红曲菌种、高活性成分功能性红曲粉的制法及制品的制作方法

红曲菌种、高活性成分功能性红曲粉的制法及制品的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种红曲菌种，命名为红曲菌TY728(Monascus rubei TY728)，其于2014年7月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，生物保藏编号为：CCTCC NO:M 2014363；还公开了采用该菌种制取低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉的方法及其制品，其包括制取菌种；菌种培养、接种、发酵；深层液态发酵；发酵后处理。本发明提供的红曲菌种，是经过特别培育而获得的微生物品种，适应液态发酵工艺、生命力强、代谢过程中不产或低产桔霉素；本发明采用上述菌种为发酵菌种，获得不含或低产桔霉素、高色价、高Monacolin K、高GABA等活性功能成分，其制法采用深层液态发酵，不产生污染、工艺先进，质量稳定性高，适宜规模化生产，达到国际卫生标准。
CCTCC NO:M2014363
2014.07.31
【专利说明】红曲菌种、高活性成分功能性红曲粉的制法及制品

【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物及其发酵【技术领域】，具体涉及红曲菌种、采用液态发酵制备低 桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉的制法及制品。

【背景技术】
[0002] 我国红曲菌种资源丰富，无论作为食用还是药用，红曲都起着重要的作用。红曲的 潜在价值很大，为了更好的服务于人类，我们应积极利用红曲的药理研发新产品，尤其是洛 伐他汀类在降低胆固醇方面的应用，减少动脉粥样硬化发生，防治冠心病等心血管病。同 时，做好对桔霉素的检测工作，保证功能性红曲的安全问题。
[0003] 自从在红曲中发现Monacolin K等活性物质后，日本等国利用固态发酵和液态发 酵2种工艺生产、开发了非常丰富的红曲制品，特别是功能红曲制品，如红曲米、降血脂的 功能红曲（含Monacolin K)、降血压的功能红曲（含GABA)以及红曲清酒、红曲梅酒、红曲 米酒、红曲米醋、红曲酱油、红曲豆腐、红曲茶等等，大大拓宽了红曲的用途。1995年Blanc 等人从红曲菌发酵产物中分离出桔霉素后，应用研究的重点也就转入了桔霉素的控制方 面。目前日本在这方面处于领先地位，桔霉素含量能控制在〇. 2mg/kg以下，目前日本产品 标准已将桔霉素限量定为0. 2mg/kg ;而在我国，虽有少量相关研究报道，但在实际生产中 桔霉素的控制基本处于空白状态，现行国家标准也未将桔霉素作为卫生指标，中国食品添 加剂协会对国内生产的红曲产品桔霉素含量指标委托江南大学进行普查，发现大部份产 品的桔霉素含量超出日本标准最低十几倍，最高达一百多倍，桔霉素已成为我国红曲申报 JECFA进入欧美市场的技术瓶颈。
[0004] 目前降低红曲产品中桔霉素的含量、开发辅助降脂降压的功能红曲产品，需要解 决三个关键问题：一是产品的安全性，二是提高Monacolin K、GABA等活性物质的含量，三 是工业化生产的问题。加强开发无桔霉素或低桔霉素的具有降脂降压作用的功能红曲，延 伸红曲产品的价值，是目前红曲产业的两个主要趋势和方向，也是国内红曲企业亟待解决 的问题。


【发明内容】

[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种液态发酵技术获得低桔霉素、 高伽玛氨基丁酸、莫纳考林K等活性功能成分的低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲 粉的制法及制品。
[0006] 本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：
[0007] 一种红曲菌种，命名为红曲菌TY728(Monascus rubei TY728)，其于2014年7月 31日保藏于湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，生物保藏编 号为：CCTCC N0:M 2014363。
[0008] -种采用上述的菌种经液态发酵而制取低桔霉素高色价高活性成分的功能性红 曲粉的方法，其包括如下步骤：
[0009] (1)制取菌种：
[0010] 制取红曲菌种作为发酵菌种；
[0011] (2)菌种经培养基培养：
[0012] 将步骤（1)所制取的菌种分别用下列培养基培养：斜面培养基、种子液培养基、液 态摇瓶培养基；
[0013] (21)所述的斜面培养基为：可溶性淀粉3-5%，麦芽糖3-5%，蛋白胨2-4%，琼脂 2-4%，硝酸钠0. 5-0. 8%与剩余量的水混合而成；将该斜面培养基装入三角瓶中，经灭菌、 冷却，接种步骤（1)菌种并进行斜面培养基的培养，在30°C培养箱中培养至菌丝长满斜面；
[0014] (22)所述的种子液培养基为：葡萄糖20-24g/L，蛋白胨30-34g/L，甘油20-22g/L， 硝酸钠2-4g/L，硫酸锌2-4g/L，磷酸二氢钾l-2g/L，经灭菌、冷却；用40-60mL无菌水洗涤 步骤（21)三角瓶斜面孢子后所得的斜面培养液，按照体积比为该种子液培养基的50-60% 接种到装有IOOml该种子液培养基的三角瓶中，在30°C、180r/min的旋转式摇床上液态培 养1天；
[0015] (23)所述的液态摇瓶培养基为：淀粉16-18 %、硝酸钠0.4-0. 6 %、酵母膏 0. 6-0. 8%、玉米浆0. 8-1 %与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为4. 0而制成的，经灭菌、 冷却；将步骤（22)所得的种子液培养种，按照体积比为该液态摇瓶培养基的50-60%的量 接种到装有IOOmL该液态摇瓶培养基的三角瓶中，在28°C、180r/min的条件下液态摇瓶培 养2天；
[0016] (3)发酵处理：
[0017] 以大米粉-甘油作为碳源，黄豆作为主要氮源，蛋白胨、玉米浆为辅料作为氮源、 用乳酸调节PH值而制成发酵培养基，将该发酵培养基装入三角瓶中，经高温灭菌后冷却至 常温，将步骤（23)所生产的液态摇瓶种，按体积百分比为6-8%的接种量接种于50ml该发 酵培养基中，于26°C发酵12天；
[0018] (4)深层液态发酵：
[0019] 以步骤（3)所得的液态摇瓶种发酵液为基础，采用发酵罐、经分批间歇发酵、深层 发酵调节的优化，设定发酵培养工艺，进行深层液态发酵，得到功能红曲发酵液；
[0020] (5)发酵后处理：
[0021] 将步骤（4)所得的功能红曲发酵液，采用罐组式连续逆流提取工艺进行提取，之 后采用厢式隔膜压滤机进行纯化、浓缩、精制，并进行喷雾干燥，得到低桔霉素高色价高活 性成分的功能性红曲粉。
[0022] 所述的步骤（3)中发酵培养基为大米粉10_12g/L、甘油8-10g/L、黄豆6_8g/L、蛋 白胨l-3g/L、玉米浆2-4g/L、硫酸镁4. 5-6. Og/L、磷酸二氢钾l-2g/L、硝酸钠0? 4-0. 6g/L、 酵母膏0. 6-0. 8g/L，乳酸调节PH值为3. 5。
[0023] 所述的步骤（4)中的发酵培养工艺为发酵罐采用30M3发酵罐，初定发酵有效体 积为22. 0立方米，发酵时生长温度32-35°C，通风比为1:0. 3-0. 6,罐压0. 4-0. 7MPa，时间 65-85h ；
[0024] 所述的步骤（5)中的罐组式连续逆流提取工艺为三级逆流提取，其中提取温度为 25-55°C、提取溶剂乙醇用量为5-15L/kg、提取时间为40-60min。
[0025] 所述的步骤（5)中的厢式隔膜压滤机中超滤MWC010000、纳滤MWC0200。
[0026] -种采用上述的方法制备得到的低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉，其 是由所述的红曲菌种分别经斜面培养基、种子液培养基、液态摇瓶培养基、发酵培养基的接 种培养、发酵，之后经深层液态发酵、三级逆流提取、超滤-纳滤技术浓缩精制、喷雾干燥而 得到的。
[0027] 所述的斜面培养基为可溶性淀粉3-5 %，麦芽糖3-5 %，蛋白胨2-4 %，琼脂2-4 %， 硝酸钠〇. 5-0. 8%与剩余量的水混合而成；所述的种子液培养基为葡萄糖20-24g/L，蛋白 胨30-34g/L，甘油20-22g/L，硝酸钠2-4g/L，硫酸锌2-4g/L，磷酸二氢钾l-2g/L ;所述的 液态摇瓶培养基为：淀粉16-18%、硝酸钠0. 4-0. 6%、酵母膏0. 6-0. 8%、玉米浆0. 8-1% 与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为4.0 ;所述的发酵培养基为大米粉10-12g/L、甘 油8-10g/L、黄豆6-8g/L、蛋白胨l-3g/L、玉米浆2-4g/L、硫酸镁4. 5-6. Og/L、磷酸二氢钾 l-2g/L、硝酸钠0? 4-0. 6g/L、酵母膏0? 6-0. 8g/L，乳酸调节PH值为3. 5。
[0028] 所述的深层液态发酵采用30M3发酵罐，初定发酵有效体积为22. 0立方米，发酵时 生长温度32-35°C，通风比为1:0. 3-0. 6,罐压0? 4-0. 7MPa，时间65-85h。
[0029] 所述的三级逆流提取中的提取温度为25_55°C、提取溶剂乙醇用量为5_15L/Kg、 提取时间为40-60min ;所述的超滤-纳滤技术采用厢式隔膜压滤机，其中超滤MWC010000、 纳滤 MWC0200。
[0030] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0031] 本发明提供的一种红曲菌种，命名为红曲菌TY728 (Monascus rubei TY728)，生物 保藏编号为：CCTCC N0:M 2014363,是经过特别培育而获得的微生物品种，适应采用液态发 酵工艺、生命力强、效率高、代谢过程中不产或低产桔霉素，经优选的培养基的培养、发酵工 艺，获得的功能红曲粉制品具备不含或低广結霉素、1?色价、1?伽玛氣基丁酸、1?旲纳考林K 等活性功能成分。
[0032] 本发明提供的低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉的制法采用发酵罐进 行深层液态发酵，不产生污染、其生产工艺先进，质量稳定性高，适宜规模化生产，达到国际 卫生标准。
[0033] 下面结合具体实施例来详细描述本发明，但并不是对本发明的进一步限制。

【具体实施方式】
[0034] 实施例1 :
[0035] 本实施例提供的一种红曲菌种，命名为红曲菌TY728 (Monascus rubei TY728)， 其于2014年7月31日保藏于湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，生物保藏编号为：CCTCC N0:M 2014363。
[0036] -种采用上述菌种制备低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉的方法，其包 括下列步骤：
[0037] ⑴制取菌种：
[0038] 制取红曲菌种作为发酵菌种；
[0039] (2)菌种经培养基培养：
[0040] 将步骤（1)所制取的菌种分别用下列培养基培养：斜面培养基、种子液培养基、液 态摇瓶培养基；
[0041] (21)所述的斜面培养基为：可溶性淀粉3-5%，麦芽糖3-5%，蛋白胨2-4%，琼脂 2-4%，硝酸钠0. 5-0. 8%与剩余量的水混合而成；将该斜面培养基装入三角瓶中，经灭菌、 冷却，接种步骤（1)菌种并进行斜面培养基的培养，在30°C培养箱中培养至菌丝长满斜面；
[0042] (22)所述的种子液培养基为：葡萄糖20-24g/L，蛋白胨30-34g/L，甘油20-22g/L， 硝酸钠2-4g/L，硫酸锌2-4g/L，磷酸二氢钾l-2g/L，经灭菌、冷却；用40-60mL无菌水洗涤 步骤（21)三角瓶斜面孢子后所得的斜面培养液，按照体积比为该种子液培养基的50-60% 接种到装有IOOml该种子液培养基的三角瓶中，在30°C、180r/min的旋转式摇床上液态培 养1天；
[0043] (23)所述的液态摇瓶培养基为：淀粉16-18 %、硝酸钠0.4-0. 6 %、酵母膏 0. 6-0. 8%、玉米浆0. 8-1 %与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为4. 0而制成的，经灭菌、 冷却；将步骤（22)所得的种子液培养种，按照体积比为该液态摇瓶培养基的50-60%的量 接种到装有IOOmL该液态摇瓶培养基的三角瓶中，在28°C、180r/min的条件下液态摇瓶培 养2天；
[0044] (3)发酵处理：
[0045] 以大米粉-甘油作为碳源，黄豆作为主要氮源，蛋白胨、玉米浆为辅料作为氮源、 用乳酸调节PH值而制成发酵培养基，将该发酵培养基装入三角瓶中，经高温灭菌后冷却至 常温，将步骤（23)所生产的液态摇瓶种，按体积百分比为6-8%的接种量接种于50ml该发 酵培养基中，于26°C发酵12天；
[0046] (4)深层液态发酵：
[0047] 以步骤（3)所得的液态摇瓶种发酵液为基础，采用发酵罐、经分批间歇发酵、深层 发酵调节的优化，设定发酵培养工艺，进行深层液态发酵，得到功能红曲发酵液；
[0048] (5)发酵后处理：
[0049] 将步骤（4)所得的功能红曲发酵液，采用罐组式连续逆流提取工艺进行提取，之 后采用厢式隔膜压滤机进行纯化、浓缩、精制，并进行喷雾干燥，得到低桔霉素高色价高活 性成分的功能性红曲粉。
[0050] 所述的步骤（3)中发酵培养基为大米粉10-12g/L、甘油8-10g/L、黄豆6-8g/L、蛋 白胨l-3g/L、玉米浆2-4g/L、硫酸镁4. 5-6. Og/L、磷酸二氢钾l-2g/L、硝酸钠0? 4-0. 6g/L、 酵母膏0. 6-0. 8g/L，乳酸调节PH值为3. 5。
[0051] 所述的步骤（4)中的发酵培养工艺为发酵罐采用30M3发酵罐，初定发酵有效体 积为22. 0立方米，发酵时生长温度32-35°C，通风比为1:0. 3-0. 6,罐压0. 4-0. 7MPa，时间 65-85h ；
[0052] 所述的步骤（5)中的罐组式连续逆流提取工艺为三级逆流提取，其中提取温度为 25-55°C、提取溶剂乙醇用量为5-15L/kg、提取时间为40-60min。
[0053] 所述的步骤（5)中的厢式隔膜压滤机中超滤MWC010000、纳滤MWC0200。
[0054] -种采用上述的菌种及方法制备得到的低桔霉素高色价高活性成分的功能性红 曲粉，其是由所述的红曲菌种分别经斜面培养基、种子液培养基、液态摇瓶培养基、发酵培 养基的接种培养、发酵，之后经深层液态发酵、三级逆流提取、超滤-纳滤技术浓缩精制、喷 雾干燥而得到的粉状制品。
[0055] 所述的斜面培养基为可溶性淀粉3-5 %，麦芽糖3-5 %，蛋白胨2-4 %，琼脂2-4 %， 硝酸钠0. 5-0. 8%与剩余量的水混合而成；所述的种子液培养基为葡萄糖20-24g/L，蛋白 胨30-34g/L，甘油20-22g/L，硝酸钠2-4g/L，硫酸锌2-4g/L，磷酸二氢钾l-2g/L ;所述的 液态摇瓶培养基为：淀粉16-18%、硝酸钠0. 4-0. 6%、酵母膏0. 6-0. 8%、玉米浆0. 8-1% 与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为4.0 ;所述的发酵培养基为大米粉10-12g/L、甘 油8-10g/L、黄豆6-8g/L、蛋白胨l-3g/L、玉米浆2-4g/L、硫酸镁4. 5-6. Og/L、磷酸二氢钾 l-2g/L、硝酸钠0? 4-0. 6g/L、酵母膏0? 6-0. 8g/L，乳酸调节PH值为3. 5。
[0056] 所述的深层液态发酵采用30M3发酵罐，初定发酵有效体积为22. 0立方米，发酵时 生长温度32-35°C，通风比为1:0. 3-0. 6,罐压0? 4-0. 7MPa，时间65-85h。
[0057] 所述的三级逆流提取中的提取温度为25-55°C、提取溶剂乙醇用量为5-15L/Kg、 提取时间为40-60min ;所述的超滤-纳滤技术采用厢式隔膜压滤机，其中超滤MWC010000、 纳滤 MWC0200。
[0058] 实施例2 :
[0059] 本实施例提供的菌种、低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉的制法及制 品，均与实施例1基本相同，其不同之处在于：
[0060] 一种采用本发明所述的菌种经液态发酵而制取低桔霉素高色价高活性成分的功 能性红曲粉的方法，包括如下步骤，其不同之处在于：
[0061] (2)菌种经培养基培养：
[0062] 将步骤（1)所制取的菌种分别用下列培养基培养：斜面培养基、种子液培养基、液 态摇瓶培养基；
[0063] (21)所述的斜面培养基为：可溶性淀粉4 %，麦芽糖3 %，蛋白胨2 %，琼脂2 %，硝 酸钠0. 5%与剩余量的水混合而成；将该斜面培养基装入三角瓶中，经灭菌、冷却，接种步 骤（1)菌种并进行斜面培养基的培养，在30°C培养箱中培养至菌丝长满斜面；
[0064] (22)所述的种子液培养基为：葡萄糖20g/L，蛋白胨34g/L，甘油20g/L，硝酸钠 2g/L，硫酸锌4g/L，磷酸二氢钾lg/L，经灭菌、冷却；用60mL无菌水洗涤步骤（21)三角瓶斜 面孢子后所得的斜面培养液，按照体积比为该种子液培养基的60%接种到装有IOOml该种 子液培养基的三角瓶中，在30°C、180r/min的旋转式摇床上液态培养1天；
[0065] (23)所述的液态摇瓶培养基为：淀粉16%、硝酸钠0. 6%、酵母膏0. 6%、玉米浆 0. 8%与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为4. 0而制成的，经灭菌、冷却；将步骤（22)所 得的种子液培养种，按照体积比为该液态摇瓶培养基的50%的量接种到装有IOOmL该液态 摇瓶培养基的三角瓶中，在28°C、180r/min的条件下液态摇瓶培养2天；
[0066] (3)发酵处理：
[0067] 以大米粉-甘油作为碳源，黄豆作为主要氮源，蛋白胨、玉米浆为辅料作为氮源、 用乳酸调节PH值而制成发酵培养基，将该发酵培养基装入三角瓶中，经高温灭菌后冷却至 常温，将步骤（23)所生产的液态摇瓶种，按体积百分比为6%的接种量接种于50ml该发酵 培养基中，于26°C发酵12天；
[0068] 所述的步骤（3)中发酵培养基为大米粉10g/L、甘油10g/L、黄豆6g/L、蛋白胨3g/ L、玉米浆4g/L、硫酸镁4. 5g/L、磷酸二氢钾lg/L、硝酸钠0. 4g/L、酵母膏0. 6g/L，乳酸调节 PH值为3. 5。
[0069] 所述的步骤（4)中的发酵培养工艺为发酵罐采用30M3发酵罐，初定发酵有效体积 为22. O立方米，发酵时生长温度32°C，通风比为1:0. 3,罐压0. 4MPa，时间85h ;
[0070] 所述的步骤（5)中的罐组式连续逆流提取工艺为三级逆流提取，其中提取温度为 25°C、提取溶剂乙醇用量为5L/kg、提取时间为60min。
[0071] -种采用上述的方法制备得到的低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉，其 不同之处在于 ：
[0072] 所述的斜面培养基为可溶性淀粉4%，麦芽糖3 %，蛋白胨2 %，琼脂2 %，硝酸钠 0. 5%与剩余量的水混合而成；所述的种子液培养基为葡萄糖20g/L，蛋白胨34g/L，甘油 20g/L，硝酸钠2g/L，硫酸锌4g/L，磷酸二氢钾lg/L ;所述的液态摇瓶培养基为：淀粉16%、 硝酸钠0. 6%、酵母膏0. 6%、玉米浆0. 8%与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为4. 0 ;所 述的发酵培养基为大米粉l〇g/L、甘油10g/L、黄豆6g/L、蛋白胨3g/L、玉米楽4g/L、硫酸镁 4. 5g/L、磷酸二氢钾lg/L、硝酸钠0. 4g/L、酵母膏0. 6g/L，乳酸调节PH值为3. 5 ;
[0073] 所述的深层液态发酵采用30M3发酵罐，初定发酵有效体积为22. 0立方米，发酵时 生长温度32°C，通风比为1:0. 3,罐压0. 4MPa，时间85h;
[0074] 所述的三级逆流提取中的提取温度为25°C、提取溶剂乙醇用量为5L/kg、提取时 间为60min。
[0075] 实施例3 :
[0076] 本实施例提供的菌种、低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉的制法及制 品，与实施例1、2均基本相同，其不同之处在于：
[0077] -种采用本发明所述的菌种经液态发酵而制取低桔霉素高色价高活性成分的功 能性红曲粉的方法，包括如下步骤：其不同之处在于：
[0078] (2)菌种经培养基培养：
[0079] 将步骤（1)所制取的菌种分别用下列培养基培养：斜面培养基、种子液培养基、液 态摇瓶培养基；
[0080] (21)所述的斜面培养基为：可溶性淀粉3 %，麦芽糖5 %，蛋白胨3 %，琼脂4 %，硝 酸钠0.8%与剩余量的水混合而成；将该斜面培养基装入三角瓶中，经灭菌、冷却，接种步 骤（1)菌种并进行斜面培养基的培养，在30°C培养箱中培养至菌丝长满斜面；
[0081] (22)所述的种子液培养基为：葡萄糖22g/L，蛋白胨30g/L，甘油22g/L，硝酸钠 4g/L，硫酸锌3g/L，磷酸二氢钾I. 5g/L，经灭菌、冷却；用40mL无菌水洗涤步骤（21)三角瓶 斜面孢子后所得的斜面培养液，按照体积比为该种子液培养基的55%接种到装有IOOml该 种子液培养基的三角瓶中，在30°C、180r/min的旋转式摇床上液态培养1天；
[0082] (23)所述的液态摇瓶培养基为：淀粉17%、硝酸钠0. 4%、酵母膏0. 8%、玉米浆 0. 9%与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为4. 0而制成的，经灭菌、冷却；将步骤（22)所 得的种子液培养种，按照体积比为该液态摇瓶培养基的55%的量接种到装有IOOmL该液态 摇瓶培养基的三角瓶中，在28°C、180r/min的条件下液态摇瓶培养2天；
[0083] (3)发酵处理：
[0084] 以大米粉-甘油作为碳源，黄豆作为主要氮源，蛋白胨、玉米浆为辅料作为氮源、 用乳酸调节PH值而制成发酵培养基，将该发酵培养基装入三角瓶中，经高温灭菌后冷却至 常温，将步骤（23)所生产的液态摇瓶种，按体积百分比为7%的接种量接种于50ml该发酵 培养基中，于26°C发酵12天；
[0085] 所述的步骤（3)中发酵培养基为大米粉llg/L、甘油9g/L、黄豆7g/L、蛋白胨2g/ L、玉米浆3g/L、硫酸镁5. 5/L、磷酸二氢钾I. 5g/L、硝酸钠0. 6g/L、酵母膏0. 8g/L，乳酸调节 PH值为3. 5。
[0086] 所述的步骤（4)中的发酵培养工艺为发酵罐采用30M3发酵罐，初定发酵有效体积 为22. 0立方米，发酵时生长温度33. 5°C，通风比为1:0. 45,罐压0. 55MPa，时间75h;
[0087] 所述的步骤（5)中的罐组式连续逆流提取工艺为三级逆流提取，其中提取温度为 40°C、提取溶剂乙醇用量为10L/kg、提取时间为50min。
[0088] 一种采用上述的方法制备得到的低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉，其 不同之处在于：
[0089] 所述的斜面培养基为可溶性淀粉3%，麦芽糖5%，蛋白胨3%，琼脂4%，硝酸 钠0. 8%与剩余量的水混合而成；所述的种子液培养基为葡萄糖22g/L，蛋白胨30g/L，甘 油22g/L，硝酸钠4g/L，硫酸锌3g/L，磷酸二氢钾I. 5g/L ;所述的液态摇瓶培养基为：淀粉 17 %、硝酸钠0. 4 %、酵母膏0. 8 %、玉米浆0. 9 %与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为 4. 0 ;所述的发酵培养基为大米粉llg/L、甘油9g/L、黄豆7g/L、蛋白胨2g/L、玉米浆3g/L、 硫酸镁5. 5/L、磷酸二氢钾I. 5g/L、硝酸钠0. 6g/L、酵母膏0. 8g/L，乳酸调节PH值为3. 5。
[0090] 所述的深层液态发酵采用30M3发酵罐，初定发酵有效体积为22. 0立方米，发酵时 生长温度33. 5°C，通风比为1:0. 45,罐压0. 55MPa，时间75h;
[0091] 所述的三级逆流提取中的提取温度为40°C、提取溶剂乙醇用量为10L/kg、提取时 间为50min。
[0092] 实施例4 :
[0093] 本实施例提供的菌种、低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉的制法及制 品，与实施例1、2、3基本相同，其不同之处在于：
[0094] 一种采用本发明所述的菌种经液态发酵而制取低桔霉素高色价高活性成分的功 能性红曲粉的方法，包括如下步骤：其不同之处在于：
[0095] (2)菌种经培养基培养：
[0096] 将步骤（1)所制取的菌种分别用下列培养基培养：斜面培养基、种子液培养基、液 态摇瓶培养基；
[0097] (21)所述的斜面培养基为：可溶性淀粉5%，麦芽糖4%，蛋白胨4%，琼脂3%，硝 酸钠0.6%与剩余量的水混合而成；将该斜面培养基装入三角瓶中，经灭菌、冷却，接种步 骤（1)菌种并进行斜面培养基的培养，在30°C培养箱中培养至菌丝长满斜面；
[0098] (22)所述的种子液培养基为：葡萄糖24g/L，蛋白胨32g/L，甘油21g/L，硝酸钠 3g/L，硫酸锌2g/L，磷酸二氢钾2g/L，经灭菌、冷却；用50mL无菌水洗涤步骤（21)三角瓶斜 面孢子后所得的斜面培养液，按照体积比为该种子液培养基的50%接种到装有IOOml该种 子液培养基的三角瓶中，在30°C、180r/min的旋转式摇床上液态培养1天；
[0099] (23)所述的液态摇瓶培养基为：淀粉18%、硝酸钠0. 5%、酵母膏0. 7%、玉米浆 1%与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为4.0而制成的，经灭菌、冷却；将步骤（22)所得 的种子液培养种，按照体积比为该液态摇瓶培养基的60%的量接种到装有IOOmL该液态摇 瓶培养基的三角瓶中，在28°C、180r/min的条件下液态摇瓶培养2天；
[0100] (3)发酵处理：
[0101] 以大米粉-甘油作为碳源，黄豆作为主要氮源，蛋白胨、玉米浆为辅料作为氮源、 用乳酸调节PH值而制成发酵培养基，将该发酵培养基装入三角瓶中，经高温灭菌后冷却至 常温，将步骤（23)所生产的液态摇瓶种，按体积百分比为8%的接种量接种于50ml该发酵 培养基中，于26°C发酵12天；
[0102] 所述的步骤（3)中发酵培养基为大米粉12g/L、甘油8g/L、黄豆8g/L、蛋白胨Ig/ L、玉米浆4g/L、硫酸镁6. Og/L、磷酸二氢钾2g/L、硝酸钠0. 5g/L、酵母膏0. 7g/L，乳酸调节 PH值为3. 5。
[0103] 所述的步骤（4)中的发酵培养工艺为发酵罐采用30M3发酵罐，初定发酵有效体积 为22. 0立方米，发酵时生长温度35°C，通风比为1:0. 6,罐压0. 7MPa，时间65h ;
[0104] 所述的步骤（5)中的罐组式连续逆流提取工艺为三级逆流提取，其中提取温度为 55°C、提取溶剂乙醇用量为15L/kg、提取时间为40min。
[0105] 一种采用上述的方法制备得到的低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉，其 不同之处在于：
[0106] 所述的斜面培养基为可溶性淀粉5%，麦芽糖4%，蛋白胨4%，琼脂3%，硝酸钠 0. 6%与剩余量的水混合而成；所述的种子液培养基为葡萄糖24g/L，蛋白胨32g/L，甘油 21g/L，硝酸钠3g/L，硫酸锌2g/L，磷酸二氢钾2g/L ;所述的液态摇瓶培养基为：淀粉18%、 硝酸钠0. 5%、酵母膏0. 7%、玉米浆1 %与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为4. 0 ;所 述的发酵培养基为大米粉12g/L、甘油8g/L、黄豆8g/L、蛋白胨lg/L、玉米楽4g/L、硫酸镁 6. Og/L、磷酸二氢钾2g/L、硝酸钠0. 5g/L、酵母膏0. 7g/L，乳酸调节PH值为3. 5。
[0107] 所述的深层液态发酵采用30M3发酵罐，初定发酵有效体积为22. 0立方米，发酵时 生长温度35°C，通风比为1:0. 6,罐压0. 7MPa，时间65h;
[0108] 所述的三级逆流提取中的提取温度为55°C、提取溶剂乙醇用量为15L/kg、提取时 间为40min。
[0109] 实施例5 :
[0110] 本实施例提供的菌种、低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉的制法及制 品，与实施例1、2、3、4均基本相同，其不同之处在于：
[0111] 一种采用本发明所述的菌种经液态发酵而制取低桔霉素高色价高活性成分的功 能性红曲粉的方法，包括如下步骤：其不同之处在于：
[0112] (2)菌种经培养基培养：
[0113] 将步骤（1)所制取的菌种分别用下列培养基培养：斜面培养基、种子液培养基、液 态摇瓶培养基；
[0114] (21)所述的斜面培养基为：可溶性淀粉4%，麦芽糖3%，蛋白胨4%，琼脂3%，硝 酸钠0. 5%与剩余量的水混合而成；将该斜面培养基装入三角瓶中，经灭菌、冷却，接种步 骤（1)菌种并进行斜面培养基的培养，在30°C培养箱中培养至菌丝长满斜面；
[0115] (22)所述的种子液培养基为：葡萄糖24g/L，蛋白胨30-34g/L，甘油20g/L，硝酸钠 3g/L，硫酸锌3g/L，磷酸二氢钾lg/L，经灭菌、冷却；用55mL无菌水洗涤步骤（21)三角瓶斜 面孢子后所得的斜面培养液，按照体积比为该种子液培养基的60%接种到装有IOOml该种 子液培养基的三角瓶中，在30°C、180r/min的旋转式摇床上液态培养1天；
[0116] (23)所述的液态摇瓶培养基为：淀粉17%、硝酸钠0.6%、酵母膏0.6%、玉米浆 1%与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为4.0而制成的，经灭菌、冷却；将步骤（22)所得 的种子液培养种，按照体积比为该液态摇瓶培养基的55%的量接种到装有IOOmL该液态摇 瓶培养基的三角瓶中，在28°C、180r/min的条件下液态摇瓶培养2天；
[0117] (3)发酵处理：
[0118] 以大米粉-甘油作为碳源，黄豆作为主要氮源，蛋白胨、玉米浆为辅料作为氮源、 用乳酸调节PH值而制成发酵培养基，将该发酵培养基装入三角瓶中，经高温灭菌后冷却至 常温，将步骤（23)所生产的液态摇瓶种，按体积百分比为6%的接种量接种于50ml该发酵 培养基中，于26°C发酵12天；
[0119] 所述的步骤（3)中发酵培养基为大米粉10g/L、甘油8g/L、黄豆8g/L、蛋白胨3g/ L、玉米浆4g/L、硫酸镁5. 5g/L、磷酸二氢钾lg/L、硝酸钠0. 4g/L、酵母膏0. 6g/L，乳酸调节 PH值为3. 5。
[0120] 所述的步骤（4)中的发酵培养工艺为发酵罐采用30M3发酵罐，初定发酵有效体积 为22. 0立方米，发酵时生长温度33°C，通风比为1:0. 5,罐压0. 6MPa，时间70h;
[0121] 所述的步骤（5)中的罐组式连续逆流提取工艺为三级逆流提取，其中提取温度为 35°C、提取溶剂乙醇用量为12L/kg、提取时间为55min。
[0122] 一种采用上述的方法制备得到的低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉，其 不同之处在于 ：
[0123] 所述的斜面培养基为可溶性淀粉4%，麦芽糖3%，蛋白胨4%，琼脂3%，硝酸钠 0.5%与剩余量的水混合而成 ；所述的种子液培养基为葡萄糖24§/1，蛋白胨30-34§/1，甘 油20g/L，硝酸钠3g/L，硫酸锌3g/L，磷酸二氢钾lg/L ;所述的液态摇瓶培养基为：淀粉 17%、硝酸钠0. 6%、酵母膏0. 6%、玉米浆1 %与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为4. 0 ; 所述的发酵培养基为大米粉l〇g/L、甘油8g/L、黄豆8g/L、蛋白胨3g/L、玉米楽4g/L、硫酸镁 5. 5g/L、磷酸二氢钾lg/L、硝酸钠0. 4g/L、酵母膏0. 6g/L，乳酸调节PH值为3. 5。
[0124] 所述的深层液态发酵采用30M3发酵罐，初定发酵有效体积为22. 0立方米，发酵时 生长温度33°C，通风比为1:0. 5,罐压0. 6MPa，时间70h;
[0125] 所述的三级逆流提取中的提取温度为35°C、提取溶剂乙醇用量为12L/kg、提取时 间为55min。
[0126] 按照国际标准检测，上述实施例所得产品的相关指标如下表：
[0127]

【权利要求】
1. 一种红曲菌种，命名为红曲菌TY728(Monascus rubei TY728)，其于2014年7月31 日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，生物保藏编号为：CCTCC NO:M 2014363。
2. -种采用权利要求1所述的菌种制取高活性成分功能性红曲粉的方法，其特征在 于，包括如下步骤： (1) 制取菌种： 制取红曲菌种作为发酵菌种； (2) 菌种经培养基培养： 将步骤（1)所制取的菌种分别用下列培养基培养：斜面培养基、种子液培养基、液态摇 瓶培养基； (21) 所述的斜面培养基为：可溶性淀粉3-5%，麦芽糖3-5%，蛋白胨2-4%，琼脂 2-4%，硝酸钠0. 5-0. 8%与剩余量的水混合而成；将该斜面培养基装入三角瓶中，经灭菌、 冷却，接种步骤（1)菌种并进行斜面培养基的培养，在30°C培养箱中培养至菌丝长满斜面； (22) 所述的种子液培养基为：葡萄糖20-24g/L，蛋白胨30-34g/L，甘油20-22g/L，硝酸 钠2-4g/L，硫酸锌2-4g/L，磷酸二氢钾l-2g/L，经灭菌、冷却；用40-60mL无菌水洗涤步骤 (21)三角瓶斜面孢子后所得的斜面培养液，按照体积比为该种子液培养基的50-60%接种 到装有l〇〇ml该种子液培养基的三角瓶中，在30°C、180r/min的旋转式摇床上液态培养1 天； (23) 所述的液态摇瓶培养基为：淀粉16-18%、硝酸钠0. 4-0. 6%、酵母膏0. 6-0. 8%、 玉米浆0. 8-1 %与剩余量的水混合、用乳酸调节PH值为4. 0而制成的，经灭菌、冷却；将步 骤（22)所得的种子液培养种，按照体积比为该液态摇瓶培养基的50-60%的量接种到装有 100mL该液态摇瓶培养基的三角瓶中，在28°C、180r/min的条件下液态摇瓶培养2天； (3) 发酵处理： 以大米粉-甘油作为碳源，黄豆作为主要氮源，蛋白胨、玉米浆为辅料作为氮源、用乳 酸调节PH值而制成发酵培养基，将该发酵培养基装入三角瓶中，经高温灭菌后冷却至常 温，将步骤（23)所生产的液态摇瓶种，按体积百分比为6-8%的接种量接种于50ml该发酵 培养基中，于26°C发酵12天； (4) 深层液态发酵： 以步骤（3)所得的液态摇瓶种发酵液为基础，采用发酵罐、经分批间歇发酵、深层发酵 调节的优化，设定发酵培养工艺，进行深层液态发酵，得到功能红曲发酵液； (5) 发酵后处理： 将步骤（4)所得的功能红曲发酵液，采用罐组式连续逆流提取工艺进行提取，之后采 用厢式隔膜压滤机进行纯化、浓缩、精制，并进行喷雾干燥，得到低桔霉素高色价高活性成 分的功能性红曲粉。
3. 根据权利要求2所述的制取低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉的方法，特 征在于，所述的步骤（3)中发酵培养基为大米粉10-12g/L、甘油8-10g/L、黄豆6-8g/L、蛋白 胨l-3g/L、玉米浆2-4g/L、硫酸镁4. 5-6. Og/L、磷酸二氢钾l-2g/L、硝酸钠0· 4-0. 6g/L、酵 母膏0. 6-0. 8g/L，乳酸调节PH值为3. 5。
4. 根据权利要求2所述的制取低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉的方法， 特征在于，所述的步骤（4)中的发酵培养工艺为发酵罐采用30M 3发酵罐，初定发酵有效体 积为22. 0立方米，发酵时生长温度32-35°C，通风比为1:0. 3-0. 6,罐压0.4-0. 7MPa，时间 65-85h。
5. 根据权利要求2所述的制取低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉的方法，特 征在于，所述的步骤（5)中的罐组式连续逆流提取工艺为三级逆流提取，其中提取温度为 25-55°C、提取溶剂乙醇用量为5-15L/kg、提取时间为40-60min。
6. 根据权利要求2所述的制取低桔霉素高色价高活性成分的功能性红曲粉的方法，特 征在于，所述的步骤（5)中的厢式隔膜压滤机中超滤MWC010000、纳滤MWC0200。
7. -种采用权利要求1-6之一所述的方法制备的高活性成分功能性红曲粉，其特征在 于，其是由所述的红曲菌种分别经斜面培养基、种子液培养基、液态摇瓶培养基、发酵培养 基的接种培养、发酵，之后经深层液态发酵、三级逆流提取、超滤-纳滤技术浓缩精制、喷雾 干燥而得到的粉状制品。
8. 根据权利要求7所述的高活性成分功能性红曲粉，其特征在于，所述的斜面培养基 为可溶性淀粉3-5 %，麦芽糖3-5 %，蛋白胨2-4 %，琼脂2-4 %，硝酸钠0. 5-0. 8 %与剩余量 的水混合而成；所述的种子液培养基为葡萄糖20-24g/L，蛋白胨30-34g/L，甘油20-22g/ L，硝酸钠2-4g/L，硫酸锌2-4g/L，磷酸二氢钾l-2g/L;所述的液态摇瓶培养基为：淀粉 16-18%、硝酸钠0. 4-0. 6%、酵母膏0. 6-0. 8%、玉米浆0. 8-1 %与剩余量的水混合、用乳酸 调节PH值为4. 0 ;所述的发酵培养基为大米粉10-12g/L、甘油8-10g/L、黄豆6-8g/L、蛋白 胨l-3g/L、玉米浆2-4g/L、硫酸镁4. 5-6. Og/L、磷酸二氢钾l-2g/L、硝酸钠0. 4-0. 6g/L、酵 母膏0. 6-0. 8g/L，乳酸调节PH值为3. 5。
9. 根据权利要求7所述的高活性成分功能性红曲粉，其特征在于，所述的深层液态发 酵采用30M3发酵罐，初定发酵有效体积为22. 0立方米，发酵时生长温度32-35°C，通风比为 1: 0· 3-0. 6,罐压 0· 4-0. 7MPa，时间 65-85h。
10. 根据权利要求7所述的高活性成分功能性红曲粉，其特征在于，所述的三级逆流提 取中的提取温度为25-55°C、提取溶剂乙醇用量为5-15L/Kg、提取时间为40-60min ;所述的 超滤-纳滤技术采用厢式隔膜压滤机，其中超滤MWC010000、纳滤MWC0200。
【文档编号】C12R1/645GK104293680SQ201410379473
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年8月4日 优先权日:2014年8月4日
【发明者】胡文林, 谢凤娇, 陈影妮 申请人:东莞市天益生物工程有限公司, 广东天益生物科技有限公司