一种含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂及其制备方法

一种含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂及其制备方法，属于益生菌制备【技术领域】。所述益生菌剂是由粪肠球菌HEW-A131活性菌泥、枯草芽孢杆菌活性菌泥、酿酒酵母菌活性菌泥和稳定化保护剂按质量比0.1-0.8∶1-2.5∶0.1-0.5∶1均匀混合，经制粒、干燥、包被等工艺制备而成；所述益生菌剂不但可以提高动物的饲料利用效率，节约成本，而且大大改善了动物体内消化道内环境的稳态，促进营养的吸收利用，促进动物生长，显著提高了动物的生产性能、免疫性能和繁殖性能，降低了生产成本，提高了经济效益。
CGMCC NO9353
2014.06.17
【专利说明】一种含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂及其制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及鸡饲料益生菌剂，具体是一种含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂及其制备 方法。

【背景技术】
[0002] 在现代饲养业中，饲料中添加抗生素始于五十年代，对防治疾病，促进生长，节省 饲料，提高养殖经济效益起到重要作用。但是，随着饲料中长期大量地添加抗生素及化学合 成药物，在养殖生产中出现了动物体内病原微生物产生耐药性，应用效果降低，生产成本加 大；动物体内产生药物依赖，自身的免疫机能抑制，免疫力和抗病力降低；动物体内有益菌 被抑制，菌群失调，形成内源性感染；动物产品及排泄物药物残留，危及人体健康；动物体 内耐药菌的扩散，引起公共安全等重大问题，亟待解决。
[0003] 因此，从八十年代始，有关益生菌在养殖业的应用研究快速发展。目前，国内外益 生菌研究涉列有益菌80余个品种。我国颁布的《饲料添加剂品种目录（2006)》准予使用菌 共有16个。国内市场推广的芽孢杆菌制剂有促菌生、整肠生、抑菌生、乳康生等；乳酸菌制 剂以乳酸菌属和双歧杆菌属为主。益生菌作为一种新型天然的生物活性添加剂，无毒，无抗 药性，无残留，并具有增强免疫力，促进生长，提高饲料利用率的功效，替代抗生素应用养殖 生产中。
[0004] 乳酸菌是一类重要的益生菌，是动物肠道中一类重要的优势菌群。乳酸菌制剂作 为一种新型的绿色动物微生态制剂，因其无毒、无抗药性、无残留、无副作用而备受饲料界 的广泛关注。采用乳酸菌作为益生菌饲喂动物，除了由于乳酸菌具有一定的营养作用和对 肠道的粘附作用外，主要在于乳酸菌对于一些腐败菌和有害菌具有抑制作用。第一，乳酸菌 可以产生乳酸，创造酸性环境抑制有害菌及不耐酸的腐败菌生长；第二，乳酸菌产生H 2O2, 激活过氧化氢酶-硫氰酸系统，抑制和杀灭革兰氏阴性菌、过氧化氢酶阳性细菌等；第三， 部分乳酸菌可以产生抑菌性的细小蛋白质或肽类，称为细菌素，对大肠杆菌等致病菌有拮 抗作用。而且，有了产生抑菌蛋白的乳酸菌，就可以生产细菌素，可以替代抗生素，使动物生 产更安全。分离筛选可以产生细菌素的乳酸菌成为现在益生菌开发的研究热点。
[0005] 粪链球菌又叫粪肠球菌（Enterococcus faecalis)，是乳酸菌中的一种，其菌体形 态为链球或球状，菌体直径大小〇. 3 y m?0. 7 y m，无芽孢；稀释后在肉汤琼脂平板上形成 的菌落圆形、乳白色，表面凸起湿润，有光泽，边缘整齐，大多数成双或短链状排列，通常不 运动。粪链球菌是目前微生物青贮接种剂主要菌种之一，它经过系列工艺制成的微生物制 剂直接投喂养殖动物后，有利于改善肠道内微生态平衡，防治动物肠道菌丛区系紊乱，还 能分解蛋白质为小肽、合成B族维生素等功效。它也能增强巨嗜细胞的活性，促进动物的免 疫反应，提高抗体水平。粪链球菌的生理特性有如下几点：（1)粪链球菌分泌的乳酸为L型 乳酸，又称为自然乳酸或生理乳酸，可全被动物吸收利用。乳酸杆菌分泌的乳酸L型和D型 都有，但D型则不能被动物吸收利用。在动物的肠道里。粪链球菌可在肠内形成生物薄膜 附着在肠道粘膜上，可以在肠道内发育、生长、繁殖，繁殖时问很短，19min分裂一次。粪链 球菌还可把部分蛋白质分解成酰胺和氨基酸，把大部分的碳水化合物的无氮浸出物转化为 乳酸，而且能使饲料里的纤维变软，所以饲料的转化吸收率就比较高。粪链球菌分解的这些 特殊营养成分弥补了常规饵料的营养缺陷，对各种养殖动物幼体起到了十分重要的营养强 化和促生长作用。（2)粪链球菌产生的抗菌物质大多是肽或蛋白质，被称为细菌素。粪链 球菌可分泌两类细菌素，一类仅只是对相关的菌有抑制作用，抗菌谱较窄，可阻碍病原微生 物接触肠粘膜细胞；另一类具有广谱抗菌活性，它们对致病菌如：沙门氏菌、致贺氏病和假 单孢菌都有很好的抑制作用。所以，长期在饲料中添加粪链球菌可以减少养殖动物肠炎等 疾病的发生。粪链球菌在生长和代谢过程中产生对养殖动物有益的营养物质，如乳酸、氨基 酸、维生素、酶及抑菌物质。在畜禽养殖过程中，添加了粪链球菌不仅有利于提高饲料的消 化率，同时也相应降低了排泄物中的氨态氮的浓度，减少了排泄物的不消化物，改善了饲养 环境，减少了污染，既有防腐作用又增加饲料的风味，促进养殖动物的食欲。（3)由于饲料中 饼柏、麦麸等农副产品中的植酸磷含量较高，对钙等矿物质元素利用造成影响，而在粪链球 菌的生理作用下通过催化、水解等反应分泌出的L-乳酸，它可以对钙质合成L-乳酸钙，促 进养殖动物对钙质的吸收。所以饲料中添加粪链球菌可减少养殖中有机物和矿物质排泄量 有效地减少水质污染。
[0006] 目前，益生菌制剂以广泛应用于养殖生产，但在制备技术方面尚存在诸多问题： (1)产品标准不统一，生产企业自行设立标准，缺乏科学依据，益生菌含量过高或过低，影响 使用效果；（2)生产菌种来源不明，大多数企业生产用菌种相互转接，没有经过分离选育， 菌种退化严重，生理活性降低；（3)菌种配伍缺乏科学依据，单一菌株，双菌株，甚至多菌株 随意配比，不能说明菌株间配伍的合理性，达不到菌株优良性状，通过合理配伍而互补，协 同性差；（4)生产工艺混乱，不能按菌种的不同生理特性区别培养，不少生产企业采用多菌 种混合培养，不用发酵罐，甚者采用堆集发酵，致使益生菌生长少，杂菌丛生。


【发明内容】

[0007] 为了解决上述益生菌剂菌种退化严重，生物活性低等问题，本发明提供一种含粪 肠球菌的高效鸡饲料益生菌剂。
[0008] 本发明另一目的是提供一种含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂的制备方法。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] 所述益生菌剂是由粪肠球菌（Enterococcus faecal is)活性菌泥、枯草芽孢杆菌 (Bacillus su btilis)活性菌泥、酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen)活性 菌泥和稳定化保护剂制备而成；
[0011] 所述奠肠球菌（Enterococcus faecalis)活性菌泥、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)活性菌泥、酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen)活性菌泥和稳定化 保护剂混合的质量比为0.1-0. 8 : 1-2. 5 : 0.1-0. 5 : 1。
[0012] 所述粪肠球菌为粪肠球菌（Enterococcus faecalis)HEW_A131，该菌株耐热性强、 耐酸碱范围宽泛、抗逆性、益生性更加显著，已于2014年6月17日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO. 9353,分类命名为粪 肠球菌 Enterococcus faecalis。
[0013] 所述粪肠球菌（Enterococcus faecalis)HEW_A131具有以下微生物学特征：粪肠 球菌HEW-A131是革兰氏阳性菌，在肠球菌琼脂培养基上生长迅速，35°C培养24h形成白色、 圆形、边缘光滑整齐、凸起、直径为1?I. 5_的菌落，并且周围有蓝黑色环带，，显微镜下 菌体呈卵圆形、成对成链存在、无芽孢，兼性厌氧生长；粪肠球菌HEW-A131生长适宜温度范 围：41：-651：，最适生长温度 ：201：-451：;生长适宜？111.5-11，最适？11值为6-8。
[0014] 所述粪肠球菌HEW-A131具有显著的益生性，能显著抑制大肠杆菌（Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、沙门氏菌（Salmonella sp.)、肺 炎克雷伯氏菌（Klebsiella peneumoniae)、志贺氏菌属（Shigella sp.)、韦荣氏球菌 (Veillonella sp.)、绿胺杆菌（Pseudomonas aeruginosa)、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida)等病原菌的生长繁殖，具有广谱 抑菌性。
[0015] 所述粪肠球菌HEW-A131具有较强的抗逆性，能够耐受模拟胃酸、模拟胆盐以及高 温环境，并且能保持较高的活菌存活率，其活菌存活率可达到93-99%，更加适合饲料工业 和畜牧养殖业的要求。
[0016] 所述粪肠球菌活性菌泥的制备方法如下：
[0017] 将经活化的粪肠球菌HEW-A131斜面菌种挑取1-2环接种于液体种子培养基35°C、 180r/min培养3-5h，得到种子液（活菌浓度为10 9CFU/mL);取3mL种子液接种于300mL摇 瓶种子培养基中35°C、180r/min培养6h，得到摇瓶种子液；取0. 30L摇瓶种子液接种于装 有30L发酵种子培养基的50L发酵罐中，35°C、I lOr/min发酵3-5h，得到发酵罐种子液；取 30L发酵罐种子液接种于装有3000L发酵培养基的5000L发酵罐中，5-38°C，80-100r/min， 培养6-12h得到发酵液，发酵液经10000-16000r/min离心20-40min即得粪肠球菌活性菌 泥；
[0018] 所述发酵液活菌数彡I. I X 101QCFU/mL ;
[0019] 所述斜面培养基质量组分组成为：葡萄糖2%，蛋白胨1 %，酵母提取物 0.5%，柠檬酸二铵 0.2%，醋酸钠 0.5%，牛肉膏 1%，吐温-80 0? 1%，K2HPO4O. 2%， MgSO4 ? 7H200. 0058%，MnSO4 ? 4H200. 025%，琼脂粉 L 5%，余量为水，pH 7. 0±0. 2 ;
[0020] 所述液体种子培养基、摇瓶种子培养基、发酵罐种子培养基质量组分组成为：蔗 糖 2. 5 %，大豆蛋白胨 L 8 %，酵母提取物 0? 4 %，MgSO4 ? 7H200. 2 %，MnSO4 ? 4H200. 045 %， NaClO. 2 %，柠檬酸二铵 0? 2 %，CaCO3O. 6 %，余量为水，pH7. 0 ±0? 2 ;
[0021] 所述发酵培养基质量组分组成为：红糖1.5%，大豆蛋白胨0.5%，酵母提取物 0. 4 %，硫酸镁0. 2 %，硫酸锰0. 045 %，氯化钠0. 2 %，柠檬酸二铵0. 5 %，碳酸钙0. 1 %，消泡 剂 0? 005%，余量为水，pH5. 5-6. 8。
[0022] 所述枯草芽孢杆菌活性菌泥的制备方法如下：
[0023] 取经活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种1-2环接种于300mL -级种子培养基中，进行 摇瓶发酵培养，发酵温度为20-45°C、转速200r/min，发酵时间10-20h，得到一级种子液。将 一级种子液转接到50L发酵罐二级种子培养基中，接种量为1-2 %，装液量为30L、发酵温度 为20-45°C、拌转速150r/min，培养5-10h得到二级种子液，将二级种子液转接到发酵培养 基中，接种量2-6 %，接种后，温度控制在20-45°C，搅拌转速120-180r/m，培养30-48h得到 枯草芽孢杆菌发酵液，发酵液经10000-16000r/min离心20-40min即得枯草芽孢杆菌活性 菌泥；
[0024] 所述发酵液活菌数彡I. OX 101(lCFU/mL。
[0025] 所述斜面培养基为牛肉膏、蛋白胨培养基；
[0026] 所述一级、二级种子培养基质量组分组成为：葡萄糖2%，玉米浆干粉0. 6%，豆柏 粉 2%，酵母提取物 0? 5%，MgS04 ? 7H200. 1%，MnSO4 ? 4H200. 02%，余量为水，pH7. 0±0. 2 ;
[0027] 所述发酵培养基为：红糖1.5%，酵母粉0.5%，玉米粉1.5%，NaClO. 5%， MgSO4 ? 7H200. 1%，MnSO4 ? 4H200. 02%，余量为水，pH70±0. 2。
[0028] 所述酿酒酵母菌活性菌泥的制备方法如下：
[0029] 取经活化的酿酒酵母菌斜面菌种1-2环接种于300mL -级种子培养基中，进行摇 瓶发酵培养，发酵温度为20-35°C、转速120r/min，发酵时间8-15h，得到一级种子液。将一 级种子液转接到50L发酵罐二级种子培养基中，接种量为1-2 %，装液量为30L、发酵温度为 20-35°C、搅拌转速120r/min，培养5-10h得到二级种子液，将二级种子液转接到发酵培养 基中，接种量5-10%，接种后，温度控制在20-35°C，搅拌转速100_150r/m，培养30-72h得 到酿酒酵母菌发酵液，发酵液经10000-16000r/min离心20-40min即得酿酒酵母菌活性菌 泥；
[0030] 所述发酵液活菌数彡8. 0 X IO9CFUAiL ;
[0031] 所述斜面培养基为PDA培养基；
[0032] 所述一级、二级种子培养基质量组分组成为；葡萄糖2%，酵母粉1%，大豆蛋白胨 2%，余量为水，pH7.0±0.2 ;
[0033] 所述发酵培养基质量组分组成为；糖蜜2%，酵母提取物0. 7%，黄豆饼粉1. 2%， 余量为水，pH7. 0±0. 2。
[0034] 所述稳定化保护剂的制备方法如下：
[0035] 以重量份数计，准确称取玉米淀粉40-60份，微晶纤维素5-25份，羧甲基纤维素钠 1-8份，葡聚糖3-5份，甘油2-4份，乳糖1-3份，取原料总重量20-35%的水，首先将微晶纤 维素、羧甲基纤维素钠和葡聚糖均匀混合得混合物，将混合物加入水中室温浸泡3-5h，边升 温边搅拌，80-90°C保温20-30min，搅拌，充分溶解，继续保温，边搅拌边依次加入乳糖、甘油 和玉米淀粉，充分搅拌，混合5-10min即得稳定化保护剂。
[0036] 上述含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂的制备方法，包括如下步骤：
[0037] 将粪肠球菌活性菌泥、枯草芽孢杆菌活性菌泥、酿酒酵母菌活性菌泥和稳定化保 护剂按质量比0.1-0. 8 : 1-2. 5 : 0.1-0. 5 : 1置于搅拌罐中，启动搅拌器，均匀混合 15-30min，搅拌转速30-60r/m，接着加水调节混合料湿度为32-35%，得微囊菌湿粉；将微 囊菌湿粉投入制粒机内，调节粒度为20-40目，然后投入旋流流化床制粒包衣机中干燥，干 燥进风温度控制在55-65°C，出风温度控制在28-32°C，干燥时间50-70min ;最后启动侧喷 包衣装置，进风温度控制在45-65 °C，雾化压力为0. 1-0. 2MPa，将包被剂溶液以10-30mL/ min速度分三个喷头喷向旋流状态的物料，在微粒物料中形成包衣膜层，经30-60min得到 20-40目鸡饲料益生菌剂。
[0038] 所述包被剂溶液由如下质量组分的原料均匀混合、充分溶解制备：玉米淀粉 1-3 %、海藻酸钠1-15 %、羟丙基甲基纤维素4-8 %、果胶3-5 %、卡拉胶3-5 %、甘露聚糖 1-10%、低聚异麦芽糖2-8%、脱脂奶粉2-10%、麦芽糊精5-20%、余量为水。
[0039] 本发明还有一个目的是所述含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂在家禽养殖中的应用。 其是将益生菌剂作为添加剂，添加到家禽的饮水或饲料中。其中，所述粪肠球菌HEW-A131 在饮水中的添加量为l〇 6-l〇8CFU/L饮水；所述粪肠球菌HEW-A131在饲料中的添加量为 105-10 7CFU/kg 饲料。
[0040] 有益效果：
[0041] 1.本发明的益生菌剂不但可以提高动物的饲料利用效率，节约成本，而且大大改 善了动物体内消化道内环境的稳态，促进营养的吸收利用，促进动物生长，显著提高了动 物的生产性能、免疫性能和繁殖性能，降低了生产成本，提高了经济效益。
[0042] 2.本发明的益生菌剂用量较少，例如在饲料中仅为106CFU/kg时即可发挥显著作 用，具体表现在：
[0043] 1)可显著提高种鸡的生产性能及繁殖性能：与对照组相比，试验组料蛋比降低 24. 81 %，死淘率降低57. 14%，种蛋合格率提高2. 02 %，种蛋受精率提高2. 5 %，健雏率提 闻 2. 49!%。
[0044] 2)可显著提高白羽肉鸡的生产性能及免疫性能，与对照组相比，料肉比降低 35. 77%，死淘率降低56%。
[0045] 3)可显著提高蛋鸡的生产性能、免疫性和鸡蛋品质，有效替代抗生素添加剂，适合 大规模推广使用。其中，料蛋比抗生素组降低14. 98%，比普通组降低25. 11 %;死淘率比抗 生素组降低13. 54%，比普通组降低34. 65%;鸡蛋质量指标光泽、蛋壳厚度、哈氏单位、蛋黄 颜色明显优于抗生素组和普通组。
[0046] 4)可显著提高罗斯308肉鸡的生产性能，出栏只均重较对照组提高10. 11%，料肉 比降低了 0. 17,且成活率较对照组提高2. 18%，表明通过饲用益生菌剂后，动物机体抗病 力和抗应激能力得到很大提升。
[0047] 5)可显著提高樱桃谷肉鸭的生产性能，与对照组相比分别提高肉鸭0?21日龄、 22?42日龄、1-42日龄肉鸭日增重7. 60%、4. 04%、5. 35%，分别降低料肉比0? 09、0. 2、 0. 17 (P < 0. 05)。显著提高了樱桃谷肉鸭前期、后期和全期的日增重（P < 0. 05)，显著降低 各阶段料肉比（P < 〇. 05)。还可提高肉鸭成活率。

【具体实施方式】
[0048] 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段 均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的 范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本 发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也 属于本发明的保护范围。
[0049] 实施例1原料制备
[0050] 1?粪肠球菌活性菌泥的制备
[0051] 所述粪肠球菌活性菌泥的制备方法如下：
[0052] 将经活化的粪肠球菌HEW-A131斜面菌种挑取2环接种于液体种子培养基35°C、 180r/min培养4h，得到活菌浓度为IO 9CFUAiL的种子液；取3mL种子液接种于300mL摇瓶 种子培养基中35°C、180r/min培养6h，得到摇瓶种子液；取0. 30L摇瓶种子液接种于装有 30L发酵种子培养基的50L发酵罐中，35°C、I lOr/min发酵4h，得到发酵罐种子液；取30L发 酵罐种子液接种于装有3000L发酵培养基的5000L发酵罐中，35°C，90r/min，培养8h得到 发酵液，发酵液经16000r/min离心20min即得粪肠球菌活性菌泥；
[0053] 所述发酵液活菌数I. 4X 101QCFU/mL ;
[0054] 所述斜面培养基质量组分组成为：葡萄糖2%，蛋白胨1 %，酵母提取物 0.5%，柠檬酸二铵 0.2%，醋酸钠 0.5%，牛肉膏 1%，吐温-80 0? 1%，K2HPO4O. 2%， MgSO4 ? 7H200. 0058%，MnSO4 ? 4H200. 025%，琼脂粉 L 5%，余量为水，pH 7. 0±0. 2。
[0055] 所述液体种子培养基、摇瓶种子培养基、发酵罐种子培养基质量组分组成为：蔗 糖 2. 5 %，大豆蛋白胨 L 8 %，酵母提取物 0? 4 %，MgSO4 ? 7H200. 2 %，MnSO4 ? 4H200. 045 %， NaClO. 2 %，柠檬酸二铵 0? 2 %，CaCO3O. 6 %，余量为水，pH7. O ;
[0056] 所述发酵培养基质量组分组成为：红糖1.5%，大豆蛋白胨0.5%，酵母提取物 0. 4 %，硫酸镁0. 2 %，硫酸锰0. 045 %，氯化钠0. 2 %，柠檬酸二铵0. 5 %，碳酸钙0. 1 %，消泡 剂0. 005%，余量为水，pH6. 0。
[0057] 2.枯草芽孢杆菌活性菌泥的制备
[0058] 所述枯草芽孢杆菌活性菌泥的制备方法如下：
[0059] 取经活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种2环接种于300mL -级种子培养基中，进行摇 瓶发酵培养，发酵温度为37°C、转速200r/min，发酵时间15h，得到一级种子液。将一级种子 液转接到50L发酵罐二级种子培养基中，接种量为2%，装液量为30L、发酵温度为37°C、拌 转速150r/min，培养8h得到二级种子液，将二级种子液转接到发酵培养基中，接种量4%， 接种后，温度控制在37°C，搅拌转速150r/m，培养40h得到枯草芽孢杆菌发酵液，发酵液经 16000r/min离心20min即得枯草芽孢杆菌活性菌泥；
[0060] 所述发酵液活菌数2. I X 101(lCFU/mL。
[0061] 所述斜面培养基为牛肉膏、蛋白胨培养基；
[0062] 所述一级、二级种子培养基质量组分组成为：葡萄糖2%，玉米浆干粉0. 6%，豆柏 粉 2%，酵母提取物 0? 5%，MgS04 ? 7H200. 1%，MnSO4 ? 4H200. 02%，余量为水，pH7. 0 ;
[0063] 所述发酵培养基为：红糖1.5%，酵母粉0.5%，玉米粉1.5%，NaClO. 5%， MgSO4 ? 7H200. 1 %，MnSO4 ? 4H200. 02%，余量为水，pH7. 0 ;
[0064] 3.酿酒酵母菌活性菌泥的制备
[0065] 所述酿酒酵母菌活性菌泥的制备方法如下：
[0066] 取经活化的酿酒酵母菌斜面菌种2环接种于300mL -级种子培养基中，进行摇瓶 发酵培养，发酵温度为28°C、转速120r/min，发酵时间12h，得到一级种子液。将一级种子 液转接到50L发酵罐二级种子培养基中，接种量为2%，装液量为30L、发酵温度为28°C、 搅拌转速120r/min，培养8h得到二级种子液，将二级种子液转接到发酵培养基中，接种量 8 %，接种后，温度控制在28°C，搅拌转速120r/m，培养48h得到酿酒酵母菌发酵液，发酵液 经16000r/min离心20min即得酿酒酵母菌活性菌泥；
[0067] 所述发酵液活菌数I. 5 X 101(lCFU/mL ;
[0068] 所述斜面培养基为PDA培养基；
[0069] 所述一级、二级种子培养基质量组分组成为；葡萄糖2%，酵母粉1%，大豆蛋白胨 2%，余量为水，pH7. 0 ;
[0070] 所述发酵培养基质量组分组成为；糖蜜2%，酵母提取物0. 7%，黄豆饼粉I. 2%， 余量为水，PH7. 0。
[0071] 4.稳定化保护剂的制备
[0072] 所述稳定化保护剂的制备方法如下：
[0073] 以重量份数计，准确称取玉米淀粉50份，微晶纤维素15份，羧甲基纤维素钠5份， 葡聚糖4份，甘油3份，乳糖2份，取原料总重量30%的水，首先将微晶纤维素、羧甲基纤维 素钠和葡聚糖均匀混合得混合物，将混合物加入水中室温浸泡4h，边升温边搅拌，85°C保温 25min，搅拌，充分溶解，继续保温，边搅拌边依次加入乳糖、甘油和玉米淀粉，充分搅拌，混 合8min即得稳定化保护剂。
[0074] 实施例2
[0075] -种含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂，其制备方法包括如下步骤：
[0076] 将粪肠球菌活性菌泥、枯草芽孢杆菌活性菌泥、酿酒酵母菌活性菌泥和稳定化保 护剂按质量比0.5 : 1.8 : 0.3 : 1置于搅拌罐中，启动搅拌器，均匀混合22min，搅拌转 速50r/m，接着加水调节混合料湿度为33 %，得微囊菌湿粉；将微囊菌湿粉投入制粒机内， 调节粒度为30目，然后投入旋流流化床制粒包衣机中干燥，干燥进风温度60°C，出风温度 控制在30°C，干燥时间60min ;最后启动侧喷包衣装置，进风温度控制在55°C，雾化压力为 0. 15MPa，将包被剂溶液以20mL/min速度分三个喷头喷向旋流状态的物料，在微粒物料中 形成包衣膜层，经50min得到30目鸡饲料益生菌剂；
[0077] 所述包被剂溶液由如下质量组分的原料均匀混合、充分溶解制备：玉米淀粉2%、 海藻酸钠8%、羟丙基甲基纤维素6%、果胶4%、卡拉胶4%、甘露聚糖8%、低聚异麦芽糖 6%、脱脂奶粉6%、麦芽糊精15%、余量为水。
[0078] 实施例3
[0079] -种含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂，其制备方法包括如下步骤：
[0080] 将粪肠球菌活性菌泥、枯草芽孢杆菌活性菌泥、酿酒酵母菌活性菌泥和稳定化保 护剂按质量比0.1 : 1 : 0.1 : 1置于搅拌罐中，启动搅拌器，均匀混合15min，搅拌转 速60r/m，接着加水调节混合料湿度为32 %，得微囊菌湿粉；将微囊菌湿粉投入制粒机内， 调节粒度为20目，然后投入旋流流化床制粒包衣机中干燥，干燥进风温度55°C，出风温度 28°C，干燥时间50min ;最后启动侧喷包衣装置，进风温度控制在45°C，雾化压力为0. IMPa， 将包被剂溶液以lOmL/min速度分三个喷头喷向旋流状态的物料，在微粒物料中形成包衣 膜层，经30min得到20目鸡饲料益生菌剂；
[0081] 所述包被剂溶液由如下质量组分的原料均匀混合、充分溶解制备：玉米淀粉1%、 海藻酸钠1%、羟丙基甲基纤维素4%、果胶3%、卡拉胶3%、甘露聚糖1%、低聚异麦芽糖 2 %、脱脂奶粉2 %、麦芽糊精5 %、余量为水。
[0082] 实施例4
[0083] 一种含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂，其制备方法包括如下步骤：
[0084] 将粪肠球菌活性菌泥、枯草芽孢杆菌活性菌泥、酿酒酵母菌活性菌泥和稳定化保 护剂按质量比0.8 : 2.5 : 0.5 : 1置于搅拌罐中，启动搅拌器，均匀混合30min，搅拌转 速30r/m，接着加水调节混合料湿度为35%，得微囊菌湿粉；将微囊菌湿粉投入制粒机内， 调节粒度为40目，然后投入旋流流化床制粒包衣机中干燥，干燥进风温度65°C，出风温度 32°C，干燥时间70min ;最后启动侧喷包衣装置，进风温度控制在65°C，雾化压力为0. 2MPa， 将包被剂溶液以30mL/min速度分三个喷头喷向旋流状态的物料，在微粒物料中形成包衣 膜层，经60min得到40目鸡饲料益生菌剂；
[0085] 所述包被剂溶液由如下质量组分的原料均匀混合、充分溶解制备：玉米淀粉3%、 海藻酸钠15%、羟丙基甲基纤维素8%、果胶5%、卡拉胶5%、甘露聚糖10%、低聚异麦芽糖 8%、脱脂奶粉10%、麦芽糊精20%、余量为水。
[0086] 实施例5肉种鸡生产性能和繁殖性能试验
[0087] 选用30周龄AA父母代肉种鸡4000只，随机分成2处理，每处理4个重复，每个重 复500只鸡。试验日粮饲喂阶段30-39周龄。对照组为原基础日粮组，试验组基础日粮添加 本发明实施例2制备的鸡饲料益生菌剂（每千克饲料含2X 106CFU粪肠球菌HEW-A131)。
[0088] 表1鸡饲料益生菌剂对种鸡生产性能的影响
[0089]

【权利要求】
1. 一种含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂是由粪肠球菌 (Enterococc us faecalis)活性菌泥、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)活性菌泥、酿酒 酵母菌（Saccharomyce s cerevisiae Hansen)活性菌泥和稳定化保护剂制备而成； 所述粪肠球菌保藏编号为CGMCC NO. 9353 ; 所述稳定化保护剂的制备方法如下：以重量份数计，准确称取玉米淀粉40-60份，微晶 纤维素5-25份，羧甲基纤维素钠1-8份，葡聚糖3-5份，甘油2-4份，乳糖1-3份，取原料总 重量20-35%的水，首先将微晶纤维素、羧甲基纤维素钠和葡聚糖均匀混合得混合物，将混 合物加入水中室温浸泡3-5h，边升温边搅拌，80-90°C保温20-30min，搅拌，充分溶解，继续 保温，边搅拌边依次加入乳糖、甘油和玉米淀粉，充分搅拌，混合5-10min即得稳定化保护 剂。
2. 如权利要求1或2所述的含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂，其特征在于，所述粪肠球菌 活性菌泥、枯草芽孢杆菌活性菌泥、酿酒酵母菌活性菌泥和稳定化保护剂混合的质量比为 0· 1-0. 8 : 1-2. 5 : 0· 1-0. 5 : 1。
3. 如权利要求1或2所述的含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂，其特征在于，所述粪肠球菌 活性菌泥的制备方法如下：将经活化的粪肠球菌斜面菌种挑取1-2环接种于液体种子培养 基35°C、180r/min培养3-5h，得到种子液；取3mL种子液接种于300mL摇瓶种子培养基中 35°C、180r/min培养6h，得到摇瓶种子液；取0. 30L摇瓶种子液接种于装有30L发酵种子培 养基的50L发酵罐中，35°C、1 lOr/min发酵3-5h，得到发酵罐种子液；取30L发酵罐种子液 接种于装有3000L发酵培养基的5000L发酵罐中，5-38°C，80-100r/min，培养6-12h得到发 酵液，发酵液经10000-16000r/min离心20-40min即得粪肠球菌活性菌泥。
4. 如权利要求3所述的含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂，其特征在于，所述发酵培养基 质量组分组成为：红糖1. 5 %，大豆蛋白胨0. 5 %，酵母提取物0. 4 %，硫酸镁0. 2 %，硫酸 锰0. 045 %，氯化钠0. 2 %，柠檬酸二铵0. 5 %，碳酸钙0. 1 %，消泡剂0. 005 %，余量为水， ρΗ5· 5-6. 8。
5. 如权利要求1所述的含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢 杆菌活性菌泥的制备方法如下：取经活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种1-2环接种于300mL 一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为20-45°C、转速200r/min，发酵时间 10-20h，得到一级种子液。将一级种子液转接到50L发酵罐二级种子培养基中，接种量为 1-2%，装液量为30L、发酵温度为20-45°C、拌转速150r/min，培养5-10h得到二级种子液， 将二级种子液转接到发酵培养基中，接种量2-6 %，接种后，温度控制在20-45°C，搅拌转 速120-180r/m，培养30-48h得到枯草芽孢杆菌发酵液，发酵液经10000-16000r/min离心 20-40min即得枯草芽孢杆菌活性菌泥。
6. 如权利要求1或2所述的含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂，其特征在于，所述酿酒酵 母菌活性菌泥的制备方法如下：取经活化的酿酒酵母菌斜面菌种1-2环接种于300mL -级 种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为20-35°C、转速120r/min，发酵时间8-15h， 得到一级种子液。将一级种子液转接到50L发酵罐二级种子培养基中，接种量为1-2%， 装液量为30L、发酵温度为20-35°C、搅拌转速120r/min，培养5-10h得到二级种子液，将 二级种子液转接到发酵培养基中，接种量5-10%，接种后，温度控制在20-35°C，搅拌转 速100-150r/m，培养30-72h得到酿酒酵母菌发酵液，发酵液经10000-16000r/min离心 20-40min即得酿酒酵母菌活性菌泥。
7. 如权利要求1或2所述含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂的制备方法，其特征在于，包 括如下步骤：将粪肠球菌活性菌泥、枯草芽孢杆菌活性菌泥、酿酒酵母菌活性菌泥和稳定化 保护剂按质量比0.1-0. 8 : 1-2. 5 : 0.1-0. 5 : 1置于搅拌罐中，启动搅拌器，均匀混合 15-30min，搅拌转速30-60r/m，接着加水调节混合料湿度为32-35%，得微囊菌湿粉；将微 囊菌湿粉投入制粒机内，调节粒度为20-40目，然后投入旋流流化床制粒包衣机中干燥，干 燥进风温度控制在55-65°C，出风温度控制在28-32°C，干燥时间50-70min ;最后启动侧喷 包衣装置，进风温度控制在45-65 °C，雾化压力为0. 1-0. 2MPa，将包被剂溶液以10-30mL/ min速度分三个喷头喷向旋流状态的物料，在微粒物料中形成包衣膜层，经30-60min得到 20-40目鸡饲料益生菌剂。
8. 如权利要求7所述含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂的制备方法，其特征在于，所述 包被剂溶液由如下质量组分的原料均匀混合、充分溶解制备：玉米淀粉1-3 %、海藻酸钠 1-15 %、羟丙基甲基纤维素4-8 %、果胶3-5 %、卡拉胶3-5 %、甘露聚糖1-10 %、低聚异麦芽 糖2-8%、脱脂奶粉2-10%、麦芽糊精5-20%、余量为水。
9. 如权利要求7所述含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂的制备方法，其特征在于，所述粪 肠球菌活性菌泥、枯草芽孢杆菌活性菌泥和酿酒酵母菌活性菌泥在制备过程中发酵液活菌 数分别大于等于 1. lXl〇lclCFU/mL、l· 0X10lclCFU/mL 和 8. 0X109CFU/mL。
10. 如权利要求1或2所述含粪肠球菌的鸡饲料益生菌剂在家禽养殖中的应用，其 是将益生菌剂作为添加剂，添加到家禽的饮水或饲料中，其中，所述粪肠球菌HEW-A131 在饮水中的添加量为l〇 6-l〇8CFU/L饮水；所述粪肠球菌HEW-A131在饲料中的添加量为 105-10 7CFU/kg 饲料。
【文档编号】C12R1/865GK104293697SQ201410476593
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】李雪平 申请人:李雪平