一种发酵黄芪的制备方法及其总皂苷的提取方法

一种发酵黄芪的制备方法及其总皂苷的提取方法
【专利摘要】本发明提供一种发酵黄芪的制备方法，是将黄芪用非解乳糖链球菌LZMYFGM9，保藏编号CGMCC?No.4227的菌株发酵得到的；本发明还提供一种发酵黄芪总皂苷的提取方法，步骤如下:（1）将发酵黄芪用80%～90%乙醇温浸提取，优选用85%乙醇温浸提取；得到醇提发酵黄芪流浸膏；（2）将步骤（1）得到的醇提发酵黄芪流浸膏用水饱和正丁醇萃取，得提取液；（3）将提取液上样于大孔吸附树脂柱吸附，洗脱，收集洗脱液，将洗脱液进行后处理，得到纯化后的发酵黄芪总皂苷。应用本发明的提取方法进一步提高了皂苷的纯度，达到86%～92%。
【专利说明】一种发酵黄芪的制备方法及其总皂苷的提取方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程和医药【技术领域】，具体涉及发酵黄芪的制备方法及其总皂苷 的提取方法。

【背景技术】
[0002] 黄芪（Radix Astragalus)是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根。味甘，性微 温，具有益气补虚之功效。黄芪总皂苷包括十几种皂苷类物质，具有抗菌、消炎、抗肿瘤、降 血压、抗心肌缺氧、中枢镇痛、镇静等作用，是黄芪的主要的有效成分，其在生药中的含量为 0.095 %?0.223 %。由于含量较低，因此，研究人员一方面不断开发黄芪总皂苷的高效分 离提取技术，另一方面致力于通过生物转化的方法合成具有生物活性的黄芪皂苷。
[0003] 微生物转化是指通过微生物整体细胞或酶系将复杂的底物进行结构修饰，这种催 化反应具有条件温和、反应专一、污染小等特点。建立合理的中药微生物转化工艺后，能够 在得到收率较高的目标产物的同时，综合利用药物中的其它有效成分，大大节省原料，降低 生产成本，达到综合利用中药材有效成分的目的。常用的微生物转化中药有效成分的方法 有液体发酵法和固体发酵法。
[0004] 非解乳糖链球菌LZMYFGM9 (保藏编号：CGMCC No. 4227)分泌的很多酶类可参与生 物转化过程，但是，应用该菌发酵黄芪，黄芪中总皂苷的变化目前尚不清楚，对于应用该菌 发酵黄苗的阜苷的分离提取方法，尚未见有研究报道。
[0005] 保藏信息： 非解乳糖链球菌1^]\^：76]\19的拉丁文分类命名为5^-61/7(0〃0<^^/ >5<3^3<^0心^/<^/5·; 保藏日期：2010年10月19日； 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； 保藏单位简称：CGMCC ; 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号； 保藏编号：CGMCC No. 4227。


【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提出一种经济、高效的发酵黄芪的制备方法及其总 皂苷的提取方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 本发明提供一种发酵黄芪的制备方法，步骤如下：将洁净的黄芪生药饮片粉碎后，发酵 黄芪，发酵菌株CGMCC No. 4227的菌液浓度为2 X 106?2 X 108个/mL，接菌量为4%?5%(占 发酵总体积)，黄芪用量为8% (黄芪质量：发酵液体积，g:mL)，温度38°C?39°C，转速200r/ min，pH值5. 5?6. 5,溶氧量5%?10%，中和剂为6mol/L的NaOH，发酵时间44h?52h， 发酵结束后，冻干发酵黄芪液得发酵黄芪产品；优选地，发酵菌株CGMCC No. 4227的菌液浓 度为2X 108个/mL，接菌量为5% (占发酵总体积)，黄芪用量为8% (黄芪质量：发酵液体积， g:mL)，温度39°C，转速200r/min，pH值6. 4,溶氧量10%，中和剂为6mol/L的NaOH，发酵时 间 48h。
[0008] 上述发酵条件是经正交试验后得到的最佳值。
[0009] 本发明的制备方法具有以下优点： 本发明中的黄芪发酵工艺使用10L三联发酵罐，生产操作简便，反应条件容易控制(发 酵过程中能够实现实时自动调节pH值、溶氧值，温度、转速等参数也能达到精确控制)，因而 发酵产品质量更稳定，批间差异小。同时，本方法工业化程度高，生产成本低，提高了原料的 利用率，增强了产品的市场竞争力。
[0010] 优选地，所述发酵黄芪过程中使用的液体培养基由以下重量份数的成分制备完 成：乳清粉：24?27份；蛋白胨：2. 2?2. 4份；葡萄糖：0. 5?0. 7份；酵母粉：1. 4?1. 7 份；硫酸镁：〇. 03?0. 05份；柠檬酸三铵：0. 30?0. 50g ;硫酸氢二钾：0. 30?0. 50g ;乙酸 钠：0· 90?1. 10g ;黄芪粉：80?100份；水：900?1100份。
[0011] 实验研究发现，发酵菌株CGMCC No. 4227的正常生长需要能源、碳源、氮源、矿质 元素、水和生长因子等，实验室过去采用的培养基为"一种提取黄芪多糖的发酵培养基" (201210141832. 6)中所述的培养基，其中，无机盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，缺乏Na、Mg 等主要矿质元素及无机物铵盐等氮源物质。本发明加入上述营养成分后，同时，对培养基组 分进行优化结合单因素实验和响应面分析，得出培养基最佳组分及各组分比例，使用该培 养基发酵菌株CGMCC No. 4227的生长状态明显改善。
[0012] 更优选地，所述发酵黄芪过程中使用的液体培养基由以下重量份数的成分制备完 成：乳清粉：25. 79份；蛋白胨：2. 28份；葡萄糖：0. 60份；酵母粉：1. 56份；硫酸镁：0. 04 份；梓檬酸三铵：〇. 40份；硫酸氢二钾：0. 40份；乙酸钠：1. 00份；黄芪粉：80份；水：1000 份。
[0013] 本发明还提供上述发酵黄芪作为饲料添加剂的应用。
[0014] 本发明的第三个目的是提供一种饲料添加剂，所述饲料添加剂的有效成分为权利 要求1所述的发酵黄芪。
[0015] 本发明的第四个目的是提供一种发酵黄芪总皂苷的提取方法，步骤如下： 1)将上述发酵黄芪用80%?90%乙醇温浸提取，优选用85%乙醇温浸提取，得到醇提发 酵黄芪流浸膏；优选地，所述流浸膏中lg流浸膏含0.9?1. lg生药黄芪。
[0016] 2)将步骤（1)得到的醇提发酵黄芪流浸膏用水饱和正丁醇萃取，得提取液； 3)将提取液上样于大孔吸附树脂柱吸附，洗脱，收集洗脱液，将洗脱液进行后处理，得 到纯化后的发酵黄芪总皂苷。
[0017] 优选地，所述温浸提取是将发酵黄芪用80%?90%乙醇室温下密闭浸泡6h?10h， 83°C?86°C温浸lh?2h，过滤，滤渣再重复提取1次；优选地，所述温浸提取是将发酵黄芪 用85%乙醇室温下密闭浸泡8h，85°C温浸lh，过滤，滤渣再重复提取1次。
[0018] 温浸提取中选择上述参数进行提取时，提取率最高。
[0019] 优选地，所述温浸提取时每lg发酵黄芪用20ml 85%乙醇温浸提取。
[0020] 该比例是单因素实验优选出的，在上述条件下发酵黄芪流浸膏得率及其中总皂苷 含量最1?。
[0021] 优选地，步骤（2)中用水饱和正丁醇萃取时，沿同一方向匀速轻微振摇，待稍静止 后，再反方向轻微振摇。
[0022] 优选地，步骤（3)中所述大孔吸附树脂为AB-8或D101 ;优选为AB-8。
[0023] 优选地，步骤（3)中所述洗脱是先用30%乙醇洗脱，弃洗脱液；该极性段物质对大 孔树脂吸附力较弱，不是总皂苷类，故弃去洗脱液；再用70%?90%%乙醇洗脱，收集洗脱液。 该极性段物质对大孔树脂吸附力较强，为发酵黄芪总皂苷类，故收集洗脱液。优选地，所述 洗脱是先用30%乙醇洗脱，弃洗脱液；再用85%乙醇洗脱，收集洗脱液。
[0024] 进一步地，提取后洗脱液经浓缩干燥后，发酵黄芪总皂苷含量达78. 52%? 88.39%。
[0025] 本发明利用一株分离自鸡肠道的非解乳糖链球菌LZMYFGM9,保藏编号为：CGMCC No. 4227与中药黄芪共发酵，开发出发酵黄芪产品。该产品作为饲料添加剂能够增强肉仔鸡 生长性能，提高免疫力。皂苷是发酵黄芪产品的主要药效物质之一，研究报道，消化道中细 菌产生的酶选择性地分解皂苷类成分，引起结构的转变，使其分解为苷元和糖基。(如Kim等 人利用七叶苷-R2A筛选出70株表现出β -糖苷酶活性的菌株，其中12株能转化Rbl为Rd， 哀中三株舊Burkholeria pyrrocinia GP16, Bacillus megaterium 私Sphingomonas ecAifloiofes GP50能在48小时内完全转化。Dong等筛选了 49种微生物以考察对人参阜苷 Rgl的转化，实验发现黑曲霉AS3. 1858和蓝色犁头霉AS3. 3538能转化Rgl为Rhl，转化率 为80. 9%。）由于苷元的极性大大低于分解前的皂苷，所以更容易被肠道吸收进而进入血液， 发挥药效作用。通过微生物转化，有望提高有药效作用的皂苷的含量，产生新的皂苷种类， 发现新的药理活性。此外，生物转化水解苷类还具有保护环境，降低生产成本等优势，应用 于工业化生产，将对医药产业的发展做出贡献。因此，发酵黄芪总皂苷显示出较好的开发应 用前景。
[0026] 本发明还对发酵黄芪总皂苷提取分离的工艺进行了考察，采用香草醛-硫酸法， 以黄芪甲苷为标准品，检测皂苷含量，得到了发酵黄芪总皂苷的最佳提取方法。同时，也为 其它液体发酵中药皂苷的提取提供参考方法。
[0027] 本发明提取方法的效果和益处： 1、先用85%乙醇温浸发酵黄芪得到醇溶部分提取总皂苷成分，药渣用于提取其它有效 成分，利于发酵产品有效成分的充分开发和高效利用。
[0028] 2、将正丁醇法和大孔吸附树脂法相结合，进一步提高了总皂苷的纯度，达到86 % ?92 %〇
[0029] 3、经过正丁醇的纯化，总皂苷的颜色已经很浅，且可回收正丁醇重复使用，省去了 大孔树脂柱中用乙醚脱色的步骤，达到了节约资源的效果。
[0030] 4、本发明通过对大孔树脂AB-8与D101的总皂苷的富集效果进行比较，发现AB-8 优于D101，具有总皂苷提取效率高、纯度高等特点，并且填料可反复利用、资源浪费少、操作 简便、易于推广及扩大生产。

【具体实施方式】
[0031] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0032] 本发明中发酵黄芪总皂苷含量的测定采用香草醛-硫酸法，步骤如下： a、 标准曲线的制作：用无水乙醇溶解黄芪甲苷标准品，配制成浓度为0. 5 mg/mL的标 准品溶液。分别吸取〇. 15 mL、0. 3 mL、0. 45 mL、0. 6 mL、0. 75 mL至试管，补加无水乙醇至 0. 75 mL。随行用0.75 mL无水乙醇做空白。精密加入8 %香草醛-无水乙醇溶液0.75 mL， 于冰浴中加入72 % H2S04 7.5 mL，摇匀，置于62 °C水浴中恒温静置20 min后取出。冰浴 冷却至室温，摇匀。30 min内于544 nm处测定吸光度，以黄芪甲苷浓度为横坐标（X)，吸光 度值(A)为纵坐标（y)，进行线性回归，绘制标准曲线。标准曲线方程为：y=l. 3326X+0. 0117 (R2=0. 9997)，其中：y为吸光度值，X为黄芪甲苷浓度（mg/mL)，R2为相关系数； b、 总皂苷含量测定：用无水乙醇将制得的发酵黄芪总皂苷配成浓度为0.5 mg/mL的溶 液，取0.75 mL按步骤a的方法测定544 nm的吸光度值，根据标准曲线计算发酵黄芪总皂 苷的浓度； c、 发酵黄芪总皂苷含量（％)=(标准曲线计算得皂苷质量/纯化得到发酵黄芪皂苷质 量）X100% d、 发酵黄芪纯化后总皂苷得率（％)=(纯化得到总皂苷的质量/发酵黄芪产品的质 量）X100%。
[0033] 本发明所用的非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus)LZMYFGM9的保藏 编号为CGMCC No. 4227。该菌种的培养特性见中国专利201210141827.5 (发明名称：一种 非解乳糖链球菌及其应用）。
[0034] 实施例1 本发明的发酵黄芪的制备方法为： 将洁净的黄芪生药饮片粉碎后，过20目筛，用10L发酵罐发酵黄芪，发酵菌株LZMYFGM9 的菌液浓度为2X 108个/mL，接菌量为5% (占发酵总体积)，黄芪用量为8% (黄芪质量：发酵 液体积，g:mL)，温度39°C，转速200r/min，pH值6. 4,溶氧量10%，中和剂为6mol/L的NaOH， 发酵时间48h。发酵结束后，冻干发酵黄芪液得发酵黄芪冻干粉。测得发酵黄芪中黄芪的质 量分数为78%，400g发酵黄芪冻干粉中含黄芪的质量为312g。
[0035] 发酵黄芪的液体培养基由以下重量份数的成分制备完成：乳清粉：25. 79份；蛋白 胨：2. 28份；葡萄糖：0. 60份；酵母粉：1. 56份；硫酸镁：0. 04份；梓檬酸三铵：0. 40份；硫 酸氢二钾：〇. 40份；乙酸钠：1. 00份；黄芪粉：80份；水：1000份。
[0036] 将实施例1中发酵黄芪冻干粉按照1%的剂量添加于21日龄的肉鸡饲料中饲 喂28天，试验结束后发现发酵黄芪组肉仔鸡的体重明显高于空白对照组和生药黄芪组 (P>0. 05)，经计算发酵黄芪组平均日增重达34. 25g/d ·只，空白对照组平均日增重达30. 15 30. 49g/d ·只，而生药黄芪组只有26. 13g/d ·只；而将应用专利201210141832. 6中的发酵 培养基按照本发明的发酵方法发酵的产品作为对照组A，饲喂肉鸡后，平均日增重为31. 69 g/d ·只。对发酵黄芪组实验鸡脏器剖检未见任何病理变化，同时发酵黄芪组的心脏、肝脏、 肾脏指数与正常对照组相比差异不显著（P>〇. 05)。检测发酵黄芪组肉仔鸡血液免疫球蛋白 水平，结果显示，与空白对照组相比发酵黄芪组肉仔鸡血液免疫球蛋白均有所增加，IgA含 量提高了 1.5%，IgM含量提高了 1.93 %，IgG提高了 1.88%。而对照组A与空白对照组相 比，IgA含量提高了 1. 3%，IgM含量提高了 1. 85%，IgG提高了 1. 73%。结果提示该发酵产品 作为饲料添加剂能够增强肉仔鸡生长性能，并能提高机体免疫力。
[0037] 实施例2 本发明的发酵黄芪的制备方法为： 将洁净的黄芪生药饮片粉碎后，过20目筛，用10L发酵罐发酵黄芪，发酵菌株LZMYFGM9 的菌液浓度为2X 106个/mL，接菌量为4%(占发酵总体积)，黄芪用量为8%(黄芪质量：发酵 液体积，g:mL)，温度38°C，转速200r/min，pH值5. 5,溶氧量5%，中和剂为6mol/L的NaOH， 发酵时间44h。发酵结束后，冻干发酵黄芪液得发酵黄芪冻干粉。测得发酵黄芪中黄芪的质 量分数为78%，400g发酵黄芪冻干粉中含黄芪的质量为312g。
[0038] 发酵黄芪的液体培养基由以下重量份数的成分制备完成：乳清粉：26. 35份；蛋白 胨：2. 20份；葡萄糖：0. 67份；酵母粉：1. 53份；硫酸镁0. 05份；柠檬酸三铵0. 30份；硫酸 氢二钾0. 50份；乙酸钠0. 92份；黄芪粉：90份；水：900份。
[0039] 将实施例2中发酵黄芪冻干粉按照1%的剂量添加于21日龄的肉鸡饲料中饲 喂28天，试验结束后发现发酵黄芪组肉仔鸡的体重明显高于空白对照组和生药黄芪组 (P>0. 05)。
[0040] 实施例3 本发明的发酵黄芪的制备方法为： 将洁净的黄芪生药饮片粉碎后，过20目筛，用10L发酵罐发酵黄芪，发酵菌株LZMYFGM9 的菌液浓度为2 X 107个/mL，接菌量为4. 5% (占发酵总体积)，黄芪用量为8% (黄芪质量： 发酵液体积，g:mL)，温度39°C，转速200r/min，pH值6. 0,溶氧量8%，中和剂为6mol/L的 NaOH，发酵时间52h。发酵结束后，冻干发酵黄芪液得发酵黄芪冻干粉。测得发酵黄芪中黄 芪的质量分数为78%，400g发酵黄芪冻干粉中含黄芪的质量为312g。
[0041] 发酵黄芪的液体培养基由以下重量份数的成分制备完成：乳清粉：24. 00份；蛋白 胨：2. 39份；葡萄糖：0. 50份；酵母粉：1. 68份；硫酸镁0. 03份；柠檬酸三铵0. 50份；硫酸 氢二钾0. 30份；乙酸钠1. 10份；黄芪粉：100份；水：1100份。
[0042] 将实施例3中发酵黄芪冻干粉按照1%的剂量添加于21日龄的肉鸡饲料中饲 喂28天，试验结束后发现发酵黄芪组肉仔鸡的体重明显高于空白对照组和生药黄芪组 (P>0. 05)。
[0043] 实施例4 本实施例中所用的大孔吸附树脂D101和AB-8对发酵黄芪流浸膏皂苷的静态吸附量分 别为30. 06mg/g和30. 58mg/g ;对生药黄芪流浸膏皂苷的静态吸附量分别为32. 40mg/g和 40. 56mg/g ;对发酵黄芪流浸膏皂苷的动态吸附量分别为22. 13mg/g和26. 25mg/g ;对生药 黄芪流浸膏的动态吸附量分别为30. 53mg/g和32. 62mg/g。
[0044] 本实施例中的大孔吸附树脂，每5mL处理好的AB-8树脂和D 101树脂分别相当于 干树脂1. lg和1. 〇g。
[0045] 本发明提供的一种发酵黄芪总皂苷的提取方法，包括以下步骤： (1)称取实施例1制备的发酵黄芪冻干粉400g，过20目筛，用20倍量（即8000 mL)85% 乙醇室温下密闭浸泡8h，85°C温浸lh，过滤，滤渣再重复提取1次。合并两次上清液，过滤 除渣。药渣用于提取水溶性的其它有效成分，如多糖等，利于发酵产品有效成分的充分开发 和高效利用。减压蒸馏醇提液回收乙醇(泵压力为〇. 〇8MPa，水浴温度为55°C )，得醇提发酵 黄芪流浸膏160g，即lg流浸膏含1. 95g生药黄芪，经香草醛-硫酸法检测，醇提发酵黄芪流 浸膏中总皂苷含量为11.48 %。
[0046] (2)用100mL纯水稀释10g醇提发酵黄芪流浸膏，过滤，用100mL水饱和正丁醇萃 取滤液中总阜苷3次，萃取时应沿同一方向勻速轻微振摇，待稍静止后，再行反方向轻微振 摇，以免发生乳化现象。
[0047] 合并三次正丁醇萃取液，用水洗涤正丁醇液2次，每次100mL。合并正丁醇液，减压 蒸馏回收正丁醇(泵压力为〇. 〇8MPa，水浴温度为60 °C?85°C，蒸馏困难时可缓慢加入体 积百分含量为15%?30%的水)，至无正丁醇味，提取液浓缩至21g，即lg浓缩液中含0. 93g 生药黄芪。因正丁醇萃取物干燥后不易溶于水，故将浓缩液制备成1:0. 9?1. 1，即lg浓缩 物中含0.9?1. lg生药黄芪。
[0048] (3)用少量无水乙醇溶解发酵黄芪的正丁醇萃取浓缩液，再用100mL纯水稀释，过 滤，将上清液缓慢上样于AB-8大孔吸附树脂柱（Φ 2. 4cmX 70cm)，静置30min。然后用30% 乙醇洗脱1倍柱体积（300mL)，弃洗脱液。再用85%乙醇洗脱3倍柱体积（950mL)。平均流速 为5mL/min，收集洗脱液，减压蒸馏回收乙醇，冷冻干燥，得到纯化发酵黄芪总皂苷3. 05g， 发酵黄芪纯化皂苷中总皂苷含量为88. 39%。
[0049] 实施例5 本发明的生药黄芪总皂苷的提取包括以下步骤： (1)称取生药黄芪312 g，过20目筛，用20倍量（6240 mL) 85 %乙醇室温下密闭浸泡 8h，85 °C温浸lh，过滤，滤渣再重复提取1次。合并两次上清液，过滤除渣。减压蒸馏醇提 液回收乙醇(泵压力为0.08 MPa，水浴温度为55 °C)，得醇提生药黄芪流浸膏150 g (1 g 流浸膏含2. 08 g生药黄芪)，经香草醛-硫酸法检测，醇提生药黄芪流浸膏中总皂苷含量为 16. 78 %。
[0050] (2)用100 mL纯水稀释10 g醇提生药黄芪流浸膏，过滤，用100 mL水饱和正丁醇 萃取滤液中总阜苷3次(萃取时应沿同一方向勻速轻微振摇，待稍静止后，再行反方向轻微 振摇，以免发生乳化现象)。
[0051] 合并三次正丁醇萃取液，用水洗涤正丁醇液2次，每次100 mL。合并正丁醇液，减 压蒸馏回收正丁醇(泵压力为0.08 MPa，水浴温度为60 °C?85 °C，蒸馏困难时可缓慢加 入15 %?30 %的水)，至无正丁醇味，提取液浓缩至19 g (1 g浓缩液中含1. 09 g生药黄 芪)。
[0052] (3)用少量无水乙醇溶解生药黄芪的正丁醇萃取浓缩液，再用100 mL纯水稀释，过 滤，将上清液缓慢上样于AB-8大孔吸附树脂柱（Φ 2.4 cmX 70 cm)，静置30 min。然后用 30 %乙醇洗脱1倍柱体积（300 mL)，弃洗脱液。再用85 %乙醇洗脱3倍柱体积（950 mL)。 平均流速为5 mL/min，收集洗脱液，减压蒸馏回收乙醇，冷冻干燥，得到纯化生药黄芪总皂 苷3. 92 g，经香草醛-硫酸法检测，生药黄芪纯化皂苷中总皂苷含量为91. 27 %。
[0053] 使用本发明方法提取的发酵黄芪总皂苷含量和得率均低于生药黄芪总皂苷，说明 在黄芪的生物转化过程中皂苷类物质发生了明显的变化。本发明方法提取的总皂苷得率和 含量均高于单独使用正丁醇萃取法或大孔树脂富集法，本发明方法操作较为简便、易于推 广及扩大生产。
[0054] 实施例6 本实施例与实施例4的不同之处在于： 本实施例采用实施例1中的制备方法制备得到的发酵黄芪冻干粉。
[0055] 步骤（3)中，用少量无水乙醇溶解发酵黄芪的正丁醇萃取浓缩液，再用100mL纯水 稀释，过滤，将上清液缓慢上样于AB-8大孔吸附树脂柱（Φ 2. 4cmX 70cm)，静置30min。然后 用30%乙醇洗脱1. 1倍柱体积（330mL)，弃洗脱液。再用70%乙醇洗脱6倍柱体积（1800mL)。 平均流速为5mL/min，收集洗脱液，减压蒸馏回收乙醇，冷冻干燥，得到纯化发酵黄芪总皂苷 2. 96g，发酵黄芪纯化皂苷中总皂苷含量为78. 52%。
[0056] 其余步骤均相同。
[0057] 实施例7 本实施例与实施例4的不同之处在于： 本实施例采用实施例1中的制备方法制备得到的发酵黄芪冻干粉。
[0058] 步骤（3)中，用少量无水乙醇溶解发酵黄芪的正丁醇萃取浓缩液，再用100mL纯水 稀释，过滤，将上清液缓慢上样于AB-8大孔吸附树脂柱（Φ 2. 4cmX 70cm)，静置30min。然后 用30%乙醇洗脱0. 9倍柱体积（270mL)，弃洗脱液。再用90%乙醇洗脱4倍柱体积（1200mL)。 平均流速为5mL/min，收集洗脱液，减压蒸馏回收乙醇，冷冻干燥，得到纯化发酵黄芪总皂苷 3. 24g，发酵黄芪纯化皂苷中总皂苷含量为84. 81%。
[0059] 其余步骤均相同。
[0060] 实施例8 本实施例与实施例4的不同之处在于：本实施例中采用的大孔吸附树脂为D101。得到 纯化发酵黄芪总皂苷2. 83g，发酵黄芪纯化皂苷中总皂苷含量为86. 39%。
[0061] 其余步骤均相同。
[0062] 实施例9 本实施例考察了 6种大孔树对发酵黄芪总皂苷的富集纯化能力，通过比较发酵黄芪总 皂苷的质量和总皂苷含量，优选出AB-8和D101效果较好，说明非极性和弱极性的大孔吸附 树脂比较适于发酵黄芪皂苷的富集和纯化。试验的方法和步骤同实施例4，6种大孔树脂 的比较试验结果见表1。
[0063] 表1 6种大孔树脂对发酵黄芪皂苷的富及纯化试验结果

【权利要求】
1. 一种发酵黄芪的制备方法，其特征在于：步骤如下：将洁净的黄芪生药饮片粉碎后， 发酵黄芪，发酵菌株非解乳糖链球菌CGMCC No. 4227的菌液浓度为2 X 106?2 X 108个/mL， 接菌量为4%?5% (占发酵总体积)，黄芪用量为8% (黄芪质量：发酵液体积，g:mL)，温度 38°C?39°C，转速200r/min，pH值5. 5?6. 5,溶氧量5%?10%，中和剂为6mol/L的NaOH，发 酵时间44h?52h，发酵结束后，冻干发酵黄芪液得发酵黄芪产品；优选地，发酵菌株CGMCC No. 4227的菌液浓度为2X 108个/mL，接菌量为5%(占发酵总体积)，黄芪用量为8%(黄芪质 量：发酵液体积，g:mL)，温度39°C，转速200r/min，pH值6. 4,溶氧量10%，中和剂为6mol/L 的NaOH，发酵时间48h ;优选地，所述发酵黄芪过程中使用的液体培养基由以下重量份数的 成分制备完成：乳清粉：24?27份；蛋白胨：2. 2?2. 4份；葡萄糖：0. 5?0. 7份；酵母粉： 1. 4?1. 7份；硫酸镁：0. 03?0. 05份；柠檬酸三铵：0. 30?0. 50g ;硫酸氢二钾：0. 30? 0. 50g ;乙酸钠：0. 90?1. 10g ;黄芪粉：80?100份；水：900?1100份；更优选地，所述发 酵黄芪过程中使用的液体培养基由以下重量份数的成分制备完成：乳清粉：25. 79份；蛋白 胨：2. 28份；葡萄糖：0. 60份；酵母粉：1. 56份；硫酸镁：0. 04份；梓檬酸三铵：0. 40份；硫 酸氢二钾：〇. 40份；乙酸钠：1. 00份；黄芪粉：80份；水：1000份。
2. 权利要求1所述的发酵黄芪作为饲料添加剂的应用。
3. -种饲料添加剂，其特征在于：所述饲料添加剂的有效成分为权利要求1所述的发 酵黄芪。
4. 一种发酵黄芪总皂苷的提取方法，其特征在于：步骤如下： (1) 将权利要求1所述的发酵黄芪用80%?90%乙醇温浸提取，优选用85%乙醇温浸提 取，得到醇提发酵黄芪流浸膏；优选地，所述流浸膏中lg流浸膏含〇. 9?1. lg生药黄芪； (2) 将步骤（1)得到的醇提发酵黄芪流浸膏用水饱和正丁醇萃取，得提取液； (3) 将提取液上样于大孔吸附树脂柱吸附，洗脱，收集洗脱液，将洗脱液进行后处理，得 到纯化后的发酵黄芪总皂苷。
5. 根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述温浸提取是将发酵黄芪用 80%?90%乙醇室温下密闭浸泡6h?10h，83°C?86°C温浸lh?2h，过滤，滤渣再重复提 取1次；优选地，所述温浸提取是将发酵黄芪用85%乙醇室温下密闭浸泡8h，85°C温浸lh， 过滤，滤渣再重复提取1次。
6. 根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述温浸提取时每lg发酵黄芪用 20ml 85%乙醇温浸提取。
7. 根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：步骤（2)中用水饱和正丁醇萃取时， 沿同一方向勻速轻微振摇，待稍静止后，再反方向轻微振摇。
8. 根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：步骤（3)中所述大孔吸附树脂为 AB-8 或 D101 ;优选为 AB-8。
9. 根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：步骤（3)中所述洗脱是先用30%乙醇 洗脱，弃洗脱液；再用70%?90%乙醇洗脱，收集洗脱液；优选地，所述洗脱是先用30%乙醇 洗脱，弃洗脱液；再用85%乙醇洗脱，收集洗脱液。
10. 根据权利要求4-9任一所述的提取方法，其特征在于：提取后洗脱液经浓缩干燥 后，发酵黄芪总皂苷含量达78. 52%?88. 39%。
【文档编号】C12R1/46GK104152491SQ201410405496
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】秦哲, 李建喜, 杨志强, 王学智, 张景艳, 王旭荣, 王磊, 孔晓军, 孟嘉仁, 张凯 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所