基因全片段快速测序方法
【专利摘要】本发明提供了基因全片段(>50kb)快速测序方法，该方法包括以下步骤：(1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶，在相同PCR条件下扩增不同基因片段，所述PCR条件优选96℃～100℃变性5～15sec，66℃～70℃退火延伸6～10min，25～35个循环；(2)标准化PCR产物；(3)制备测序文库；(4)基因测序。使用本方法可在相同PCR条件下扩增不同长度基因片段和不同Tm值的引物，相同退火温度及延伸时间即可成功扩增出目的片段，结合MiSeq平台进行测序，为长链PCR与新一代基因测序技术的结合应用提供了一种24小时内生成结果的快速有效的方法。
【专利说明】基因全片段快速测序方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因测序【技术领域】，具体涉及基因全片段快速测序方法。
【背景技术】
[0002] 为了获得目的物的类型和是否具有相关突变等一系列信息，近年来各国相继建立 起病毒变异和耐药基因序列测定的方法。基因序列测定分析法同其他方法相比，在技术上 和经济上都具有明显优势。基因序列测定分析法检测的是易突变区域的完整序列。新一代 的个人基因组测序仪，如Illumina的MiSeq和Ion Torrent公司的PGM，已普遍应用与科研 和临床检测。这些测序平台的多用性和灵活性更适用于科研周期较快速的小型实验室的科 研。将测序与长链PCR结合可以为遗传变异检测提供更快捷更经济的方法。
[0003] 自聚合酶链反应（PCR)出现以来，已成为分子生物学中克隆DNA小片段不可或缺 的方法之一。1992年，Barnes研发了新的PCR条件可以使扩增片段达5KB,通过改变酶的 条件，长链PCR的扩增片段可以从 3_5KB至超过30KB。长链PCR技术的进步使得PCR更快 速、更简洁的用于基因组图谱和测序，并促进分子遗传学的研究。然而，传统的PCR有扩增 片段长度的限制，且在实验中成功地扩增所有扩增子，需要改变退火温度和延伸时间，这是 因为扩增子不同的长度及引物具有不同Tm值。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明提供了基因全片段快速测序方法，该方法结合了长链PCR与新 一代基因测序技术且PCR扩增在相同PCR条件下即可扩增目的片段。
[0005] 基因全片段快速测序方法，该方法包括以下步骤：
[0006] (1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶,在相同PCR条件下扩增不同基因片段，所述PCR 条件优选96°C?100°C变性5?l5sec，66°C?7〇°C退火延伸6?10min，25?35个循环；
[0007] (2)标准化PCR产物；
[0008] (3)制备测序文库；
[0009] (4)基因测序。
[0010] 本发明提供的基因全片段快速测序方法的有益效果是：本发明在相同PCR条件下 扩增不同长度基因片段和不同Tm值的引物，相同退火温度及延伸时间即可成功扩增出目 的片段，并结合MiSeq平台进行测序，为长链PCR与新一代基因测序技术的结合应用提供了 一种快速有效的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是扩增所得目的片段
[0012]图2是与遗传性乳腺癌相关的致病突变，该突变为BRCA2中c. 5946delT
[0013] 图3是所有样品中存在的突变，该突变为BRCA2中c. 4563A>G
[0014] 图4是所有样品中存在的突变，该突变为c. 2972A>G
[0015] 图5是样品2, 7, 8存在的突变，该突变为BRCA1中c. 19410T和c. 1936G>A
【具体实施方式】
[0016] 本发明提供的基因全片段快速测序方法，该方法包括以下步骤：
[0017] (1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶,在相同PCR条件下扩增不同基因片段，所述PCR 条件优选96°C?l〇〇°C变性5?15sec，66°C?70°C退火延伸6?10min，25?35个循环；
[0018] (2)标准化PCR产物；
[0019] (3)制备测序文库；
[0020] (4)基因测序。
[0021] 下面将结合实施例对本发明提供的方法予以进一步的说明。
[0022] 收集八位对照组患者和实验组1例遗传性乳腺癌患者的外周血，提取DNA用于长 链PCR扩增和下一代测序，以评估实验能否在一组患者中稳定使用并成功地识别阳性突变 位点。
[0023] 乳腺癌易感基因的快速测序方法步骤如下：
[0024] (1)选用TaKaRa公司的PrimeSTAR GXL DNA酶，采用在同一温度下退火延伸的 二步法，在相同PCR反应条件下扩增BRCA1和BRCA2的全基因区域，BRCA1基因定位为 CHR17:41196312-41279500, GRCh37/hgl9, BRCA1 基因定位为 CHR13:32889617-32973809， GRCh37/hgl9。
[0025] PCR 扩增体系：35ng DNA 模板，2·5μηιο?Λ 的引物 3.2yL，5XPrimeSTAR 缓冲液 4 μ L，1· 6 μ L dNTP，0· 4LPrimeSTAR GXL DNA酶，加蒸馏水至反应体系总体积20 μ L。所述 引物序列见表1。
[0026] 表1 BRCA1和BRCA2基因引物序列
[0027] ___
【权利要求】
1. 基因全片段快速测序方法，该方法包括以下步骤：（1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶， 在相同PCR条件下扩增不同基因片段，所述PCR条件优选96°C?100°C变性5?15sec， 66°C?70°C退火延伸6?10min，25?35个循环；（2)标准化PCR产物；（3)制备测序文库； ⑷基因测序。
2. 根据权利要求1所述的基因全片段快速测序方法，其特征在于：步骤（1)所述基因 片段为BRCA1和BRCA2基因。
3. 根据权利要求1所述的基因全片段快速测序方法，其特征在于：步骤（2)所述标准 化PCR产物采用Agencourt AMPure XP PCR试剂盒纯化目的片段，使用Qubit dsDNA BR Assay试剂盒标准定量DNA。
4. 根据权利要求1所述的基因全片段快速测序方法，其特征在于：步骤（3)所述文库 制备采用Nextera XT试剂盒进行制备。
5. 根据权利要求1所述的基因全片段快速测序方法，其特征在于：步骤（4)所述基 因测序采用Illumina的MiSeq平台进行测序，使用BWA进行比对，GATK软件分析突变， wANNOVAR网络服务器注释分析结果。
6. 根据权利要求5所述的基因测序，其特征在于：IIIUmina的MiSeq平台进行测序的 测序参数为2X250读长。
【文档编号】C12Q1/68GK104232761SQ201410429092
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】王凯, 汪锋, 赵倩, 贾海英 申请人:武汉凯吉盈科技有限公司