一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的pcr-hrm引物和方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCR-HRM引物和方法。该方法为先从样品中提取病毒DNA作为模板，利用所设计的2对特异性引物和荧光饱和染料进行PCR扩增，并分别以野毒株和疫苗株标准品作为对照对检测样品进行HRM分析，确定犬细小病毒的类型。本发明操作简单，只需PCR反应前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量，全部操作过程只需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了区分检测所需时间；费用低，不需要特异性探针，荧光饱和染料廉价易得；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
【专利说明】-种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCR-HRM引物 和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒疫苗毒与野毒株的鉴别方法，具体涉及一种快速区分犬细小病毒 野毒株与疫苗株的PCR-HRM引物和方法。
【背景技术】
[0002] 犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV)为单链小DNA病毒，是引起犬急性出血 性胃肠炎和幼犬急性心肌炎的主要病原。1977年，Eugster和Nairn首次从患出血性肠 炎的病犬粪便中分离到犬细小病毒，并命名为CPV-2。自Eugster等人首次分离获得CPV-2 以来，CPV抗原性随时间的推移而不断发生改变，不断有新的CPV基因型和抗原型出现，并 在世界范围内广泛传播流行。目前已知的CPV基因型包括CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c，原始 型CPV-2基因型已被新出现的抗原变异株取代，并且原始型CPV-2毒株只有以弱毒活疫苗 的形式用于犬细小病毒的预防当中。目前，国内用于预防犬细小病的疫苗株主要有：美国辉 瑞动保公司的CPVpf弱毒活疫苗株和荷兰英特维公司的CPVint弱毒活疫苗株，以上两个 疫苗株均是原始CPV-2株的弱毒株。
[0003] 随着国内宠物行业的不断发展，目前临床中大量使用弱毒活疫苗来预防犬细小 病，虽然接种疫苗可预防犬细小病的流行，但有报道称接种犬细小病弱毒活疫苗株的犬只 发病率增加的现象。此外，接种疫苗也对疾病的及时准确诊断带来了一定的难度。例如，患 有犬瘟热的犬只接种弱毒活疫苗后由于粪便当中检测到犬细小病毒疫苗株而误诊为犬细 小病引起的肠道疾病，从而影响其疾病治疗效果。因此，快速区分犬细小病毒的疫苗株和野 毒株对疫苗株的安全评价及疾病的快速准确诊断具有一定的临床意义。而目前区分犬细小 病毒疫苗株与野毒的主要方法为荧光定量PCR法(MGB探针)，此方法虽然能准确区分犬细 小病毒疫苗株与野毒株，但同时需要三对或更多的探针价格昂贵，限制其在生产中的实际 应用。因此，目前急需一种操作相对简易、检测结果可靠且检测成本低廉的区分犬细小病毒 疫苗株与野毒株的方法。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒 株的PCR-HRM引物和方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠且检测成本低廉，有利于 在临床实践中推广应用。
[0005] 本发明的目的在于提供一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的PCR-HRM引 物。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的PCR-HRM 方法。
[0007] 本发明所采取的技术方案是： 一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示： 引物P1:TGGAAATCACAGCAAACTC(SEQIDN0:1)或其核苷酸互补序列， 引物P2:AGTCTTGGTTTTAAGTCAGTATC(SEQIDN0:2)或其核苷酸互补， 引物P3:TGAAAATTATAGAAGAGTGGT(SEQIDN0:3)或其核苷酸互补序列， 引物 P4 :CGTTAACTGCAGTTTTATCCA (SEQ ID NO :4)或其核苷酸互补序列。
[0008] -种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCR-HRM方法，包括以下步骤： 1) 从样品中提取病毒DNA ; 2) 以DNA为模板，用权利要求1所述的引物对P1和P2进行预扩增反应获得预扩增产 物； 3) 以预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对P3、P4和荧光饱和染料进 行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物； 4) 对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。
[0009] 进一步的，上述步骤2)中的PCR预扩增反应体系为： Premix Εχ-Taq 5. 0 μ 1 引物 PI 0. 5μ 1 引物 Ρ2 0. 5μ 1 模板 Ι.ΟμΙ ddH20 3· 0 μ 1。
[0010] 进一步的，上述步骤2)中的预扩增反应程序为：95°C预变性5min ;95°C变性30s， 55°C退火30s，72°C延伸30s ;循环35次；72°C终延伸8min。
[0011] 进一步的，上述步骤3)中的PCR-HRM扩增反应体系为： Premix Εχ-Taq 5. 0 μ 1 引物 Ρ3 0. 5μ 1 引物 Ρ4 0. 5μ 1 模板 Ι.ΟμΙ 荧光饱和染料 1 μ 1 ddH20 2· 0 μ 1。
[0012] 进一步的，上述所述的突光饱和染料为Eva green染料。
[0013] 进一步的，上述步骤3)中的PCR-HRM扩增反应程序为：95°C预变性5min ;95°C变 性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s ;循环35次；68°C到80°C以0. 3°C /步的速率进行熔解 曲线分析。
[0014] 进一步的，上述步骤4)中所述HRM分析的具体分析过程为：1)以疫苗株CPVpf标 准样品为对照时，若其基因分型置信值（GCP)大于95%则判定为疫苗株CPVpf ; 2) 以疫苗株CPVint标准样品为对照时，若其基因分型置信值（GCP)大于95%则判定为 疫苗株CPVint ; 3) 以CPV野毒株标准样品为对照时，若其基因分型置信值（GCP)大于95%则判定为CPV 野毒株。
[0015] 本发明的有益效果是： 1)本发明首次建立了一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的PCR-HRM引物和方 法，操作简单：只需PCR反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作 过程只需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异 性探针，荧光饱和染料廉价易得；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地 进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
[0016] 2)本发明的PCR-HRM引物，对犬细小病毒疫苗株(包括CPVpf和CPVint疫苗株） 与野毒株均有很好地的扩增性，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间。
[0017] 3)本发明的PCR-HRM引物特异性好，除可以与犬细小病毒疫苗株与野毒株结合 夕卜，不与其他常见犬类病毒DNA结合，特异性扩增犬细小病毒DNA，有利于提高本发明对基 因型分析的正确性。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为犬细小病毒疫苗株与野毒株标准样品HRM标准化熔解曲线； 图2为犬细小病毒疫苗株与野毒株标准样品HRM峰型化熔解曲线； 图3为犬细小病毒疫苗株与野毒株临床样品HRM标准化熔解曲线； 图4为犬细小病毒疫苗株与野毒株临床样品HRM峰型化熔解曲线； 图5为犬细小病毒疫苗株与野毒株PCR-HRM引物特异性凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0020] 实施例1 (1)引物 1)PCR预扩增引物 根据犬细小病毒VP2基因序列设计出扩增犬细小病毒VP2部分基因的引物对P1和P2， 其碱基序列如下所示。
[0021] P1 :5,-TGGAAATCACAGCAAACTC -3，(SEQ ID NO ：1), P2:5'-AGTCTTGGTTTTAAGTCAGTATC-3' （SEQ ID N0:2)。
[0022] 其中，引物PI在犬细小病毒VP2基因第2962?2980位点上，引物P2在犬细小病 毒VP2基因第4209?4231位点上（该基因在Genbank中的登录号为M38245 )。
[0023] 2) PCR-HRM 引物： 本发明经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物对P3、P4和引物对PI、P2的联 合使用对PCR-HRM方法区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的效果最好，引物对P3、P4的碱基 序列如下所示。
[0024] P3 :5'-TGAAAATTATAGAAGAGTGGT-3'（SEQ ID N0 :3)， P4:5'-CGTTAACTGCAGTTTTATCCA-3'（SEQ ID N0:4)。
[0025] 其中，引物P3在犬细小病毒VP2基因第3014?3034位点上，引物P4在犬细小病 毒VP2基因第3045?3066位点上（该基因在Genbank中的登录号为M38245 )。
[0026] (2)标准样品的制备及其PCR-HRM分析 1)犬细小病毒DNA的提取： 用试剂盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 4.0提取病料样品中的犬细 小病毒DNA。病料样品可以是全血、粪便、直肠面拭子等易于获得且对动物体无严重伤害的 样品。
[0027] 2)标准样品的制备： 为了验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准阳性样品，为之后的临床样品检 测提供HRM阳性对照，本发明需优先制备犬细小病毒疫苗株和野毒株阳性标准样品。标准 样品的制备步骤如下： 分别取经过测序确定为CPVpf疫苗株、CPVint疫苗株和犬细小病毒野毒株的DNA作为 模板，分别以P1和P2为引物进行PCR预扩增，其预扩增反应体系为： Premix Εχ-Taq 5. 0 μ 1 引物 PI 0. 5μ 1 引物 Ρ2 0. 5μ 1 模板 Ι.ΟμΙ ddH20 3· 0 μ 1。
[0028] 预扩增反应程序为：951：预变性51^11;951：变性3〇8,551：退火3〇8,721：延伸 30s ;循环35次；72°C终延伸8min。
[0029] 通过上述方法，分别获得犬细小病毒疫苗株CPVpf、疫苗株CPVint和野毒株的 PCR预扩增产物，分别将PCR预扩增产物稀释100倍，即可分别获得疫苗株CPVpf、疫苗株 CPVint和野毒株的标准样品，作为后续研究的阳性对照样品。
[0030] 3 )阳性标准样品的PCR-HRM操作步骤 分别以上述获得的三种阳性标准样品为DNA模板，分别进行PCR-HRM扩增反应和分 析； PCR-HRM反应体系：10 μ 1
【权利要求】
1. 一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所 示： 引物P1:TGGAAATCACAGCAAACTC(SEQIDN0:1)或其核苷酸互补序列， 引物P2:AGTCTTGGTTTTAAGTCAGTATC(SEQIDN0:2)或其核苷酸互补， 引物P3:TGAAAATTATAGAAGAGTGGT(SEQIDN0:3)或其核苷酸互补序列， 引物 P4 :CGTTAACTGCAGTTTTATCCA (SEQ ID NO :4)或其核苷酸互补序列。
2. -种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCR-HRM方法，其特征在于：包括以下 步骤： 1) 从样品中提取病毒DNA ; 2) 以DNA为模板，用权利要求1所述的引物对P1和P2进行预扩增反应获得预扩增产 物； 3) 以预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对P3、P4和荧光饱和染料进 行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物； 4) 对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)中的PCR预扩增反应体系为： Premix Ex-Taq 5. 0 μ 1 引物 PI 0. 5μ 1 引物 Ρ2 0. 5μ 1 模板 Ι.ΟμΙ ddH20 3· 0 μ 1。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)中的预扩增反应程序为：95°C预 变性5min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s ;循环35次；72°C终延伸8min。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3)中的PCR-HRM扩增反应体系为： Premix Εχ-Taq 5. 0 μ 1 引物 Ρ3 0. 5μ 1 引物 Ρ4 0. 5μ 1 模板 Ι.ΟμΙ 荧光饱和染料 1 μ 1 ddH20 2· 0 μ 1。
6. 根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于：所述的突光饱和染料为Eva green染 料。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3)中的PCR-HRM扩增反应程序为： 95°〇预变性511^11;951：变性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸3〇8 ;循环35次；681：到8〇1：以 0. 3°C /步的速率进行熔解曲线分析。
8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤4)中所述HRM分析的具体分析过程 为：1)以疫苗株CPVpf?标准样品为对照时，若其基因分型置信值（GCP)大于95%则判定为疫 苗株CPVpf ; 2)以疫苗株CPVint标准样品为对照时，若其基因分型置信值（GCP)大于95%则判定为 疫苗株CPVint ; 3 )以CPV野毒株标准样品为对照时，若其基因分型置信值（GCP)大于95%则判定为CPV 野毒株。
【文档编号】C12Q1/68GK104195265SQ201410419410
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】张建峰, 嘎利兵嘎, 张春红, 刘志成, 郭鹏举, 沈海燕, 朱余军 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所