一种热稳定性碳酸酐酶的异源表达及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种热稳定性碳酸酐酶的异源表达及应用，以及该碳酸酐酶在CO2吸收领域的应用，通过本技术的碳酸酐酶，具有好的有机胺耐受性，并能够促进有机胺对CO2吸收。本发明还涉及分离的氨基酸编码热稳定性碳酸酐酶，核苷酸的核酸构建及表达方式。
【专利说明】一种热稳定性碳酸酐酶的异源表达及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物酶领域，具体是指一种热稳定性碳酸酐酶的异源表达及其应用。
【背景技术】
[0002] C02等温室气体的减排越来越受到国际社会的广泛关注，已成为国际能源领域研 发的热点。全世界每年共排放三百多亿吨C02，造成了严重的温室效应。因此，0)2的捕捉和 储存（CarbonCaptureandStorage，简称CCS)已经刻不容缓。
[0003]目前主要有三种不同类型的C02捕捉系统，即燃烧前脱碳（Pre-combustion)、富 氧燃烧脱碳（〇xy-fuel combustion)和燃烧后脱碳（Post-combustion),其中最成熟的是 燃烧后脱碳，即在燃烧排放的烟气中捕捉C02。目前常用的C02捕捉技术主要有化学吸收法 (利用酸碱性吸收）和物理吸收法（变温或变压吸附），此外还有膜分离技术是公认的在能 耗和设备紧凑性方面具有非常大潜力的技术，目前正处于开发阶段。化学吸收法因其吸收 效果好得到广泛研究，其中最常用的是有机胺溶液吸收法。不同种类的胺液在C02吸收过 程中，由于其吸收机理不同，表现出的特性也不同，各自存在优势和局限性。伯胺（如乙醇 胺MEA)、仲胺（如二乙醇胺DEA)具有较大的吸收速率，但是吸收量不大，解吸能耗也偏高； 而叔胺（如N-甲基二乙醇胺MDEA)虽然具有吸收量大、易于解吸的优点，但整体吸收速率 太低。所以，采用单一的醇胺对C02进行吸收具有很大的缺陷。较为理想的吸收剂就应该同 时具有较大的吸收能力又仅需较低的再生能量，如活化的叔胺溶液，这样形成新的混合胺 溶液既保持了叔胺解吸能耗低的优点，又改善了单一叔胺溶液吸收速率低的特点。然而，由 于现有化学吸附技术主要采用的吸收溶液为一乙醇胺（Monoethanolamine，MEA)，存在着较 多的弊端，如捕捉效率较低，需要较大的设备（较长的管道）来达到较高的捕捉率，固定资 产投资较大；主体吸收剂MEA不够稳定，循环使用次数少且会降解；而且MEA对管道的腐蚀 较强，需添加额外的钝化剂；同时，MEA法捕捉C02后在释放C02阶段，需要较高的温度（约 110°C)来解吸附C02，能耗很高等，导致捕捉项目成本过高，无法进行工业化推广。
[0004] 基于此，近年来开发了一种新型的方法即采用生物酶-碳酸酐酶来加快co2捕捉 速率。碳酸酐酶（CarbonicAnhydrase，简称CA)作为一种Zn+依赖的金属酶，能够可逆地催 化CO^PHCOf之间的转化，作用机制见图 1(AlainC.Pierre，ISRNChemicalEngineering， 2012)，鉴于此种催化特性，可以利用CA与有机胺类溶液结合应用于C02捕捉，见图2(Alain C.Pierre,ISRNChemicalEngineering, 2012)，从而加快(1)2捕捉速率，提高捕捉效率；同 时，在C02释放阶段，利用生物酶催化方法来实现在较低温度下的C02释放和再生，从而降低 能耗和设备制造成本。
[0005] 然而，运用碳酸酐酶进行C02捕捉目前仍处于研发阶段，未有中试示范装置建设和 工业化应用的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种热稳定性碳酸酐酶，该酶具有较好的热稳定性和高浓度 有机胺溶液耐受性，具有极大的工业化应用潜力和良好的工业化应用前景。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] -种热稳定性碳酸酐酶的异源表达，所述热稳定性碳酸酐酶是，
[0009] 具有如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQIDN0 :2的氨基酸序列具有至 少90%同一性。
[0010] 编码权利要求1所述的多肽的基因。
[0011] 其核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0012] 根据上述的稳定性碳酸酐酶，所述碳酸酐酶的核苷酸序列编码，实现在大肠杆菌 中异源可溶性表达。
[0013] 一种热稳定性碳酸酐酶的应用，所述热稳定性碳酸酐酶应用于co2吸收领域。
[0014] 所述C02为气体形态。
[0015] 所述热稳定性碳酸酐酶应用于有机胺co2吸收领域。
[0016] 在添加有所述热稳定性碳酸酐酶的有机胺溶液中，C02吸收率随着有机胺浓度的 增大而减小。
[0017] 所述有机胺包括有脂肪胺类、醇胺类、酰胺类、脂环胺类、芳香胺类或萘系胺类中 的一种或几种组合。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 本技术方案的碳酸酐酶，能够加快C02捕捉速率，提高捕捉效率；同时，在C02释放 阶段，利用生物酶催化方法来实现在较低温度下的C02释放和再生，从而降低能耗和设备 制造成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为碳酸酐酶可逆地催化C02和HCCV之间的转化的作用机制；
[0021] 图2为碳酸酐酶与有机胺类结合应用于C02捕捉的原理图；
[0022] 图3为碳酸酐酶热稳定性检验图；
[0023] 图4为碳酸酐酶的MDEA耐受性对照图；
[0024] 图5为碳酸酐酶促进MDEA吸收的对照图；
[0025] 图6为MDEA浓度对碳酸酐酶促进C02吸收的影响图；
[0026] 图7为碳酸酐酶促进MDEA吸收混合气中的C02趋势图。
【具体实施方式】
[0027] 以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅 能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。
[0028] 本发明提供一种热稳定性碳酸酐酶的异源表达，所述热稳定性碳酸酐酶是，
[0029] 具有如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQIDN0 :2的氨基酸序列具有至 少90%同一性。更优选为至少具有98%同一性，最优选为具有100%同一性。
[0030] 编码权利要求1所述的多肽的基因。
[0031] 其核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0032] 碳酸酐酶的核苷酸序列编码，实现在大肠杆菌中异源可溶性表达。
[0033] 所述碳酸酐酶在pH值6. 0-9. 0环境下保持活性。
[0034] 所述碳酸酐酶在低于80°C的范围内具有好的温度稳定性。
[0035] 所述碳酸酐酶对有机胺具有好的耐受性。
[0036] 所述碳酸酐酶具有促进有机胺吸收C02的效果，此技术能够吸收的C02为气态C02。
[0037] 在添加有所述碳酸酐酶的有机胺溶液中，C02吸收率随着有机胺浓度的增大而减 小。
[0038] 所述有机胺包括有脂肪胺类、醇胺类、酰胺类、脂环胺类、芳香胺类或萘系胺类中 的一种或几种组合。
[0039] 在申请中的碳酸酐酶，应用于C02吸收领域，此处的C02是指各种生产领域所产生 的含有C02气体的领域。
[0040] 本申请的具有热稳定性的碳酸酐酶，是通过以下方法制备的：
[0041] 培养基制备
[0042] LB培养基，在每升LB培养基中，酵母提取物（Yeastextract)5g/L;胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L;NaCl10g/L，LB培养基的pH为 7. 0,在 121°C灭菌 20min。
[0043] 碳酸酐酶的基因序列重组质粒的构建及表达
[0044] 首先，根据Blast比对得到碳酸酐酶核苷酸序列（SDQIDNo:1，命名为PaCA)编 码区域的基因片段，经优化后进行全基因合成，在5'和3'端分别带有Ndel和HindIII酶 切位点，该基因片段和质粒口￡121&"(^^611)分别用制61和把11(1111限制性内切酶（他界 EnglandBiolabs，NEB)双酶切后在连接反应液中进行连接反应，连接反应液在本实施例中 为l〇y1,其中，T4DNA连接酶（Takara) 1ii1 ;10XT4BufTer(10XLigationBuffer) 1ii1 ;基 因片段与质粒8iil，在本实施例中，基因片段与质粒的摩尔比5 : 1，连接反应液在16°C水 浴反应8-16h。
[0045] 然后，取连接反应液5iU进行琼脂糖凝胶电泳验证是否连接成功，验证成功的将 剩余反应液5ill加到100ill的E.coliDH5a感受态细胞（大肠杆菌DH5a感受态细胞， 购于天根生化科技（北京）有限公司）中，置于冰上30分钟，42°C热激90s，迅速放在冰上 冷却2min，接着加入无菌的800yl的LB液体培养基，在37°C，160rpm培养lh;然后培养液 在3000rpm离心2min，吸掉700yl的上清液，用移液枪轻轻吹打重悬菌体；然后涂布到含 有50yg/ml氨苄的LB培养基固体平板上，培养12-16h。挑取单菌落打入10ylddH20 (重 蒸水），进行菌落PCR(polymerasechainreaction)验证，筛选出阳性克隆单菌落。菌落 PCR反应体系在本实施例中用量为25iU，其中，单菌落悬液liU，r-Taq聚合酶（5U/iU， Takara)0.5iil，dNTPMixture(2.5mMeach，Takara)2iil，10XPCRBuffer2.5iil，引物 丁7(2011]?)和17七61'(2011]\0各0.5111，（1(11120 18111。？〇?验证条件是：941：预变性5111111; 94°C变性30s;55°C退火lmin;72°C延伸lmin;30循环；72°C10min。琼脂糖凝胶电泳验证 阳性克隆的单菌落接种到5ml的LB液体培养基中，培养12h，取lml送测序同时留样保存在 15%甘油的EP管中。
[0046] 最后，把重组质粒PaCA_pET21a转化到BL21 (DE3)感受态细胞（购于天根生化科 技（北京）有限公司）。在37°C，200rpm培养菌液0D_达到0. 4-0. 6 ;0D_指的是某种溶液 在600nm波长处的吸光值。然后加入0.ImM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)，温度调至30°C 低温诱导12h;菌体破壁后去上清液检测酶活可知是可溶性表达。
[0047]PaCA粗酶液制备
[0048] 培养基配方
[0049] 种子培养基配方：在每升种子培养基中，酵母提取物（Yeastextract) 5g/L;胰蛋 白胨（作5^1：0116)1(^/1;似〇11(^/1。
[0050] 发酵培养基配方：在每升发酵培养基中，（NH4)2S041. 93g/L;MgS04 ? 7H203. 87g/L; KOH2. 5g/L；KH2P0414. 65g/L；Glucose20g/L〇
[0051] 微量元素母液：每升微量元素母液中，FeS04 ? 7H20 2. 8g/L，MnCl2 ? 4H202g/L， CoCl2 ? 2. 8g/L，CuCl2 ? 2H20 0? 2g/L，ZnS04 ? 7H20 0? 3g/L，上述微量元素母液溶于lmol/L HC1。
[0052] 补料：60%葡萄糖，工业氨水
[0053] 灭菌和接种
[0054] 校正pH和温度电极的零点和斜率，校正溶氧电极的零点，加入发酵培养基，定 容至5L，115°C，保压灭菌20min。开启循环水冷却至100°C以下，开搅拌250rpm，培养基 降温稳定至37°C，开启氨水自动调节pH至7. 0,调节压缩空气的通气比为1:1，维持罐压 0. 045MPa，标定溶氧 100 %。
[0055]摇瓶种子液0D_达到1-2之间时接种，接种量为5 %，添加终浓度100mg/L的氨 苄，按照lml/L比例添加过滤除菌的微量元素母液。
[0056] 过程调控
[0057] 通过提高转速和通气量维持D0高于25%，pH用氨水自动调节。期间溶氧突 变上升后开始补60 %葡萄糖水溶液，根据pH和D0变化来调控补糖速率，当0D_增长至 40±2时，降温稳定至30°C后添加终浓度ImMIPTG诱导，在本申请的其它实施例中，稳定至 20°C-37°C，均是可溶性表达，其中可选择 20°C、25°C、28°C、30°C、32°C、35°C、37°C，其中以 30°C为最优选择。
[0058] 发酵24h后，0D_趋于稳定，降温至20°C以下，过程中逐步降低通气和搅拌，放罐 收集菌体。
[0059] 粗酶液制备
[0060]菌体用PB(50mM，pH7. 0)缓冲液清洗两遍后，加入2:1菌体重量的PB(50mM，pH 7.0)缓冲液重悬菌体，搅拌均匀后用高压匀浆破碎机破壁，离心收集上清，加入终浓度1% 的聚乙烯亚胺絮凝搅拌lh，在12000rpm30min离心取上清即得到粗酶液。
[0061] 粗酶液低温冷冻干燥可得到冻干粉。
[0062] 碳酸酐酶活性检测
[0063] 根据Wilbur-Anderson方法检测碳酸酐酶的水合C02活性，100iiL的酶液（稀释 至T大于30s)加入到5ml冰浴的Tris-Hcl(20mM，pH8. 3)缓冲液中，再加入1. 5ml冰浴的 饱和C02水溶液开始计时pH从8. 3降到6. 3所需时间，酶活定义为（TfT) /T，I；为不加酶 所需时间，T为加酶所需时间。
[0064]PaCA的热稳定性检测
[0065] 取10ml上述粗酶液分别放在60°C、70°C和80°C水浴，分别在lh、6h、24h取样测碳 酸酐酶水合C02活性。以初始的酶活为基准，测得残余相对酶活见图3,可知70°C处理24h 后残余酶活为60 %，且去除了大量杂蛋白，纯度从10 %提高到了 46. 9 %。说明该酶有很好 的温度稳定性，适合应用于高温反应。
[0066]PaCA的MDEA耐受性检测
[0067] 配置不同浓度的MDEA溶液（浓度分别为1M、2M、3M、4M、5M、6M)各100mL，加入 8000U/ml的PaCA，分别混匀静置24h，48h。通过吸收实验研究CA对不同浓度MDEA的耐受 性，反应器为500ml带夹套玻璃反应器（高径比为8:1)，反应体系为270mL3MMDEA+30ml 静置处理后的酶混合液，C02通入速率为0. 6L/min(气石通入），温度维持在25°C，空白对照 是添加800U/ml未处理的PaCA，在线检测反应过程中体系质量的变化，S卩C02的吸收量。测 得lOmin吸收C02速率，如图4所示，处理24h和48h的C02吸收速率与对照相差不大，说明 该酶对MDEA有比较好的耐受性。
[0068] PaCA促进MDEA吸收的检测试验
[0069] 反应器为500ml带夹套玻璃反应器（高径比为8:1)，反应体系为300ml3MMDEA 添加不同浓度的PaCA，空白对照不加PaCA，C02通入速率为0. 6L/min(气石通入），反应温 度维持在25°C。在线检测反应过程中体系质量的变化，即0)2的吸收量。测得lOmin吸收 C〇2速率，如图5所示。可知添加酶的C02吸收速率比对照高，且添加800U/ml的酶效果更 好。
[0070]MDEA浓度对PaCA促进C02吸收的影响试验
[0071] 选取800U/mlPaCA分别添加到不同溶度的MDEA中进行吸收C02反应，反应体系为 300ml不同浓度的MDEA加800U/mlPaCA，空白对照不加PaCA，C02通入速率为0. 6L/min(气 石通入），反应温度维持在25°C。在线检测C02的吸收量，根据MDEA与C02吸收比为1: 1， 可计算吸收率a(a=C02吸收量/理论C02吸收量）。计算吸收30min的吸收率作图得 到图6。可知随着MDEA浓度的增大，a越低。用3M的MDEA做吸收反应时，加CA的效果最 好。
[0072]PaCA促进MDEA吸收混合气中的C02试验
[0073]为了模仿捕捉电厂排出来的尾气，用PaCA和MDEA混合液捕捉混合气中的C02(15%C02,85%N2)。反应体系跟上述一样，300ml3MMDEA，加上 800U/mlPaCA，在线检测 C02的吸收量（图7)，60min内加PaCA的C02吸收量和吸收速率比对照高，说明PaCA对捕 捉混合气中的C02有明显的促进作用。
[0074] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种热稳定性碳酸酐酶的异源表达，其特征在于：所述热稳定性碳酸酐酶是 具有如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO :2的氨基酸序列具有至少 90%同一性。
2. 编码权利要求1所述的多肽的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的热稳定性碳酸酐酶的异源表达，其特征在于：所述碳酸酐酶的核苷酸序列编码，实现在大肠杆菌中异源可溶性表达。
5. 根据上述权利要求项1-4中任一项所述的热稳定性碳酸酐酶的应用，其特征在于： 所述热稳定性碳酸酐酶应用于C02吸收领域。
6. 根据权利要求5所述的热稳定性碳酸酐酶的应用，其特征在于：所述C02为气体形 态。
7. 根据权利要求5所述的热稳定性碳酸酐酶的应用，其特征在于：所述热稳定性碳酸 酐酶应用于有机胺C02吸收领域。
8. 根据权利要求7所述的热稳定性碳酸酐酶的应用，其特征在于：在添加有所述热稳 定性碳酸酐酶的有机胺溶液中，C02吸收率随着有机胺浓度的增大而减小。
9. 根据权利要求7所述的热稳定性碳酸酐酶的应用，其特征在于：所述有机胺包括有 脂肪胺类、醇胺类、酰胺类、脂环胺类、芳香胺类或萘系胺类中的一种或几种组合。
【文档编号】C12N15/70GK104328105SQ201410531671
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月10日 优先权日:2014年10月10日
【发明者】祝俊, 余允东, 龙辉, 周晓青, 张燕, 张敏, 汪浩, 陈婷婷 申请人:上海立足生物科技有限公司