一种与仔猪腹泻相关的snp标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与仔猪腹泻相关的SNP标记及其应用，该标记DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述序列中的第98个碱基呈现T或G的多态性。该多态性导致所编码的氨基酸发生改变，并且与仔猪腹泻率存在相关。根据该基因的单核苷酸多态性可对基因组DNA中含有ASIP基因的种猪进行仔猪腹泻抗性性状选育，筛选出显著降低仔猪腹泻率优势基因型品种，具有极其重大的应用价值和经济效益。
【专利说明】一种与仔猪腹泻相关的SNP标记及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于猪的分子生物学技术及育种领域，具体是涉及一种与仔猪腹泻率相关 特征的SNP遗传标记及其应用方法。
【背景技术】：
[0002] 我国是世界第一养猪大国，年出栏猪约占全球一半左右。与此同时，我国的猪病多 而泛滥，每年给养猪业造成巨大损失，严重影响着养猪业的发展。仔猪腹泻是猪病中最常见 的疾病之一，猪的死亡率主要发生于初生阶段，若能降低仔猪腹泻率，无疑具有重大的经济 效益。
[0003] 本 申请人:在前期多个科研项目的资助下，在猪的全基因组范围内初步筛选影响仔 猪腹泻的候选基因，猪鼠色信号蛋白（ASIP)就是其中之一。众所周知，ASIP基因对于有机 体色素从深的真黑素转化为浅的表黑素具有重要作用。据报道，ASIP及其神经肽同类物与 鼠色相关的蛋白还参与能量平衡，paracrine信号分子的黑素受体的亚单位具有明显的反 兴奋作用。ASIP在小鼠中广泛分布和表达，可导致动物的表现包括相同的黄皮、肥大、超重 以及类似于人II型糖尿病的代谢紊乱等。这些报道表明ASIP基因对于机体有着广泛、复 杂的影响，当然也有可能与腹泻有关。
[0004] 目前没有关于猪ASIP基因与仔猪腹泻相关性的研究报道。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种与仔猪腹泻率相关特征的 SNP遗传标记及其应用方法。
[0006] 一种与仔猪腹泻相关的SNP标记，DNA序列如SEQ ID NO. 1所示；所述序列中的第 98个碱基呈现T或G的多态性。所述的多态性导致所编码的氨基酸为亮氨酸或缬氨酸。
[0007] 扩增所述的与仔猪腹泻相关的SNP标记的引物对的序列如下：
[0008] 正向引物：5' -ctcgcctcctcttagctacd，
[0009] 反向引物：5'-ctgtgccaccttcttcatcg-3' ?
[0010] 所述的与仔猪腹泻相关的SNP标记用于筛选或者选育仔猪腹泻率低的品种。
[0011] 本发明确定的SNP标记序列即ASIP基因序列，其DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。该序列的第98碱基处有一个碱基突变T98-G98。该突变导致所编码的氨基酸发生改 变，而且仔猪腹泻率高的为亮氨酸（L)，仔猪腹泻率低的为缬氨酸（V)。DNA所编码的氨基酸 序列图如SEQ ID N0. 2所示。
[0012] 利用本发明的SNP标记进行筛选检测，具体包括如下步骤：
[0013] (1)根据GenBank中猪ASIP基因的mRNA序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基 因部分编码序列；
[0014] ⑵获取猪基因组DNA，并以此为模板，PCR扩增，产物纯化，克隆，获得如序列表 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；
[0015] (3)鉴定该基因序列的第98碱基处是否存在多态性。
[0016] 所述引物为：正向引物：5'-ctcgcctcctcttagctacc-3'，
[0017] 反向引物：5' -ctgtgccaccttcttcatcg_3, 〇
[0018] 上述步骤（3)中ASIP基因序列第98碱基处的多态性是指一个碱基突变为T或G。
[0019] 将上述序列翻译为氨基酸序列，结果表明该突变导致所编码的氨基酸发生改变， 亮氨酸（L)突变为缬氨酸（V)。且该突变与仔猪腹泻率存在相关，仔猪腹泻率高的为亮氨酸 (L)，仔猪腹泻率低的为缬氨酸（V)。
[0020] 本发明采用PCR与DNA测序结合的方法首先筛选出ASIP基因为仔猪腹泻的相关 基因，继而从猪ASIP基因上筛选到与性状相关的SNP，并且通过生产实践验证确定ASIP基 因为仔猪腹泻相关基因，筛选的SNP为与之相关的SNP。本发明筛选的猪ASIP基因的SNP 可作为低腹泻率仔猪品种辅助选择的遗传标记，从而培育出腹泻率更低的猪，具有极其重 大的应用价值和经济效益。
【专利附图】
【附图说明】：
[0021] 图1为猪ASIP基因部分序列的PCR-SSCP电泳图。
【具体实施方式】：
[0022] 下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施例并不对本发明做任 何限定。
[0023] 实施例1猪相关基因 SNP筛选
[0024] 选择相同日龄的健康商品仔猪300只进行试验，所有初生仔猪打上耳标后，用肠 毒素大肠杆菌感染，观察3天内仔猪腹泻情况，并记录每头猪的腹泻情况。分别提取其基因 组DNA。对每头猪采集血样，提取DNA后进行扩增、测序；确定每头猪的SNP类型。
[0025] 根据GenBank中猪ASIP基因的mRNA序列，用Primer5. 0设计引物， 覆盖该基因部分编码序列，引物序列为：5' -ctcgcctcctcttagctacc-3 (正向）， 5' -ctgtgccaccttcttcatcg-3'（反向），由上海英韦创津公司合成。用上述引物分别对提取 的猪基因组DNA进行扩增。
[0026] PCR:10yl 反应体系：10Xbuffer(含 Mg2+)lyl,上、下弓| 物（20ymol/L)各 0· 15μ 1，dNTPs(10ymol/L)0. 2μ 1，Taq 酶 1U，DNA(100ng)0. 7μ 1，超纯水补至所需体积。
[0027] PCR扩增程序：94°C 5分钟预变性后30个PCR循环参数为：95°C 30秒，56. 5°C 30 秒，72 °C 30秒，最后72 °C 7分钟。
[0028] 取扩增产物5 μ 1，加入变性剂（95 %甲硝铵）10 μ 1，95°C变性10分钟，再冰浴5分 钟后，点样于15%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳（丙烯酰胺/Ν，Ν' -亚甲基双丙烯酰胺为29 : 1)，电压保持在80?100V，常温下电泳约16?18小时，直至兰色溴酚蓝染料至凝胶最底端 为止。凝胶用硝酸银染色，结果参见图1，SSCP分析结果表现为：猪ASIP基因部分DNA片 段有三种不同条带类型，说明该DNA片段存在SNP。我们将第98碱基为T定义为A等位基 因，第98碱基为G定义为B等位基因，三种不同条带类型分别定义为AA型和BB型，杂合型 定义为AB型。
[0029] 取PCR扩增产物50 μ 1，产物纯化后送上海英韦创津公司测序，测序结果确证了 PCR产物是ASIP基因，PCR产物的长度为 239bp，序列如序列表中的SEQIDN0:l所示。
[0030] 将上述产物进行氨基酸序列分析，结果见SEQ ID NO :2。
[0031] 氨基酸序列分析表明，猪ASIP基因序列的一个碱基突变导致该基因在表达时所 转录的蛋白质中氨基酸序列发生变异，亮氨酸（L)突变为缬氨酸（V)。
[0032] 对300个样品的基因型与仔猪腹泻率进行测定，结果见表1。可见，用肠毒素大肠 杆菌感染时，BB型样本腹泻率高达91. 7%，AB型样本腹泻率为82. 5%，而AA型样本的腹泻 率只有13. 8%，显著低于其他2种基因型。
[0033] 表1各基因型腹泻情况
[0034]
【权利要求】
1. 一种与仔猪腹泻相关的SNP标记，其特征在于，DNA序列如SEQ ID NO. 1所示；所述 序列中的第98个碱基呈现T或G的多态性。
2. 如权利要求1所述的与仔猪腹泻相关的SNP标记，其特征在于，所述的多态性导致所 编码的氨基酸为亮氨酸或缬氨酸。
3. 扩增如权利要求1所述的与仔猪腹泻相关的SNP标记的引物对，其特征在于，所用引 物对的序列如下： 正向引物：5'-ctcgcctcctcttagctacc_3'， 反向引物：5'-ctgtgccaccttcttcatcg_3'。
4. 权利要求1所述的与仔猪腹泻相关的SNP标记用于筛选或者选育仔猪腹泻率低的品 种。
【文档编号】C12Q1/68GK104152453SQ201410429232
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】蒋隽, 刘定发, 周红丽, 何俊, 马海明 申请人:湖南农业大学, 汕尾宝山猪场有限公司, 蒋隽, 刘定发