. 05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40%、破Is停Is条件下超 声破碎，过滤，取滤液即为催化剂。
6. -种编码权利要求1所述精氨酸酶的基因。
7. 如权利要求6所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
8. 如权利要求6或7所述的编码基因在构建能够生物催化精氨酸生成尿素的基因工程 菌中的应用。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述精氨酸酶基因 的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培 养液分离纯化获得含有精氨酸酶基因的菌体细胞。
【文档编号】C12N9/78GK104120118SQ201410307406
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】柳志强, 郑裕国, 林善, 薛亚平, 吴晖, 李邦良, 许静, 许峰, 王鸿艳 申请人:浙江工业大学, 杭州中美华东制药有限公司