一种食品中空肠弯曲杆菌的定性检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明属于食品安检测领域，具体涉及一种食品中空肠弯曲杆菌快速定性检测试剂盒及检测方法。所述的检测试剂盒包括培养基、检测液，所述的培养基为加入了生长促进剂的Bolton肉汤，所述的检测液由以下含量的组分组成：10PCR?Buffer缓冲液1-2.5μl、TaqDNA聚合酶0.1-0.5μl、dNTP1-2μl、Tris.Cl5-10ml、KCl0.5-2.5ml、MgCl0.5-2.5ml、增菌液2-6ml、100bpDNA?Ladder?Marker0.1-0.5μl、PCR引物1-2μl。采用该试剂盒可定性检测食品中空肠弯曲杆菌，检测时间短、灵敏度及准确度高、特异性强、可明显提高检测阳性率。
【专利说明】一种食品中空肠弯曲杆菌的定性检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品中微生物的检测试剂盒及检测方法，尤其涉及食品中空肠弯曲杆 菌的检测。
【背景技术】
[0002] 空肠弯曲杆菌是引起全球人类及动物食源性细菌胃肠炎的主要原因，可引起急性 肠炎及腹泻，报道显示，空肠弯曲杆菌感染占所有食源性细性菌感染的47%，能导致散发性 和地方流行性胃肠炎爆发，尤其以恶性肿瘤、艾滋病、慢性疾病、儿童及老年人发病率最高， 此外，还可引起格林巴利综合征（GBS)，反应性关节炎、心内膜炎等多种并发疾病，其中格林 巴利综合征（GBS)是最严重的并发症，可致感染者死亡。
[0003] 空肠弯曲杆菌的主要寄主为动物，包括家禽、家畜、家养鸟类等，其次，未经加工的 肉制品、生牛奶等也是其主要载体，人类可通过食用这些食物或饮用被动物粪便污染且未 处理好的水源而感染空肠弯曲杆菌致病，因此，对人类健康和食品安全均构成较大的危胁。 目前，空肠弯曲杆菌引起的胃肠现病例数已超过沙门氏菌及李斯特菌，其作为一项感染率 极高的致病菌，目前已作为食品安全、畜牧兽医及公共卫生等领域的常规监测指标。
[0004] 传统的检测与分离方法为生化及血清凝集试验，但培养周期长、检验程序复杂、确 诊检验结果需10-20d，且报告结果差异大，该菌生长条件苛刻，食品中该菌数量极少，传统 的选择性富集培养，很难从样品中检出，且该菌还存在一种"存在但不可培养"的状态，给传 统方法检出带来极大的困难。因此，寻求一种能对食品空肠弯曲杆菌进行快速检测、检测灵 敏度度且的方法十分重要。
[0005] 变性高效液相色谱（DHPLC)通过反相高效液相色谱原理，对核苷酸片段分子进行 分离，操作全自动化，准确度和灵敏度高，但对于食品中空肠弯曲杆菌含量极低时，检测结 果并不十分准确。本发明提供一种检测灵敏度高、准确性高、可检测极低水平空肠弯曲杆菌 的检测试剂盒及检测方法。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术的缺陷，本发明提供一种检测灵敏度高、准确性高、可检测极低 水平空肠弯曲杆菌的检测试剂盒及检测方法。
[0007] -种食品中空肠弯曲杆菌快速定性检测试剂盒，包括培养基、检测液，所述的培养 基为加入了生长促进剂的Bolton肉汤，所述的检测液由以下组分组成：
[0008] 10PCR 缓冲液 1-2.5 μ 1 ?l'aqDNA 聚介丨骑 0.1-0.5 μ 1 dNTP 1-2 μ 1 Tris.Cl 5-10ml KC1 0.5-2.5ml MgCl 0.5-2.5ml 增菌液 2-6 ml lOObp DNA Ladder Marker 0.1-0.5 μ 1 PCR 引物 1-2μ1
[0009] 所述的生长促进剂浓度为〇· 5-1. Og/L。
[0010] 所述的生长促进剂选自焦亚硫酸钠、丙酮酸钠或硫酸亚铁的一种或多种，所述的 焦亚硫酸钠、丙酮酸钠及硫酸亚铁的重量比为4 : (2-5) : (1-3)
[0011] 所述的 PCR 引物为：C16S-F :5' -CTG CTT AAC ACAAGT TGA GTA GG-3'（183 ? 205)，C16S-R :5' -TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3'（449 ?468)。
[0012] 优选的，所述的Taq DNA聚合酶浓度为2-5U/ μ 1，所述的dNTP浓度为5-10mmol/ L，所述的KCl、MgCl的浓度为20-50mmol/L，所述的PCR引物浓度为10-25ymol/L。
[0013] 一种采用如上所述的试剂盒检测食品中空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤：
[0014] (1)取待测样品5-10mg，研碎，接种于培养基中，于微需氧条件下培养；
[0015] (2)取增菌液接种于步骤（1)中的培养基中，按细菌基因组小量提取待测样品 DNA ；
[0016] (3)将步骤（2)中待测样品DNA加入检测液中，并加入灭菌超纯水，离心，进行PCR 反应，94°C变性、72 °C变性，进入循环，35个循环后72 °C终止延伸，制得样品PCR产物；
[0017] (4)DHPLC 分析：色谱柱：PS-DVB ;C18DNAS印；柱温 40-50 °C ;色谱柱： 4. 5mmX50mm流动相体积比：0、30s、60s、120s、240s时缓冲溶液A :缓冲溶液B之比分 别为：（55 % : 45 % )、（50. 2 % : 49. 8 % )、（44. 2 % : 55. 8 % )、（40. 9 % : 59. 1 % )、 (38.8% : 61.2%);流速：（0.5-0. 8)ml/min;进样量：PCR 产物（2-5) μ 1;PCR 检测器：荧 光检测器。
[0018] 优选的，步骤（4)中所述的缓冲溶液A为TEAA水溶液，其浓度为0. 5-0. 8mmol/L。
[0019] 优选的，步骤（4)中所述的缓冲溶液B为缓冲溶液A与乙腈的混合溶液，所述的缓 冲溶液A与乙腈的体积比为（4-6) : (1-2)。
[0020] 步骤⑷中所述的荧光检测器的光源为Xenon灯，功率为150W。
[0021] 与现有技术相比，本发明的优点为：
[0022] (1)本发明是一种新型DNA检测方法，是在常规PCR技术基础上发展起来的一种新 型检测技术，可用于空肠弯曲杆菌的定性检测，将PCR及DHPLC等技术的优点相互综合，检 测结果特异性强，灵敏度高，保证了食品空肠弯曲杆菌的有效检测。
[0023] (2)本发明操作简单，不需要电泳及PCR产物纯化，整个检测过程仅需12h左右，与 传统检测方法相比，检测时间明显缩短，为食品致病菌检测提供技术支持，能满足检测部门 对样品的快速检测需求，为食品安全监督提供了有力的保障。
[0024] (3)本发明在检测前采用加入了生长促进剂的Bolton肉汤对样品进行培养增菌， 提高了检测阳性率，降低了假阴性率的发生。
【具体实施方式】
[0025] 本发明中PCR引物购自美国ATCC标准生物品收藏中心，微需氧条件采用微需氧袋 实现。
[0026] 实施例1
[0027] -种食品中空肠弯曲杆菌快速定性检测试剂盒，包括培养基、检测液，所述的培养 基为加入了浓度为〇. 5g/焦亚硫酸钠的Bolton肉汤，所述的检测液由以下组分组成：
[0028] 10PCR Buffer 缓冲液 1 μ 1 TaqDNA 聚合酶 0.1 μ 1 dNI'l·5 I μ 1 Tris.C! 5ml KC1 0.5ml MgCl 0.5ml 增菌液 2 ml lOObp DNA ladder Marker 0.! μ 1 PCR引物 1 μ?
[0029] 所述的 PCR 引物为：C16S-F :5' -CTG CTT AAC ACAAGT TGA GTA GG-3'（183)， C16S-R:5' -TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3'（449)。
[0030] 所述的Taq DNA聚合酶浓度为2U/ μ 1，所述的dNTP浓度为5mmol/L，所述的KC1、 MgCl的浓度为20mmol/L，所述的PCR引物浓度为10 μ mol/L。
[0031] 一种采用如上所述的试剂盒检测食品中空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤：
[0032] (1)取待测样品5mg，研碎，接种于培养基中，于微需氧条件下培养；
[0033] (2)取增菌液接种于步骤（1)中的培养基中，按细菌基因组小量提取待测样品 DNA ；
[0034] (3)将步骤（2)中待测样品DNA加入检测液中，并加入灭菌超纯水，离心，进行PCR 反应，94°C变性、72°C变性，进入循环，35个循环后72°C终止延伸，制得样品PCR产物；
[0035] (4)DHPLC 分析：色谱柱：PS-DVB ;C18DNAS印；柱温 40°C ;色谱柱：4. 5mmX50mm ;流 动相体积比：〇、3〇8、6〇8、12〇8、24〇 8时缓冲溶液4:缓冲溶液8之比分别为：（55%:45%)、 (50. 2% : 49. 8% )、（44. 2% : 55. 8% )、（40. 9% : 59. 1% )、（38. 8% : 61. 2% );流速： (0. 5-0. 8)ml/min ;进样量：PCR产物（2-5) μ 1 ;PCR检测器：荧光检测器。
[0036] 步骤⑷中所述的缓冲溶液A为TEAA水溶液，其浓度为0. 5mmol/L。
[0037] 优选的，步骤（4)中所述的缓冲溶液B为缓冲溶液A与乙腈的混合溶液，所述的缓 冲溶液A与乙腈的体积比为4 : 1。
[0038] 步骤⑷中所述的荧光检测器的光源为Xenon灯，功率为150w。
[0039] 实施例2
[0040] 一种食品中空肠弯曲杆菌快速定性检测试剂盒，包括培养基、检测液，所述的培养 基为加入了生长促进剂的Bolton肉汤，所述的检测液由以下组分组成：
[0041] 10PCR Buffer 缓冲液 2.5 μ 1 TaqDNA 聚合酶 0.5 μ 1 dNTP 2 μ 1 Tris.Cl 10ml KC1 2.5ml MgCl 2.5ml 増菌液 6 ml lOObp Y)N/\ Ladder Marker 0.5 μ 1 PCR弓丨物 2p1
[0042] 所述的生长促进剂浓度为丙酮酸钠，浓度为1. 0g/L。
[0043] 所述的 PCR 引物为：C16S-F :5' -CTG CTT AAC ACAAGT TGA GTA GG-3'（183 ? 205)，C16S-R :5' -TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3'（449 ?468)。
[0044] 所述的Taq DNA聚合酶浓度为5U/ μ 1，所述的dNTP浓度为0mmol/L，所述的KC1、 MgCl的浓度为50mmol/L，所述的PCR引物浓度为25umol/L。
[0045] 一种采用如上所述的试剂盒检测食品中空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤：
[0046] (1)取待测样品10mg，研碎，接种于培养基中，于微需氧条件下培养；
[0047] (2)取增菌液接种于步骤（1)中的培养基中，按细菌基因组小量提取待测样品 DNA ；
[0048] (3)将步骤（2)中待测样品DNA加入检测液中，并加入灭菌超纯水，离心，进行PCR 反应，94°C变性、72 °C变性，进入循环，35个循环后72 °C终止延伸，制得样品PCR产物；
[0049] (4)DHPLC 分析：色谱柱：PS-DVB ;C18DNAS印；柱温 50°C ;色谱柱：4. 5mmX50mm ; 流动相体积比：0、30s、60S、120S、240s时缓冲溶液A :缓冲溶液B之比分别为： ((55 % ： 45 % ), (50. 2 % ： 49. 8 % ), (44. 2 % ： 55. 8 % ), (40. 9 % ： 59. 1 % ), (38. 8% : 61.2%);流速：0. 8)ml/min;进样量：PCR产物5μ1 ;PCR检测器：荧光检测器。
[0050] 优选的，步骤（4)中所述的缓冲溶液A为TEAA水溶液，其浓度为0. 8mmol/L。
[0051] 优选的，步骤（4)中所述的缓冲溶液B为缓冲溶液A与乙腈的混合溶液，所述的缓 冲溶液A与乙腈的体积比为6 : 2。
[0052] 步骤⑷中所述的荧光检测器的光源为Xenon灯，功率为150w。
[0053] 实施例3
[0054] -种食品中空肠弯曲杆菌快速定性检测试剂盒，包括培养基、检测液，所述的培养 基为加入了生长促进剂的BoRon肉汤，所述的检测液由以下组分组成：
[0055] 101X:R 1?.'缓冲液 1.5 μ 1 TaqDNA 聚合酶 0.3 μ 1 dNTP 1.5 μ I I'ris.Cl 8m 1 KC1 1.5mi MgCI .1,5ral 増菌液 4 ml lOObp ].)ΝΛ Ladder Marker 0.3 μ 1 PCR 引物 1.5 μ 1
[0056] 所述的生长促进剂浓度为焦亚硫酸钠、丙酮酸钠及硫酸亚铁的混合物，，所述的焦 亚硫酸钠、丙酮酸钠及硫酸亚铁的重量比为4 : 2 : 1,浓度为0. 8g/L。
[0057] 所述的 PCR 引物为：C16S-F :5' -CTG CTT AAC ACAAGT TGA GTA GG-3'（183 ? 205)，C16S-R :5' -TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3'（449 ?468)。
[0058] 所述的Taq DNA聚合酶浓度为3. 5υ/μ 1，所述的dNTP浓度为8mmol/L，所述的 KCl、MgCl的浓度为35mmol/L，所述的PCR引物浓度为18umol/L。
[0059] -种采用如上所述的试剂盒检测食品中空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤：
[0060] (1)取待测样品8mg，研碎，接种于培养基中，于微需氧条件下培养；
[0061] (2)取增菌液接种于步骤（1)中的培养基中，按细菌基因组小量提取待测样品 DNA ；
[0062] (3)将步骤（2)中待测样品DNA加入检测液中，并加入灭菌超纯水，离心，进行PCR 反应，94°C变性、72 °C变性，进入循环，35个循环后72 °C终止延伸，制得样品PCR产物；
[0063] (4)DHPLC 分析：色谱柱：PS-DVB ;C18DNAS印；柱温 45°C ;色谱柱：4. 5mmX50mm ; 流动相体积比：0、30s、60S、120S、240s时缓冲溶液A :缓冲溶液B之比分别为： ((55 % ： 45 % ), (50. 2 % ： 49. 8 % ), (44. 2 % ： 55. 8 % ), (40. 9 % ： 59. 1 % ), (38.8% : 61.2%);流速：（0.5-0. 8)ml/min;进样量：PCR 产物（2-5) μ 1;PCR 检测器：荧 光检测器。
[0064] 步骤⑷中所述的缓冲溶液A为TEAA水溶液，其浓度为0. 65mmol/L。
[0065] 步骤（4)中所述的缓冲溶液B为缓冲溶液A与乙腈的混合溶液，所述的缓冲溶液 A与乙腈的体积比为5 : 1.5。
[0066] 步骤（4)中所述的荧光检测器的光源为Xenon灯，功率为150w。
[0067] 上述实施例仅为本发明的优选实施方式，并不应理解为对本发明的限定，本领域 技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保 护范围之内。
【权利要求】
1. 一种食品中空肠弯曲杆菌快速定性检测试剂盒，其特征在于，包括培养基、检测液， 所述的培养基为加入了生长促进剂的Bolton肉汤，所述的检测液由以下含量的组分制成： 10PCR Buffer 缓冲液 1-2.5 μ 1, Taq DNA 聚合酶 0.1-0.5 μ 1, dN'l'P 1-2 ]J 1, Iris.Cl 5-10ml. KC1 0.5-2.5mL MgCl 0.5-2.5ml, 增菌液 2-6 ml, IOObp DNA Ladder Marker 0.1-().5 μ 1, PCR 引物 1-2μ1〇
2. 根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于，所述的生长促进剂选自焦亚硫酸 钠、丙酮酸钠或硫酸亚铁中的一种或多种。
3. 根据权利要求2所述的一种试剂盒，其特征在于，所述的焦亚硫酸钠、丙酮酸钠和硫 酸亚铁的重量比为4 : (2-5) : (1-3)。
4. 根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于，所述的生长促进剂浓度为 0. 5-1. 0g/L〇
5. 根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于，所述的PCR引物为：C16S-F: 5'-CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG-3'（183 ?205)，C16S-R :5'-TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3'（449 ?468)。
6. 根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于，所述的Taq DNA聚合酶浓度为 2-5υ/μ 1，所述的dNTP浓度为5-10mmol/L，所述的KC1、MgCl的浓度为20-50mmol/L，所述 的PCR引物浓度为10-25 μ mol/L。
7. -种采用如权利要求1-6所述的试剂盒检测食品中空肠弯曲杆菌的方法，其特征在 于包括以下步骤： (1) 取待测样品5-10mg，研碎，接种于培养基中，于微需氧条件下培养； (2) 取增菌液接种于步骤（1)中的培养基中，按细菌基因组小量提取待测样品DNA; (3) 将步骤（2)中待测样品DNA加入检测液中，并加入灭菌超纯水，离心，进行PCR反 应，94°C变性、72 °C变性，进入循环，35个循环后72 °C终止延伸，制得样品PCR产物； (4) DHPLC 分析：色谱柱：PS-DVB ;C18DNAS印；柱温 40-50°C ;色谱柱：4. 5mmX50mm ;流 动相体积比：〇、3〇8、6〇8、12〇8、24〇 8时缓冲溶液4:缓冲溶液8之比分别为：（55%:45%)、 (50. 2% : 49. 8% )、（44. 2% : 55. 8% )、（40. 9% : 59. 1% )、（38. 8% : 61. 2% );流速： (0. 5-0. 8)ml/min ;进样量：PCR产物（2-5) μ 1 ;PCR检测器：荧光检测器。
8. 根据权利要求7所述的一种检测食品中空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，步骤（4) 中所述的缓冲溶液A为TEAA水溶液，其浓度为0. 5-0. 8mmol/L。
9. 根据权利要求7所述的一种检测食品中空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，步骤（4) 中所述的缓冲溶液B为缓冲溶液A与乙腈的混合溶液，所述的缓冲溶液A与乙腈的体积比 为（4-6) : (1-2)。
10.根据权利要求7所述的一种检测食品中空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，步骤 (4)中所述的荧光检测器的光源为Xenon灯，功率为150w。
【文档编号】C12Q1/04GK104195239SQ201410403714
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】郭狄 申请人:中山鼎晟生物科技有限公司