一种固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法
【专利摘要】一种固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，包括以下步骤：a.工程菌的固定化处理；b.增值固定化工程菌；c.将增值的固定化工程菌投入土壤中，培养后测定土壤中有机磷的含量。本发明方法简便，操作程序易于控制，无毒，通气性良好，不会造成土壤的二次污染，降解有机磷速度快等优点，适合大规模推广应用。
【专利说明】一种固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种固定化工程菌降解土壤中有机磷农 药的方法。
【背景技术】
[0002] 目前我国约有87?107万hm2的农田土壤受到有机磷农药污染，种植在农药污 染的土壤上的作物从土壤中吸收累积农药，不但影响植物的正常生长发育，而且还会在植 物体内残留，导致主要农产品的农药残留超标。大部分农药会落入土壤中，而且不断的进 行积累，破坏了土壤微生物的繁殖，使敏感性的菌种受到抑制，土壤微生物的种群趋于单一 化，引起原有的平衡紊乱、功能失调从而影响土壤物质和能量的循环，影响土壤微生物的氨 化硝化和呼吸作用等，由此破坏了土壤结构和理化性质，影响着作物生长，造成土壤结构板 结导致土壤退化、酸化、养分减少、农作物产量和品质下降。
[0003] 土壤污染的治理主要有物理治理技术、化学治理技术、微生物治理技术、植物治理 技术。微生物治理技术有着物理、化学方法无可比拟的优越性，如处理费用低，处理效果好， 对环境的影响小，不会造成二次污染，不破坏植物生长所需的土壤环境，处理操作简单等优 点。微生物治理技术可通过自然的或人工方式加速土壤残留农药的微生物降解，实现受污 染土壤的微生物修复。然而采用传统的游离微生物技术修复受有机磷农药污染的土壤时存 在一些缺陷，如反应速度慢、有效降解菌无法形成优势菌群、抗不利环境能力差、对环境变 化敏感、与土著菌竞争营养时处于劣势，达不到污染土壤修复的预期目标，而固定化细胞技 术有望克服这些缺点和弊端。
[0004] 固定化细胞技术是将细胞通过化学或物理的方法固定在水溶性或不溶性的颗粒 状、管状、膜状的载体之上，使其保持活性并能反复使用的一种技术，较游离菌具有较大优 势，可以明显地提高细胞对不利环境的适应能力，能在持续增殖、休眠及衰亡的同时，其活 性始终保持稳定，具有降低污染修复成本、节约能源消耗、简化环保方法等很多优点。目前 固定化技术己经广泛应用于流体介质中，但在修复非流体介质，尤其是有机磷农药污染的 土壤尚未见成功的报道。
【发明内容】
[0005] 解决的技术问题：针对现有技术问题，本发明的目的在于提供一种固定化工程菌 降解土壤中有机磷农药的方法，降解效果好，避免对土壤造成二次污染。
[0006] 技术方案：为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为： 一种固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，包括以下步骤： a. 工程菌的固定化处理，采用LB液体培养基培养工程菌制成菌悬液，再经液体发酵培 养基培养后得工程菌发酵菌种，以工程菌发酵菌种为固定化对象，采用固定化细胞技术，以 聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭对工程菌进行包埋，形成固定化工程菌； b. 将固定化工程菌接种到5(T80ml液体发酵培养基/250ml锥形瓶培养，温度为 28~32°C，在转速为150?250r/ min的恒温振荡箱中培养6~12h，用无菌纱布过滤分离得增 殖的固定化工程菌； c.将增殖的固定化工程菌按土壤重量3~10%投粒比，均匀分布于供试土壤中，再将 10(T600mg/kg有机磷农药添加到无菌水中，通过调节土壤含水量时加入，调节含水量达到 土壤饱和含水量的40~60%，培养后取样检测土壤中有机磷含量。
[0007] 作为优选的是，所述工程菌为枯草芽孢杆菌菌株，已保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No. 9272,保藏 日期：2014年06月05日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物 研究所。
[0008] 上述固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法中步骤a工程菌的固定化处理 的具体步骤为： (1) 采用LB液体培养基28-32 °C培养工程菌12-24h制成菌悬液，接种到含有 10(T600mg/L甲基对硫磷的液体发酵培养基中，装液量为5(T80 ml/250ml锥形瓶，摇匀， 28?32°C，15(T250 r/ min恒温振荡培养24?48 h，获得工程菌发酵菌种； (2) 聚乙烯醇冷水溶胀后加入95°C水中溶解，将聚乙烯醇和活性炭混入海藻酸钠溶液 中使三者终浓度分别达到10(Tl20 g/L、8?10 g/L和扩11 g/L，将工程菌发酵菌种与液体 发酵培养基用无菌纱布过滤分离，菌种用去离子水清洗后，按照菌种：聚乙烯醇-海藻酸 钠-活性炭溶液质量体积比为1:1~2:1的标准取菌种加入聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭溶 液中混匀； (3) 用注射器吸取上述混合液滴入8?10g/L的CaCl2溶液中形成直径为0. 3?0. 5cm固 定化颗粒，室温固定广3h后，4°C冰箱固定4~6h，再用去离子水冲洗2~4遍后，直接加入液体 发酵培养基中增殖或4°C冷藏备用。
[0009] 作为优选的是，步骤b中固定化工程菌的培养温度为30°C。
[0010] 作为优选的是，工程菌的固定化处理中聚乙烯醇终浓度为120 g/L，海藻酸钠终浓 度为10 g/L，活性炭终浓度为11 g/L，CaCl2溶液的浓度为10g/L。
[0011] 有益效果 本发明固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，具有方法简便，操作程序易于控 制，无毒，通气性良好，不会造成土壤的二次污染，降解有机磷速度快等优点，与未固定化工 程菌相比，固定化工程菌稳定、降解率高且降解速度快。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1固定化工程菌降解对硫磷的效果； 图2固定化工程菌降解甲胺磷的效果； 图3不同投粒的固定化工程菌比对降解对硫磷的影响； 图4不同投粒的固定化工程菌比对降解甲胺磷的影响。
【具体实施方式】
[0013] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本 发明。
[0014] 本发明的生物材料的来源说明 1、工程菌：枯草芽孢杆菌菌株，已保藏在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No. 9272,保藏日期：2014年06月05 日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0015] 2、培养基 LB液体培养基（g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5, NaCl 10, pH 7. (T7. 2 ; 液体发酵培养基（g/L):葡萄糖 1〇, NH4Cl 2, KH2PO4 0? 5, K2HPO4 L 5, MgSO4 0? 2, NaCl 〇? 5,甲基对硫磷0? 1，pH 7. 0?7. 2。
[0016] 实施例1 本实施例说明工程菌的固定化处理。
[0017] (1)工程菌发酵菌种的制备： 接种工程菌单菌落于LB液体培养基中，于30°C，250 r/min振荡培养过夜后，培养物继 续于30°C，300 r/min振荡培养至OD6tltl=O. 8,加入诱导剂IPTG至终浓度0. 2 mmol/L，继续培 养3h，离心收集菌体，并用0. lmol/L磷酸缓冲液（pH 7.0)清洗，于3000 r/min，4°C离心， 菌体重复洗涤、离心3次，制得菌悬液；菌悬液按照4%接种量（v/v)接种到50ml液体发酵 培养基/250ml锥形瓶培养，30°C，250 r/min振荡培养12h，液体菌种按照上述接种量扩大 培养至240ml液体发酵培养基/500ml锥形瓶，获得工程菌发酵菌种。
[0018] (2)PVA冷水溶胀后加入95°C水中溶解，将PVA和活性炭混入SA溶液中，使三者终 浓度分别为100 g/L、9 g/L和10 g/L，用无菌纱布过滤分离工程菌发酵菌种与发酵培养基， 工程菌发酵菌种用去离子水清洗后，按照工程菌发酵菌种：PVA-SA-活性炭溶液=1 :l(w/v) 的比例，取0. 3g菌体，加入300ml PVA-SA-活性炭溶液混匀。
[0019] (3)用5号注射器吸取上述菌体与PVA-SA-活性炭溶液滴入到9 g/L的CaCl2溶 液中得约2500个固定化工程菌颗粒，粒径约0. 5cm，室温固定Ih后，4°C冰箱固定4h，颗粒 用去离子水冲洗2遍后4°C冷藏备用。
[0020] 实施例2 本实施例说明固定化工程菌的增值。
[0021] 将固定化工程菌接种到50ml液体发酵培养基/250ml锥形瓶培养，温度为30°C， 在转速为250 r/ min的恒温振荡箱中培养6 h，用无菌纱布过滤分离得增殖的固定化工程 菌。
[0022] 实施例3 本实施例比较固定化工程菌与非固定化工程菌对降解土壤中有机磷农药的效果。
[0023] 将增殖的固定化工程菌按土壤重量5%投粒比，均匀分布于供试土壤中，添加有 机磷农药使其终浓度为100 mg/kg，于30°C恒温培养箱中培养，期间土壤的持水量保持在 60%，培养12h、24h和36h后取样，按照快速溶剂萃取（ASE)方法制样，环己烧萃取各土样 中的农药，高效液相色谱检测土壤中对硫磷和甲胺磷残留量。以相同的方法和步骤接种未 经固定化的工程菌和不接菌的作为对照，检测结果如表1所示，其中，CK代表不接菌的空 白样品，非固定化是指未经固定化处理的工程菌，固定化是指本发明固定化工程菌，降解率 (%) = (1 -处理样品残留量/对照样品残留量）X 100%。
[0024] 高效液相测定对硫磷色谱条件：色谱柱Hypersil C18柱；流动相：V (甲醇）：V (水）：=80 :20 ;流速：1.0 ml/ min ;检测波长 280 nm，柱温：35°C ;进样量：20ii 1。
[0025] 高效液相测定甲胺磷色谱条件：色谱柱Hypersil C18柱；流动相：V (甲醇）：V (水）：=30:70;流速：1.5 1111/111111;检测波长215 11111，柱温：301：;进样量：15111。
[0026] 表I CK、非固定化与固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的效果：
【权利要求】
1. 一种固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，其特征在于，包括以下步骤：a. 工程菌的固定化处理，采用LB液体培养基培养工程菌制成菌悬液，再经液体发酵培养基培 养后得工程菌发酵菌种，以工程菌发酵菌种为固定化对象，采用固定化细胞技术，以聚乙 烯醇、海藻酸钠、活性炭对工程菌进行包埋，形成固定化工程菌；b.将固定化工程菌接种到 5(T80ml液体发酵培养基/250ml锥形瓶培养，温度为28?32°C，在转速为150?250r/ min 的恒温振荡箱中培养6~12h，用无菌纱布过滤分离得增殖的固定化工程菌；c.将增殖的固 定化工程菌按土壤重量:T10%投粒比，均匀分布于供试土壤中，再将10(T600mg/kg有机 磷农药添加到无菌水中，通过调节土壤含水量时加入，调节含水量达到土壤饱和含水量的 40~60%，培养后取样检测土壤中有机磷含量。
2. 根据权利要求1所述固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，其特征在于：所 述工程菌为枯草芽孢杆菌菌株，已保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No. 9272,保藏日期：2014年06月05日， 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
3. 根据权利要求1所述固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，其特征在于，步 骤a工程菌的固定化处理的具体步骤为： (1) 采用LB液体培养基28-32 °C培养工程菌12-24h制成菌悬液，接种到含有 10(T600mg/L甲基对硫磷的液体发酵培养基中，装液量为5(T80 ml/250ml锥形瓶，摇匀， 28?32°C，15(T250 r/ min恒温振荡培养24?48 h，获得工程菌发酵菌种； (2) 聚乙烯醇冷水溶胀后加入95°C水中溶解，将聚乙烯醇和活性炭混入海藻酸钠溶液 中使三者终浓度分别达到10(Tl20 g/L、8?10 g/L和扩11 g/L，将工程菌发酵菌种与液体 发酵培养基用无菌纱布过滤分离，菌种用去离子水清洗后，按照菌种：聚乙烯醇-海藻酸 钠-活性炭溶液质量体积比为1:1~2:1的标准取菌种加入聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭溶 液中混匀； (3) 用注射器吸取上述混合液滴入8?10g/L的CaCl2溶液中形成直径为0. 3?0. 5cm固 定化颗粒，室温固定广3h后，4°C冰箱固定4~6h，再用去离子水冲洗2~4遍后，直接加入液体 发酵培养基中增殖或4°C冷藏备用。
4. 根据权利要求1所述固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，其特征在于：步 骤b中固定化工程菌的培养温度为30°C。
5. 根据权利要求3所述固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，其特征在于：聚 乙烯醇终浓度为120 g/L，海藻酸钠终浓度为10 g/L，活性炭终浓度为11 g/L，CaCl2溶液 的浓度为l〇g/L。
【文档编号】C12N11/10GK104208841SQ201410419449
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】董玉玮, 李同祥, 高明侠, 汤薇 申请人:徐州工程学院