一种snp分子标记及hrm法进行猪肉dna溯源法
【专利摘要】本发明属于食品【技术领域】，提供猪肉DNA溯源的SNPs分子标记，同时提供利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法。本发明提供了10个SNP分子标记，彼此间相互独立，基因杂合度均至少是0.4，适合作为猪肉溯源的SNPs分子标记。本发明通过HRM法即高分辨率熔解曲线分析方法获得10个SNP分子标记，再由所获得的有效SNPs位点组成一个猪肉的SNPs信息组，进而进行猪肉DNA溯源。本发明基于SNPs分子标记采用的HRM法进行猪肉DNA溯源具有简单、快捷、低成本的特点，10个SNPs分子标记稳定广泛的存在于猪基因组DNA中，有助于DNA溯源技术的大规模推广。
【专利说明】-种SNP分子标记及HRM法进行猪肉DNA溯源法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品【技术领域】，涉及猪肉DNA溯源的SNP分子标记即单核苷酸多态性 标记，具体涉及利用HRM法即高分辨率熔解曲线分析方法进行猪肉DNA溯源的方法。
【背景技术】
[0002] 随着人们生活水平的提高，食品的安全性越来越受到人们的关注。肉制品作为人 类食物中蛋白质的主要来源，其安全性自然也备受关注，溯源技术越来越成为肉品安全保 障和监管的重要手段。
[0003] 肉类食品溯源的技术方法有很多，如标签溯源技术、虹膜溯源技术和DNA溯源技 术等。与其他溯源技术相比，DNA溯源技术具有易分型、便于规模化自动化检测等优点。它 不仅可以对活体动物进行溯源，还可以对胴体分割后的每一块肉，甚至是经过加工后的熟 肉进行溯源，能够真正的做到从生产到餐桌的全程溯源。可以大大强化政府部门的肉品质 量安全监管，提供有用的信息处理食品安全应急事件，将有助于社会的稳定。
[0004] DNA溯源技术的产生源于DNA的遗传与变异。它是通过分析特定的DNA分子标记， 获得动物个体的DNA指纹图谱从而达到鉴别个体、品种或是物种的目的。本研究选取了第 三代分子标记--SNPs标记（单核苷酸多态性标记）。目前，国内外相关的研究中，对于 SNPs标记的检测，主要采用两种方法，RFLP-PCR法和TaqMan探针法。但是RFLP-PCR法检 测时间长，TaqMan探针法检测费用高的缺点，这成为了 DNA溯源技术广泛应用的一个障碍。 因此，若能找到一种简单、快捷、低成本的检测方法，来代替这两种检测方法，将有助于DNA 溯源技术的大规模推广。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于解决现有技术中，猪肉DNA溯源方法操作复杂，检测周期长，成 本高等问题，通过HRM法即高分辨率熔解曲线分析方法检测取自猪肉的SNPs分子标记，达 到快速准确检测猪肉来源的目的。
[0006] 本发明的目的通过以下方法获得
[0007] 本发明提供一种用于猪肉DNA溯源的SNP分子标记，分别为：
[0008] SNP1 :序列如SEQ ID NO. 1所示，等位基因突变位点为：A/G ;
[0009] SNP2 :序列如SEQ ID N0. 2所示，等位基因突变位点为：C/T ;
[0010] SNP3 :序列如SEQ ID N0. 3所示，等位基因突变位点为：C/G ;
[0011] SNP4 :序列如SEQ ID N0. 4所示，等位基因突变位点为：A/G
[0012] SNP5 :序列如SEQ ID N0. 5所示，等位基因突变位点为：C/T
[0013] SNP6 :序列如SEQ ID N0. 6所示，等位基因突变位点为：A/G
[0014] SNP7 :序列如SEQ ID N0. 7所示，等位基因突变位点为：A/G
[0015] SNP8 :序列如SEQ ID N0. 8所示，等位基因突变位点为：A/G
[0016] SNP9 :序列如SEQ ID N0. 9所示，等位基因突变位点为：A/G
[0017] SNP10 :序列如SEQ ID NO. 10所示，等位基因突变位点为：A/G
[0018] 序列表中的η分别代表各个分子标记的突变位点。
[0019] 本发明还提供一种利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，包括如下步骤：
[0020] 1)从已发表文献或NCBI中选取SNPs位点，其中，SNPs位点应满足以下要求：Α.任 意相邻的SNP间的距离> 1Mb，保证SNPs间相互独立，不存在连锁现象；Β.任意SNP位点与 其他SNP位点不存在任何关联；3) SNP侧翼序列不存在任何变异；
[0021 ] 2)取猪肉、猪血或猪毛发样品彡299个，提取其DNA ;
[0022] 3)根据选取的SNPs位点，设计引物，利用HRM法对每个样品进行SNPs位点基因型 分析；计算出每个单核苷酸多态性SNP的等位基因频率及杂合度；
[0023] 4)记录每一样品的SNPs位点信息；
[0024] 5)后期，选择的步骤2)中的猪有问题，将有问题的猪肉按照步骤2)到4)的方法， 对作为DNA溯源的SNPs位点进行检测；
[0025] 6)将步骤5)得到的SNPs位点信息与步骤4)中记录的信息进行对比；
[0026] 7)根据溯源标记的SNPs的特征信息追溯猪肉来源。
[0027] 其中，步骤 1)中选择的文献为 Rohrer G A, Freking B A, Nonneman D. Single nucleotide polymorphisms for pig identification and parentage exclusion[J]. Animal Genetics, 2007, 38(3):253-258.
[0028] SNPs位点均为猪DNA基因组中的突变位点；猪肉、猪血或者猪毛的样品均取自不 同猪体，即每头猪身上要么取猪肉要么取猪血要么取猪毛发，猪样品均取自江苏淮安苏食 屠宰场。当然，本发明所用的猪肉样品的来源并无限制，任何需要进行跟踪溯源的猪肉都可 以作为检测样品，记录其SNPs位点信息，从而对猪肉样品进行溯源追踪，检测其质量。
[0029] 利用HRM法对每个样品进行SNPs位点基因型分析指的是利用设计好的测序引物 在实时荧光PCR扩增仪上进行荧光PCR扩增，通过获得的熔解曲线，进行分析从而得到每个 样品的每个SNP位点的基因型。本发明只提供10个SNP位点，即每个样品将获得10个SNP 位点的基因型。
[0030] 步骤6)中的SNPs位点信息指的是该猪肉样品中，在步骤1)中选择的10个SNP 位点上的基因型。
[0031] 3.上述2提供的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，其中，步骤3)中所用引物 分别为：
[0032] SNP1 :上游引物 snpl-f 如 SEQ ID N0. 11 所示；下游引物 snpl-r 如 SEQ ID N0. 12 所示；
[0033] SNP2 :上游引物 snp2-f 如 SEQ ID Ν0· 13 所示；下游引物 snp2-r 如 SEQ ID Ν0· 14 所示；
[0034] SNP3 :上游引物 snp3-f 如 SEQ ID Ν0· 15 所示；下游引物 snp3-r 如 SEQ ID Ν0· 16 所示；
[0035] SNP4 :上游引物 snp4-f 如 SEQ ID Ν0· 17 所示；下游引物 snp4-r 如 SEQ ID Ν0· 18 所示；
[0036] SNP5 :上游引物 snp5-f 如 SEQ ID Ν0· 19 所示；下游引物 snp5-r 如 SEQ ID Ν0· 20 所示；
[0037] SNP6 :上游引物 snp6-f 如 SEQ ID NO. 21 所示；下游引物 snp6-r 如 SEQ ID NO. 22 所示；
[0038] SNP7 :上游引物 snp7-f 如 SEQ ID NO. 23 所示；下游引物 snp7-r 如 SEQ ID NO. 24 所示；
[0039] SNP8 :上游引物 snp8-f 如 SEQ ID NO. 25 所示；下游引物 snp8-r 如 SEQ ID NO. 26 所示；
[0040] SNP9 :上游引物 snp9-f 如 SEQ ID NO. 27 所示；下游引物 snp9-r 如 SEQ ID NO. 28 所示；
[0041] SNP10 :上游引物 snpl〇-f 如 SEQ ID NO. 29 所示；下游引物 snpl〇-r 如 SEQ ID NO. 30所示。
[0042] 4.上述3提供的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，其中，步骤3)中进行SNPs 位点基因型分析时，反应条件为：95°C热启动反应lOmin ;95°C反应10s，touchdown程序 20s，72°C反应20s，20s末收集单个荧光，共进行40个循环；95°C反应lmin，60°C反应2min， 同时收集荧光信号，1个循环；60_95°C读取熔解曲线，20次/°C。
[0043] touchdown程序又叫递减程序。
[0044] 5.上述4提供的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，其中，步骤3)中touchdown 程序为：
[0045] SNP1 :64°C -56°C，每个循环下降 0· 5°C ;
[0046] SNP2 :65°C -56°C，每个循环下降 0· 5°C ;
[0047] SNP3 :65°C -56°C，每个循环下降 0· 5°C ;
[0048] SNP4 :64°C -54°C，每个循环下降 0· 5°C ;
[0049] SNP5 :65°C -56°C，每个循环下降 0· 5°C ;
[0050] SNP6 :64°C -54°C，每个循环下降 0· 5°C ;
[0051] SNP7 :64°C -54°C，每个循环下降 0· 5°C ;
[0052] SNP8 :62°C -52°C，每个循环下降 0· 5°C ;
[0053] SNP9 :64°C -54°C，每个循环下降 0· 5°C ;
[0054] SNP10 :62°C -52°C，每个循环下降 0· 5°C ;
[0055] 6.上述5提供的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，其中，步骤3)中计算每个 单核苷酸多态性SNP的公式为
【权利要求】
1. 一种用于猪肉DNA溯源的SNP分子标记，其特征在于：SNP分子标记为： SNP1 :序列如SEQ ID NO. 1所示，等位基因突变位点为：A/G ; SNP2 :序列如SEQ ID NO. 2所示，等位基因突变位点为：C/T ; SNP3 :序列如SEQ ID NO. 3所示，等位基因突变位点为：C/G ; SNP4 :序列如SEQ ID NO. 4所示，等位基因突变位点为：A/G SNP5 :序列如SEQ ID NO. 5所示，等位基因突变位点为：C/T SNP6 :序列如SEQ ID NO. 6所示，等位基因突变位点为：A/G SNP7 :序列如SEQ ID NO. 7所示，等位基因突变位点为：A/G SNP8 :序列如SEQ ID NO. 8所示，等位基因突变位点为：A/G SNP9 :序列如SEQ ID NO. 9所示，等位基因突变位点为：A/G SNP10 :序列如SEQ ID NO. 10所示，等位基因突变位点为：A/G。
2. -种利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，特征在于：包括如下步骤： 1) 从已发表文献或NCBI中选取SNPs位点，其中，SNPs位点应满足以下要求：A.任意 相邻的SNP间的距离> 1Mb，保证SNPs间相互独立，不存在连锁现象；B.任意SNP位点与其 他SNP位点不存在任何关联；C. SNP侧翼序列不存在任何变异； 2) 取猪肉、猪血或猪毛发样品彡299个，提取其DNA; 3) 根据选取的SNPs位点，设计引物，利用HRM法对每个样品进行SNPs位点基因型分 析；计算出每个单核苷酸多态性SNP的等位基因频率及杂合度； 4) 记录每一样品的SNPs位点信息； 5) 后期，选择的步骤2)中的猪有问题，将有问题的猪肉按照步骤2)到4)的方法，对作 为DNA溯源的SNPs位点进行检测； 6) 将步骤5)得到的SNPs位点信息与步骤4)中记录的信息进行对比； 7) 根据溯源标记的SNPs的特征信息追溯猪肉来源。
3. 权利要求2所述的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，特征在于：步骤3)中所用 引物分别为： SNP1 :上游引物snpl-f如SEQ ID NO. 11所示；下游引物snpl-r如SEQ ID NO. 12所 示； SNP2:上游引物snp2-f如SEQ ID NO. 13所示；下游引物snp2-r如SEQ ID NO. 14所 示； SNP3:上游引物snp3-f如SEQ ID NO. 15所示；下游引物snp3-r如SEQ ID NO. 16所 示； SNP4:上游引物snp4-f如SEQ ID NO. 17所示；下游引物snp4-r如SEQ ID NO. 18所 示； SNP5:上游引物snp5-f如SEQIDN(λl9所示；下游引物snp5-r如SEQIDN(λ20所 示； SNP6:上游引物snp6-f如SEQIDN0·21所示；下游引物snp6-r如SEQIDN0·22所 示； SNP7:上游引物snp7-f如SEQ ID NO. 23所示；下游引物snp7-r如SEQ ID NO. 24所 示； SNP8:上游引物snp8-f如SEQ ID NO. 25所示；下游引物snp8-r如SEQ ID NO. 26所 示； SNP9:上游引物snp9-f如SEQ ID NO. 27所示；下游引物snp9-r如SEQ ID NO. 28所 示； SNP10 :上游引物 snpl〇-f 如 SEQ ID NO. 29 所示；下游引物 snpl〇-r 如 SEQ ID NO. 30 所示。
4. 权利要求3所述的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，特征在于：步骤3)中进 行SNPs位点基因型分析时，反应条件为：95°C热启动反应lOmin ;95°C反应10s，touchdown 程序20s，72°C反应20s，20s末收集单个荧光，共进行40个循环；95°C反应lmin，60°C反应 2min，同时收集荧光信号，1个循环；60-95°C读取熔解曲线，20次/°C。
5. 权利要求4所述的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，特征在于：步骤3)中 touchdown 程序为： SNP1 :64°C -56°C，每个循环下降 0· 5°C ; SNP2 :65°C -56°C，每个循环下降 0· 5°C ; SNP3 :65°C -56°C，每个循环下降 0· 5°C ; SNP4 :64°C -54°C，每个循环下降 0· 5°C ; SNP5 :65°C -56°C，每个循环下降 0· 5°C ; SNP6 :64°C -54°C，每个循环下降 0· 5°C ; SNP7 :64°C -54°C，每个循环下降 0· 5°C ; SNP8 :62°C -52°C，每个循环下降 0· 5°C ; SNP9 :64°C -54°C，每个循环下降 0· 5°C ; SNP10 :62°C -52°C，每个循环下降 0· 5°C。
6. 权利要求5所述的利用HRM法进行猪肉DNA溯源的方法，特征在于：步骤3)中计算 11 每个单核苷酸多态性SNP的的公式为//= l-Epi2。 i=1
7. 权利要求1所述的SNP分子标记在猪肉检测中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104152447SQ201410390913
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】周光宏, 杨萨萨, 李春保, 徐幸莲, 吴洽宇 申请人:南京农业大学