一种发酵生产安普霉素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种微生物发酵生产安普霉素的方法，该方法包括斜面培养、种子液培养、发酵培养的过程，操作简单，在发酵培养的过程中补加了玉米浆，从而大幅提高了安普霉素的发酵单位。所述方法制备安普霉素的发酵单位能达到8400U/mL。
【专利说明】一种发酵生产安普霉素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵【技术领域】，具体涉及一种发酵生产安普霉素的方法。
【背景技术】
[0002]安普霉素是一种氨基糖苷类抗生素，较为特别的是，其化学结构中含有辛二糖结构。安普霉素具有抗菌谱广、作用强、残留少、毒性低、不易产生耐药性等特点，广泛应用于大肠杆菌、沙门氏菌和支原体引起的感染。作为药物型饲料添加剂，安普霉素能明显促进增重和提高饲料转化率，在畜禽养殖领域得到了广泛的应用。
[0003]安普霉素由黑暗链霉菌发酵产生，目前对微生物发酵法生产安普霉素的研究主要是菌种的诱变处理、发酵培养基的优化，或者发酵工艺的优化，并没有取得很好的效果。2002年田威在《安普霉素产生菌的研究》中利用诱变处理、发酵工艺优化，在4m3发酵罐上发酵最高效价达到5390U/mL。1997年熊宗贵在《尼拉霉素单组份安普霉素高产菌株的研究》中利用均匀设计方法优化使得摇瓶效价达到6800 μ g/mL。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种发酵生产安普霉素的方法，该方法能大幅提高安普霉素的发酵单位，发酵生产安普霉素的发酵单位最高能达到8400U/mL。
[0005]为了实现本发明所述目的，发明人提供了以下技术方案。
[0006]一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，包括以下操作步骤:
[0007]a.斜面培养:将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，每支斜面的砂土孢子接种量为0.003-0.005g,在温度37.0±1°C、湿度30-60%的条件下培养120-144h，得到斜面孢子；
[0008]b.种子液培养:将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，斜面孢子的接种量为l_4cm2，种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1°C、湿度30-60%、转速180-200rpm的条件下培养20_24h，得到种子液；
[0009]c.发酵培养:将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中，种子液的接种量为发酵培养基体积的5 %，在温度37.0 ± IV、湿度30-60 %、转速200_220rpm的条件下培养40-48h，随后加入玉米浆继续培养80-96h，即得到含有安普霉素的发酵液。
[0010]所述步骤a中，斜面培养基按质量百分比的组成为:玉米淀粉2.0% -2.5%、硝酸钾0.1 % -0.2 %、硫酸镁0.025 % -0.05 %、氯化钠0.04% -0.06 %、磷酸二氢钾0.04% -0.06%、酵母粉 0.1% -0.2%、碳酸钙 0.1% -0.3%、琼脂 2.0% -2.5%0 砂土孢子在斜面培养基上培养后，斜面上的孢子丰满，颜色均匀一致，孢子层厚。
[0011]所述步骤a中，湿度为40-50%，培养的时间为140h。此步骤所选择的条件的好处同上一段所述的斜面培养基的好处。
[0012]所述步骤b中，种瓶培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖2.0% -2.5%、玉米淀粉 1.5 % -2.0 %、低温黄豆饼粉 2.0%-3.0%,碳酸钙 0.2%-0.4%、硫酸镁 0.05%-0.1%,酵母粉0.1% -0.3%、硫酸铵0.1% -0.15%、玉米浆1% -2%。斜面孢子接种于种瓶培养基中，培养完成后镜检菌丝粗壮、交织成网状，达到优良种子液标准。
[0013]所述步骤b中，湿度为40-50%，转速为180rpm，培养的时间为22h。此步骤所选择的条件的好处同上一段所述的种瓶培养基的好处。
[0014]所述步骤c中，发酵培养基按质量百分比的组成为:低温黄豆饼粉3.0% -4.0%,玉米淀粉5.0 % -7.0 %、碳酸钙0.4 % -0.5 %、磷酸二氢钾0.1 % -0.2 %、氯化铵0.6% -0.7%、硫酸锌 0.02% -0.03%、硫酸镁 0.05% -0.1 %、淀粉酶 0.1% -0.15%。发酵培养基的好处需要和玉米浆的添加的好处结合一起考虑，玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、氨基酸、维生素等成分，是抗生素发酵中十分重要的有机氮源。
[0015]所述步骤c中，湿度为40-50%，转速为220rpm，培养45h后，加入玉米浆后继续培养 90h。
[0016]所述步骤c中，玉米浆的加入量为发酵液体积的0.5% -1.0 %。
[0017]所述玉米浆的加入量为发酵液体积的0.7%。
[0018]本发明所述发酵生产安普霉素的方法，通过在发酵摇瓶培养过程中加入玉米浆，使得安普霉素发酵单位大幅度提高。有文献报道在发酵过程中添加氨基酸能够促进安普霉素的产量，玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、氨基酸、维生素等成分，是抗生素发酵中十分重要的有机氮源。此发明在发酵过程中添加玉米浆，使发酵单位显著提高。具体是在发酵培养45h，加入玉米浆后继续培养90h，培养完成后最高发酵效价达到8400U/mL。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。
[0020]实施例1
[0021]斜面培养基按质量百分比的组成为:玉米淀粉2.3%、硝酸钾0.2%、硫酸镁0.05%、氯化钠0.05%、磷酸二氢钾0.05%、酵母粉0.2%、碳酸钙0.3%、琼脂2.5%。
[0022]种瓶培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖2.0%、玉米淀粉2.0%、低温黄豆饼粉2.5 %、碳酸钙0.3 %、硫酸镁0.1 %、酵母粉0.2 %、硫酸铵0.15 %、玉米浆2 %。
[0023]发酵培养基按质量百分比的组成为:低温黄豆饼粉4.0%、玉米淀粉6.0%、碳酸钙0.5 %、磷酸二氢钾0.2%、氯化铵0.6%、硫酸锌0.03 %、硫酸镁0.1%、淀粉酶0.15%。
[0024]a.斜面培养:将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，砂土孢子的接种量为0.005g，在温度37.0±1°C、湿度50%的条件下培养140h，得到斜面孢子；
[0025]b.种子液培养:将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，斜面孢子的接种量为3cm2的斜面孢子接种于种瓶培养基，种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1°C、湿度50%、转速180rpm的条件下培养22h，得到种子液；
[0026]c.发酵培养:将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中，种子液的接种量为发酵培养基体积的5 %，在温度37.0 ± IV、湿度50 %、转速220rpm的条件下培养45h后，随后加入玉米浆，加入玉米浆的量为发酵液体积的0.7% (v/v% )，然后继续培养90h，即得到含有安普霉素的发酵液。
[0027]将制备得到的安普霉素发酵液进行检测，测得安普霉素的发酵单位为8400U/mL。
[0028]将安普霉素发酵液进行酸碱预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液，洗脱液经过浓缩、脱色，真空干燥最终得到安普霉素。
[0029]实施例2
[0030]斜面培养基按质量百分比的组成为:玉米淀粉2.0 %、硝酸钾0.1 %、硫酸镁
0.025 %、氯化钠0.04%,磷酸二氢钾0.04%,酵母粉0.1%、碳酸钙0.1%、琼脂2.0%.
[0031]种瓶培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖2.0%、玉米淀粉1.5%、低温黄豆饼粉2.0 %、碳酸钙0.2 %、硫酸镁0.05%、酵母粉0.1 %、硫酸铵0.1 %、玉米浆1%。
[0032]发酵培养基按质量百分比的组成为:低温黄豆饼粉3.0%、玉米淀粉5.0%、碳酸钙0.4 %、磷酸二氢钾0.1%、氯化铵0.6%、硫酸锌0.02 %、硫酸镁0.05%、淀粉酶0.1%。
[0033]a.斜面培养:将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，砂土孢子的接种量为0.003g，在温度37.0±1°C、湿度50%的条件下培养144h，得到斜面孢子；
[0034]b.种子液培养:将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，斜面孢子的接种量为Icm2的斜面孢子接种于种瓶培养基，种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1°C、湿度50%、转速200rpm的条件下培养24h，得到种子液；
[0035]c.发酵培养:将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中，种子液的接种量为发酵液体积的5 %，在温度37.0 ± IV、湿度50 %、转速200rpm的条件下培养48h，随后加入玉米浆，加入玉米浆的量为发酵液体积的0.5% (v/v% )，然后继续培养80h，即得到含有安普霉素的发酵液。
[0036]将制备得到的安普霉素发酵液进行检测，测得安普霉素的发酵单位为8200U/mL。
[0037]将安普霉素发酵液进行酸碱预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液，洗脱液经过浓缩、脱色，真空干燥最终得到安普霉素。
[0038]实施例3
[0039]斜面培养基按质量百分比的组成为:玉米淀粉2.5%、硝酸钾0.2%、硫酸镁
0.05%、氯化钠0.06%、磷酸二氢钾0.06%、酵母粉0.2%、碳酸钙0.3%、琼脂2.5%。
[0040]种瓶培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖2.5%、玉米淀粉2.0%、低温黄豆饼粉3.0 %、碳酸钙0.4%、硫酸镁0.1 %、酵母粉0.3 %、硫酸铵0.15%、玉米浆2 %。
[0041]发酵培养基按质量百分比的组成为:低温黄豆饼粉4.0%、玉米淀粉7.0%、碳酸钙0.5 %、磷酸二氢钾0.2%、氯化铵0.7%、硫酸锌0.03 %、硫酸镁0.1%、淀粉酶0.15%。
[0042]a.斜面培养:将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，砂土孢子的接种量为0.004g，在温度37.0±1°C、湿度60%的条件下培养120h，得到斜面孢子；
[0043]b.种子液培养:将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，斜面孢子的接种量为4cm2的斜面孢子接种于种瓶培养基，种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1°C、湿度60%、转速200rpm的条件下培养20h，得到种子液；
[0044]c.发酵培养:将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中，种子液的接种量为发酵液体积的5 %，在温度37.0 ± IV、湿度60 %、转速220rpm的条件下培养40h，随后加入玉米浆，加入玉米浆的量为发酵液体积的1.0% (v/v% )，然后继续培养96h，即得到含有安普霉素的发酵液。
[0045]将制备得到的安普霉素发酵液进行检测，测得安普霉素的发酵单位为8000U/mL。
[0046]将安普霉素发酵液进行酸碱预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液，洗脱液经过浓缩、脱色，真空干燥最终得到安普霉素。
[0047]实施例4
[0048]斜面培养基按质量百分比的组成为:玉米淀粉2.0 %、硝酸钾0.2 %、硫酸镁
0.025 %、氯化钠0.06 %、磷酸二氢钾0.04 %、酵母粉0.2%、碳酸钙0.1 %、琼脂2.0%o
[0049]种瓶培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖2.5%、玉米淀粉2.0%、低温黄豆饼粉2.0%、碳酸钙0.2%、硫酸镁0.1 %、酵母粉0.1 %、硫酸铵0.15%、玉米浆1.5%。
[0050]发酵培养基按质量百分比的组成为:低温黄豆饼粉4.0%、玉米淀粉5.0%、碳酸钙0.5 %、磷酸二氢钾0.1 %、氯化铵0.7 %、硫酸锌0.02 %、硫酸镁0.1 %、淀粉酶0.1%。
[0051]a.斜面培养:将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，砂土孢子的接种量为0.004g，在温度37.0±1°C、湿度40%的条件下培养130h，得到斜面孢子；
[0052]b.种子液培养:将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，斜面孢子的接种量为3cm2的斜面孢子接种于种瓶培养基，种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0±1°C、湿度40%、转速180rpm的条件下培养22h，得到种子液；
[0053]c.发酵培养:将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中，种子液的接种量为发酵液体积的5 %，在温度37.0 ± IV、湿度50 %、转速220rpm的条件下培养42h，随后加入玉米浆，加入玉米浆的量为发酵液体积的0.9% (v/v% )，然后继续培养85h，即得到含有安普霉素的发酵液。
[0054]将制备得到的安普霉素发酵液进行检测，测得安普霉素的发酵单位为8100U/mL。
[0055]将安普霉素发酵液进行酸碱预处理、离子交换树脂吸附、解吸得到洗脱液，洗脱液经过浓缩、脱色，真空干燥最终得到安普霉素。
【权利要求】
1.一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，包括以下操作步骤: a.斜面培养:将黑暗链霉菌生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，每支斜面的砂土孢子接种量为0.003-0.005g，在温度37.0±1°C、湿度30-60%的条件下培养120_144h，得到斜面孢子； b.种子液培养:将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，斜面孢子的接种量为l_4cm2，种瓶培养基的装量为500mL装液50mL。在温度37.0土1°C、湿度30_60%、转速180-200rpm的条件下培养20_24h，得到种子液； c.发酵培养:将步骤b制备得到的种子液接种于发酵培养基中，种子液的接种量为发酵培养基体积的5%，在温度37.0土 1°C、湿度30-60%、转速200_220rpm的条件下培养40-48h，随后加入玉米浆继续培养80-96h，即得到含有安普霉素的发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤a中，斜面培养基按质量百分比的组成为:玉米淀粉2.0% -2.5%、硝酸钾0.1% -0.2%、硫酸镁0.025 % -0.05 %、氯化钠0.04% -0.06 %、磷酸二氢钾0.04% -0.06 %、酵母粉0.1% -0.2%、碳酸钙 0.1% -0.3%、琼脂 2.0% -2.5%。
3.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤a中，湿度为40-50%，培养的时间为140h。
4.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤b中，种瓶培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖2.0% -2.5%、玉米淀粉1.5% -2.0%、低温黄豆饼粉 2.0% -3.0%、碳酸钙 0.2% -0.4%、硫酸镁 0.05% -0.1%、酵母粉 0.1% -0.3%,硫酸铵0.1% -0.15%、玉米浆1% -2%。
5.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤b中，湿度为40-50%，转速为180rpm，培养的时间为22h。
6.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤c中，发酵培养基按质量百分比的组成为:低温黄豆饼粉3.0% -4.0%、玉米淀粉5.0% -7.0%、碳酸钙 0.4% -0.5%、磷酸二氢钾 0.1% -0.2%、氯化铵 0.6% _0.7%、硫酸W 0.02% -0.03 %、硫酸镁 0.05% -0.1 %、淀粉酶 0.1% -0.15%。
7.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤c中，湿度为40-50%，转速为220rpm，培养45h后，加入玉米浆后继续培养90h。
8.根据权利要求1所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述步骤c中，玉米浆的加入量为发酵液体积的0.5% -1.0 %。
9.根据权利要求8所述的一种发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，所述玉米浆的加入量为发酵液体积的0.7%。
【文档编号】C12P19/48GK104232709SQ201410512424
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】李可乐, 刘聪洁, 袁昉, 王绘砖, 李敏 申请人:河北圣雪大成制药有限责任公司