一种同时检测玉米中产afb1、zen、don真菌的方法
【专利摘要】本发明涉及一种同时检测玉米中产AFB1、ZEN、DON真菌的方法，对玉米样品中的DNA进行提取，分别根据编码AFB1、ZEN、DON合成的基因aflR、PKS13、tri5筛选了三对引物组合，并筛选出三种引物组合的多重PCR反应条件，并采用多重PCR法对所提取的DNA中的三个目的基因进行扩增，从而建立了一种能够同时快速检测玉米中三种产毒素真菌的方法。
【专利说明】-种同时检测玉米中产AFB1、ZEN、DON真菌的方法 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用多重PCR方法同时检测玉米中存在的产黄曲霉毒素 B1、玉米 赤霉烯酮、呕吐毒素真菌的方法，属于饲料【技术领域】。 (二）
【背景技术】
[0002] 玉米在大田、储存和运输过程中均可感染多种霉菌，如曲霉属、青霉属、镰刀菌属 真菌等，而且玉米所含有的营养成分及合适的水分含量，极适宜这些真菌的生长，并利于其 产生霉菌毒素，其中最主要的霉菌毒素是黄曲霉毒素 B1 (AFB1)、玉米赤霉烯酮（ZEN)、呕吐 毒素（DON)。这些霉菌毒素造成饲料的饲喂价值降低，对畜禽的组织功能、健康产生不利影 响，甚至导致死亡，影响养殖效益。因此，对于霉菌毒素以及产毒真菌的检测显得至关重要。 目前常用的检测方法包括薄层层析、液相色谱、免疫化学分析等，主要基于对所产生的霉菌 毒素的检测，无法检出己被产毒真菌污染但尚未产毒的高风险样品。多重PCR检测方法，可 在单一泳道反应体系中同时检测多个DNA模板或同一模板的不同区域，具有快捷、高效、低 成本等优点，被广泛应用于有害微生物检测，因此该方法可用于对产毒真菌进行检测。 (三）
【发明内容】
[0003] 为了解决上述问题，本发明提供了一种同时检测玉米中AFB1、ZEN、DON真菌的方 法；目的是设计了三对引物并将其组合，同时建立起三对引物组合的多重PCR反应条件，提 供了一种多重PCR法，用于同时扩增编码AFB1、ZEN、DON等毒素合成的基因 aflR、PKS13、 tri5,实现对玉米中可能存在的具有产毒风险的真菌进行检测。
[0004] 本发明是这样实现的：对玉米样品中的DNA进行提取，分别根据编码AFB1、ZEN、 DON合成的基因 aflR、PKS13、tri5设计筛选了三对引物组合，并筛选出三种引物组合的多 重PCR反应条件，采用多重PCR法对所提取的DNA中的三个目的基因进行扩增，从而建立一 个能够同时检测玉米中三种产毒素真菌的方法，实现对玉米中潜藏性产毒素真菌的预警。
[0005] -种同时检测玉米中产黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素真菌的方法，包括 以下步骤：
[0006] 1、根据Genebank上已发表的aflR、PKS13和tri5基因序列，设计的引物组合为： 一对针对aflR的特异性引物SEQ1和SEQ2 ; -对针对PKS13的特异性引物SEQ3和SEQ4 ; - 对针对tri5的特异性引物SEQ5和SEQ6 ;
[0007] SEQ1 :5'-GCACCCTGTCTTCCCTAACA-3'
[0008] SEQ2 :5'-ACGACCATGCTCAGCAAGTA-3'
[0009] SEQ3 :5'-CTGAGAAATATCGCTACACTACCGAC-3'
[0010] SEQ4:5'-CCCACTCAGGTTGATTTTCGTC-3'
[0011] SEQ5 :5'-GCTGCTCATCACTTTGCTCAG-3'
[0012] SEQ6 :5'-CTGATCTGGTCACGCTCATC-3'
[0013] 2、常规方法提取玉米样品DNA,进行PCR反应；反应体系为：
[0014] lOXTaq PCR Buffer(含 Mg2+) :2· 5μ L ;
[0015] dNTP Mix (2. 5mM each) ：2. Ο μ L ；
[0016] 引物aflR、PKS13、tri5的上游引物各l.OyL，下游引物各l.OyL;
[0017] 提取到的 DNA :500ng ;
[0018] Taq DNA 酶（5U/ μ L) :0· 25 μ L ;
[0019] 用不含RNA酶的灭菌水定容至25 μ L。
[0020] 多重PCR扩增程序如下：
[0021] 首轮循环：预变性，94°C，2min ;
[0022] 中间循环：变性，94°C，30s ;复性，60°C，30s ;延伸，72°C，30s ;进行30个循环
[0023] 末轮循环：延伸，72°C，lOmin。
[0024] 3、对步骤2)得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶检测：如果从样品中扩增出 192bp的产物，则待检玉米样品中有产生ZEN的真菌；如果从样品中扩增出400bp的产物， 则待检玉米样品中有产生AFB1的真菌；如果从样品中扩增出658bp的产物，则待检玉米样 品中有产生DON的真菌。
[0025] 本发明的有益效果是：作为一种可同时检测产AFB1、ZEN、D0N真菌的方法，适用于 生产中对玉米中潜藏性产毒素真菌的检测，简单准确，可以实现对玉米原料是否受到真菌 污染的准确把握，进而预防原料毒素超标引起的饲料产品质量问题。
[0026] (四）【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1第1批次玉米样品多重PCR扩增结果
[0028] 在图1中可以看到，除4号样品外，其余样品均同时扩增出了编码DON合成的基因 tri5和编码ZEN合成的基因 PKS13,由此推知除4号样品外，其余样品均污染了产DON和 ZEN的真菌，这些玉米样品如果用于饲料的加工生产，将有可能导致饲料中含有DON和ZEN ; 图中只有9号样品扩增到了编码AFB1合成的基因 aflR，其余样品中均没有该条带，由此可 知，9号玉米样品污染有产AFB1的真菌。
[0029] 图2第2批次玉米样品多重PCR扩增结果
[0030] 图2中6个样品均同时扩增到了三条目的条带，即6个样品中均含有产AFBUZEN 和DON的真菌。 (五）【具体实施方式】
[0031] 实施例1
[0032] 1、称取过60目筛且经过液氮条件下研磨的玉米样品0.2g置于离心管中，使用 Omega公司的Fungal DNA Kit按下述方法提取真菌DNA:加入1000 μ L Buffer FG1和浓度 为20mg/mL的蛋白酶Κ10μ L，剧烈震荡，使样品混匀；65°C水浴30min，其间取出离心管混 匀2-3次；加入140 μ L Buffer FG2,混匀，10000 Xg离心10min ;取600 μ L上清液至新的 离心管中，加入420 μ L异丙醇，混匀；迅速放入离心机，10000 Xg离心2min ;小心弃去上清 液，确保沉淀不随上清液流出，将离心管倒置lmin，去除残余液体；向离心管中加入预热至 65°C的灭菌水300 μ L使沉淀溶解，再加入4 μ L RNA酶，混匀；加入300 μ L Buffer FG3和 300 μ L无水乙醇，混匀；并将上述混匀的混合物加入吸附柱（按照试剂盒说明书组合吸附 柱和2mL离心管），10000Xg离心lmin，弃去滤液和离心管；将吸附柱移至新的离心管中， 加入700 μ L按试剂盒说明书要求用稀释过的DNA Wash Buffer洗涤吸附柱，lOOOOXg离 心lmin，弃去滤液，并重复该步骤1次；12000Xg离心上一步的吸附柱2min ;然后将吸附柱 移至1. 5mL灭菌离心管，加入100 μ L预热至65°C的Elution Buffer,室温孵育2?3min, lOOOOXg离心lmin，释放吸附柱中的DNA。所得DNA-20°C保存备用。
[0033] 本步骤中所使用的试剂均由Fungal DNA Kit试剂盒提供。其中蛋白酶K购自北 京索莱宝科技有限公司。
[0034] 2、所设计的引物序列如表1所示：
[0035] 表1引物序列
[0036]
【权利要求】
1. 一种同时检测玉米中产黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素真菌的方法，其特 征在于所采用的引物组合为：一对针对aflR的特异性引物SEQ1和SEQ2 ; -对针对PKS13 的特异性引物SEQ3和SEQ4 ; -对针对tri5的特异性引物SEQ5和SEQ6 ; SEQ1 :5'-GCACCCTGTCTTCCCTAACA-3' SEQ2 :5'-ACGACCATGCTCAGCAAGTA-3' SEQ3 :5'-CTGAGAAATATCGCTACACTACCGAC-3' SEQ4 :5'-CCCACTCAGGTTGATTTTCGTC-3' SEQ5 :5'-GCTGCTCATCACTTTGCTCAG-3' SEQ6 :5'-CTGATCTGGTCACGCTCATC-3' 上述引物组合的使用方法如下： 1) 常规方法提取玉米样品DNA,进行PCR反应；反应体系为： 10. Taq PCR Buffer (含 Mg2+) :2· 5 μ L ; dNTP Mix(2. 5mM each) ：2. 0 μ L ； 引物aflR、PKS13、tri5的上游引物各1. 0 μ L，下游引物各1. 0 μ L ; 提取到的DNA :500ng ; Taq DNA 酶（5U/ μ L) :0· 25 μ L ; 用不含RNA酶的灭菌水定容至25 μ L。 多重PCR扩增程序如下： 首轮循环：预变性，94°C，2min ; 中间循环：变性，94°C，30s ;复性，60°C，30s ;延伸，72°C，30s ;进行30个循环 末轮循环：延伸，72°C，10min ; 2) 对步骤2)得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶检测：如果从样品中扩增出192bp 的产物，则待检玉米样品中有产生ZEN的真菌；如果从样品中扩增出400bp的产物，则待检 玉米样品中有产生AFB1的真菌；如果从样品中扩增出658bp的产物，则待检玉米样品中有 产生DON的真菌。
【文档编号】C12Q1/68GK104152574SQ201410432481
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】林海, 焦洪超, 伏春燕, 宋志刚 申请人:山东农业大学