鉴定或辅助鉴定小麦抗寒性的方法
【专利摘要】本发明公开了鉴定或辅助鉴定冬小麦抗寒性的方法。本发明提供了用于鉴定待测小麦抗寒还是不抗寒的引物组合物，由单独使用的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8和引物对9组成；本发明的实验证明，根据5A、5B和5D三个染色体上的Vrn1基因的显隐性来判断小麦是否抗寒，可在实验室快速测定黄淮和北部冬麦区小麦品种的抗寒性，避免因使用不抗寒的品种在小麦生产上导致的冬季冻害损失。
【专利说明】鉴定或辅助鉴定小麦抗寒性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及鉴定或辅助鉴定小麦抗寒性的方法。
【背景技术】
[0002] 严重影响小麦生产的低温冻害分冬季冻害和春季冻害（冷害）两大类。小麦春季 冻害难以预测，在花粉母细胞减数分裂期，曾有温度仅降至6°C也发生严重不结实的记录， 品种间对春季冻害的反应差异不明显，只是不同品种受冻后的恢复速度与恢复程度存在明 显差异，在生产上主要通过栽培技术措施加以预防和补救。但小麦品种对冬季冻害的抗性 (称为抗寒性或越冬性），品种间有明显差异，生产上可以通过培育新品种的抗寒性加以预 防。
[0003] 小麦因对温度高低和日照长短的反应以及生长发育快慢程度的不同被分为冬性、 弱（半）冬性和春性品种。其中对温度的反应被称为春化反应，是小麦对寒冬条件的一种 适应，它在幼穗发育前要求有一定时间的低温，客观上使这个对外部条件敏感的发育过程 延迟到春季温度上升时才开始，从而避开了严寒危害。小麦品种之间的光照反应和早晚熟 程度差异也是明显的，这些差异与不同春化反应结合在一起，在不同地区形成了多种多样 的气候生态类型。
[0004]仅从遗传学角度来看，目前公认的春化有关基因有5个，分别定名为：Vrnl、 Vrn2、Vrn3、Vrn4和Vrn5,前3个基因合称VRN-1，分别定位在5A、5B和5D染色体长臂 上。其中，Vrnl对温度敏感性影响最大，并对其它春化基因具有上位性效应，而Vrn5影响 最小。Sutka和Snape(1989)曾将命名为"Frl"的耐冻基因定位在5A染色体上，与Vrnl 位置相同，他们同时又认为该基因可能是Vrnl基因的多效性或两者之间的紧密连锁。 Distelfeld等（2009)的研究报道提供了上述工作的分子生物学依据（Curr Opin Plant Biol, 2009, l2:1 - 7)。Dhillon等（2〇1〇)在美国和匈牙利比较了 VRN-1基因对不同程度 冬季严寒的反应，结果表明Vrn-Ι等位变异足以决定耐冻性的差异，说明过去作图的耐冻 性基因可能是Vrn-Ι的多态性效应，而不是像Sutka和Snape (1989)提出的那种独立紧 密连锁位点的效应（Regulation of freezing tolerance and flowering in temperate cereals:The VRN-lconnection. Plant Physiol,2010,153:1846 - 1858)。Galiba 等 (2009)的研允也表明，春化与冷适应调节的基因网络是互相联系的（RegUi at〇ry genes involved in the determination of frost tolerance in temperate cereals. Plant Sci，2009, 176:12 - 19)〇
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种用于鉴定待测小麦抗寒还是不抗寒的引物组合物。 [0006]本发明提供的组合物，由单独使用的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物 对5、引物对6、引物对7、引物对8和引物对9组成；
[0007] 所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子361S-F和序列表中序列2 所不的单链DNA分子VA1-R组成；
[0008] 所述引物对2由序列表中序列3所示的单链·Α分子361W_F和序列表中序列2 所示的单链DNA分子VA1-R组成；
[0009] 所述引物对3由序列表中序列4所示的单链DNA分子VRN1AF和序列表中序列5 所示的单链DNA分子VRN1-INT1R组成；
[0010] 所述引物对4由序列表中序列6所示的单链DNA分子Intrl/A/F2和序列表中序 列7所示的单链DNA分子Intrl/A/R3组成；
[0011] 所述引物对5由序列表中序列8所示的单链DNA分子Intrl/C/F和序列表中序列 9所示的单链DNA分子Intrl/AB/R组成；
[0012]所述引物对6由序列表中序列10所示的单链DNA分子Intrl/ B/F和序列表中序 列11所示的单链DNA分子1ntrl/B/R3组成； _3]所述引物对7由序列表中序列10所示的单链DNA分子Intrl/ B/F和序列表中序 列12所示的单链DNA分子Intrl/B/R4组成；
[0014]所述引物对8由序列表中序列13所示的单链DNA分子Intrl/ D/F和序列表中序 列14所示的单链DNA分子Intrl/D/R3组成；
[0015]所述引物对9由序列表中序列13所示的单链DNA分子 Intrl/D/F和序列表中序 列15所示的单链DNA分子Intrl/D/R4组成。
[0016] 上述组合物中，所述引物组合物中各引物均为等摩尔比。
[0017]上述的引物组合物在鉴定或辅助鉴定待测小麦抗寒还是不抗寒中的应用也是本 发明保护的范围；
[0018]或上述的引物组合物在制备鉴定或辅助鉴定待测小麦抗寒还是不抗寒产品中的 应用；所述产品具体为试剂盒。
[0019]本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测小麦抗寒还是不抗寒的方 法。
[0020]本发明提供的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，分别用上述 的引物组合物中的9对引物对进行PCR扩增，检测扩增产物：
[0021]若扩增产物满足如下1)-3)的全部标准，则待测小麦抗寒或候选抗寒：D引物对2 扩增得到的扩增产物大小为469bp或引物对5扩增得到的扩增产物大小为l〇68bp,且引物 对1、引物对3、引物对4没有扩增产物； 2)引物对7扩增得到的扩增产物大小为1149bp,且 引物对6没有扩增产物；3)引物对9扩增得到的扩增产物大小为 997bp，且引物对8没有扩 增产物；
[0022]若扩增产物满足如下A)-B)的任一种标准，则待测小麦不抗寒或候选不抗寒:A) 引物对1扩增产物大小为46%ρ或引物对3扩增产物大小为7l4-965bp或引物对4扩增产 物大小为ll 7〇bp，且引物对2和引物对5均没有扩增产物；B)引物对6扩增得到的扩增产物 大小为709bp，且引物对7没有扩增产物； 3)弓丨物对8扩增得到的扩增产物大小为I671bp， 且引物对9没有扩增产物。
[0023]本发明第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测小麦抗寒还是不抗寒的方法。 [0024]本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的5A、5B和ro染色体上的Vrnl 基因是否为隐性，若5A、5B和?染色体上的Vrnl基因均为隐性，则待测小麦抗寒或候选抗 寒，若5A、5B和5D染色体上的Vrnl基因至少1个不为隐性，则待测小麦不抗寒或者候选不 抗寒。
[0025]上述方法中，所述检测待测小麦的δΑ、5Β和5D染色体上的Vrnl基因隐性的方法 包括如下步骤：
[0026]以待测小麦的基因组DNA为模板，分别用上述的引物组合物中的9对引物对进行 PCR扩增，检测扩增产物：
[0027]若扩增产物满足如下1)-3)的全部标准，则待测小麦的5A、5B和5D染色体上的 Vrnl基因均为隐性：1)引物对2扩增得到的扩增产物大小为469bp或引物对5扩增得到的 扩增产物大小为1068bp，且引物对1、引物对3、引物对4没有扩增产物；2)引物对7扩增得 到的扩增产物大小为1149bp，且引物对6没有扩增产物；3)引物对9扩增得到的扩增产物 大小为997bp，且引物对8没有扩增产物；
[0028]若扩增产物满足如下A) -B)的任一种标准，则待测小麦的5A、5B和5D染色体上的 Vrnl基因至少1个不为隐性:A)引物对1扩增产物大小为469bp或引物对3扩增产物大 小为714-965bp或引物对4扩增产物大小为lHObp，且引物对2和引物对5均没有扩增产 物；B)引物对6扩增得到的扩增产物大小为 7〇%ρ，且引物对7没有扩增产物；3)引物对8 扩增得到的扩增产物大小为1671bp，且引物对9没有扩增产物。
[0029] 上述方法中，所述待测小麦为在每年秋季播种后经历越冬期的小麦。
[0030]上述抗寒小麦为抗寒性等级为1或2的小麦，不抗寒小麦为抗寒等级为4或5的 小麦。
[0031] 本发明的实验证明，本发明δΑ、5Β和5D三个染色体上的Vrnl基因的显性隐性来 判断小麦是否抗寒，该方法可在实验室鉴定新品种抗寒性，弥补了田间鉴定时因某些年份 遭遇"暖冬"天气带来的千扰，可从现有高产优质抗病的小麦新品种中快速鉴定出不同生态 区适用的抗寒性品种，避免冬季低温造成的冻害损失。
[0032] 通过分析春化基因与抗冻性关系可以看出，含有Vrn-Al、Vrn-Bl的品种抗寒性都 很差（表1)。国家农作物新品种区域试验规定：在黄淮北部及北部冬麦区种植的品种要测 试其抗寒性，审定品种的抗寒性要较强。因此在黄淮北部及北部冬麦区推广的品种应尽量 避免携带 Vrn-Al、Vrn-B1。
[0033] 表1春化基因 VRN1等位变异组成与抗寒性的关系
[0034]
【权利要求】
1. 用于鉴定待测小麦抗寒还是不抗寒的引物组合物，由单独使用的引物对1、引物对 2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8和引物对9组成； 所述引物对1由序列表中序列1所示的单链DNA分子361S-F和序列表中序列2所示 的单链DNA分子VA1-R组成； 所述引物对2由序列表中序列3所示的单链DNA分子361W-F和序列表中序列2所示 的单链DNA分子VA1-R组成； 所述引物对3由序列表中序列4所示的单链DNA分子VRN1AF和序列表中序列5所示 的单链DNA分子VRN1-INT1R组成； 所述引物对4由序列表中序列6所示的单链DNA分子Intrl/A/F2和序列表中序列7 所示的单链DNA分子Intrl/A/R3组成； 所述引物对5由序列表中序列8所示的单链DNA分子Intrl/C/F和序列表中序列9所 示的单链DNA分子Intrl/AB/R组成； 所述引物对6由序列表中序列10所示的单链DNA分子Intrl/B/F和序列表中序列11 所示的单链DNA分子Intrl/B/R3组成； 所述引物对7由序列表中序列10所示的单链DNA分子Intrl/B/F和序列表中序列12 所示的单链DNA分子Intrl/B/R4组成； 所述引物对8由序列表中序列13所示的单链DNA分子Intrl/D/F和序列表中序列14 所示的单链DNA分子Intrl/D/R3组成； 所述引物对9由序列表中序列13所示的单链DNA分子Intrl/D/F和序列表中序列15 所示的单链DNA分子Intrl/D/R4组成。
2. 根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物中各引物均为等 摩尔比。
3. 权利要求1或2所述的引物组合物在鉴定或辅助鉴定待测小麦抗寒还是不抗寒中的 应用； 或权利要求1或2所述的引物组合物在制备鉴定或辅助鉴定待测小麦抗寒还是不抗寒 产品中的应用；所述产品具体为试剂盒。
4. 一种鉴定或辅助鉴定待测小麦抗寒还是不抗寒的方法，包括如下步骤：以待测小麦 的基因组DNA为模板，分别用权利要求1或2所述的引物组合物中的9对引物对进行PCR 扩增，检测扩增产物： 若扩增产物满足如下1)_3)的全部标准，则待测小麦抗寒或候选抗寒：1)引物对2扩 增得到的扩增产物大小为469bp或引物对5扩增得到的扩增产物大小为1068bp，且引物对 1、引物对3、引物对4没有扩增产物；2)引物对7扩增得到的扩增产物大小为1149bp，且引 物对6没有扩增产物；3)引物对9扩增得到的扩增产物大小为997bp，且引物对8没有扩增 产物； 若扩增产物满足不符合上述情况，则待测小麦不抗寒或候选不抗寒。
5. -种鉴定或辅助鉴定待测小麦抗寒还是不抗寒的方法，包括如下步骤：检测待测小 麦的5A、5B和?染色体上的Vrnl基因是否为隐性，若5A、5B和?染色体上的Vrnl基因 均为隐性，则待测小麦抗寒或候选抗寒，若不符合上述情况，则待测小麦不抗寒或者候选不 抗寒。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦的5A、5B和ro染色体 上的Vrnl基因是否为隐性的方法包括如下步骤： 以待测小麦的基因组DNA为模板，分别用权利要求1或2所述的引物组合物中的9对 引物对进行PCR扩增，检测扩增产物： 若扩增产物满足如下1)_3)的全部标准，则待测小麦的5A、5B和?染色体上的Vrnl 基因均为隐性：1)引物对2扩增得到的扩增产物大小为469bp或引物对5扩增得到的扩增 产物大小为l〇68bp，且引物对1、引物对3、引物对4没有扩增产物；2)引物对7扩增得到的 扩增产物大小为1149bp，且引物对6没有扩增产物；3)引物对9扩增得到的扩增产物大小 为997bp，且引物对8没有扩增产物； 若扩增产物不符合上述情况，则待测小麦的5A、5B和?染色体上的Vrnl基因不全为 隐性。
7. 根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于： 所述待测小麦为在每年秋季播种后经历越冬期的小麦。
【文档编号】C12N15/11GK104232758SQ201410379477
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月4日 优先权日:2014年8月4日
【发明者】孙果忠, 游光霞, 张秀英, 肖世和 申请人:中国农业科学院作物科学研究所