细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用的制作方法

细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用，本发明还公开了一种细菌菌蜕的大规模发酵方法。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了细菌菌蜕的大规模制备方法，为菌蜕疫苗的商品化生产奠定了坚实的基础；此外，本发明系统性的评价了菌蜕的佐剂功能，结果表明菌蜕能极大的提高病毒性疫苗的免疫效力，而且菌蜕作为佐剂使用方法简单，可一定程度的降低疫苗的生产成本，对人类和动物病毒性传染病的防控具有重大意义。
【专利说明】细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及细菌菌蜕的规模化发酵制备方法与菌蜕作为佐剂在病毒性疫苗中的 应用。本发明属于基因工程与免疫学【技术领域】。

【背景技术】
[0002] 细菌菌蜕（bacterial ghost，BG)是在革兰氏阴性菌中通过控制PhiX174噬菌体 的裂解蛋白E的表达使宿主菌发生裂解而产生的细胞空壳。E蛋白介导的溶菌通道大小受 细胞个体差异影响，孔径介于40nm到200nm之间。通道一旦形成，细菌胞浆内容物在内外 渗透压的作用下通过通道流出胞外，形成一个完成的细菌空壳。E蛋白介导的溶菌作用已成 功应用于各种大肠杆菌、沙门氏菌、胸膜肺炎放线杆菌、肺炎克雷伯氏菌、幽门螺旋杆菌、霍 乱弧菌、流感嗜血杆菌、巴氏杆菌等。范围如此之大说明E蛋白介导的溶菌可能会在所有革 兰氏阴性菌中发生。
[0003] 菌蜕本身可以作为一种很好的疫苗。其外壳结构没有被破坏，保留与活菌一样的 胞膜结构和相关抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫细胞通过模式识别受体识别的高度保守 结构 PAMP(pathogen-associated molecular patterns)，例如脂多糖、肤聚糖、CpG、OmpA、 菌毛等，能有效地被抗原递呈细胞（APCs)吞噬、加工和递呈。这也是菌蜕与常规灭活疫苗 相比的一个突出优势。目前，菌蜕通过静脉、皮下、气体等途径免疫已经在小鼠、兔子、猪等 动物模型中取得了良好的免疫保护效果。用胸膜肺炎放线杆菌菌蜕经气体免疫接种猪，诱 导了针对A. pleuropneumoniae引起的胸膜肺炎的完全保护。霍乱弧菌菌脱经皮下注射小 鼠诱导血清产生高水平的抗霍乱的抗体并且足以保护新生小鼠免遭霍乱弧菌的感染。另 夕卜，菌蜕又是完美的载体，可以接收大量的外源物质。重组蛋白可通过特定的膜锚定结构插 入细胞膜，或填充于胞周间隙和细胞空腔中，以获得重组菌蜕多价苗和多联苗。
[0004] 菌蜕生产简单，发酵后可用离心重悬的方法进行收集，并可以冻干的形式保存于 室温，无需像蛋白疫苗那样复杂的纯化工作。理想的菌蜕不含胞浆、核酸等内容物，因此不 存在毒力增强的问题，使用安全，对环境无污染。
[0005] 理想的佐剂是以最小的免疫刺激可引起适当的免疫促进作用，且无不良反应。铝 盐佐剂是目前兽用疫苗和人用疫苗上应用最广泛的佐剂，已大量应用于细菌、病毒等病原 微生物疫苗，虽然该佐剂在提高抗体水平和安全方面已获得长期的实践证实，但存在许多 不足之处：不能冻干；批次之间差异大；与许多重组或合成的多肽疫苗抗原共同免疫时未 能激发有效的免疫应答，使之很难满足新型疫苗发展的需要。通常而言，油/水乳剂型佐 剂以注射投递途径为主，包括M F59、QS21、A S02以及Montanide等水包油或油包水型佐 齐U，这类佐剂通过肌肉或皮下注射接种来增强疫苗抗原的免疫原性。此外，机体内源性细胞 因子如IL-2、IL-12、GM-CSF等，也可作新型疫苗佐剂，主要通过注射途径进行接种，所引发 的免疫应答类型与油/水乳剂型佐剂相似。但此类佐剂大都成本较高。目前，单纯的粘膜 途径型佐剂较少，主要以大肠杆菌LT毒素及其突变体为主，诱导以粘膜免疫为主的应答反 应，分泌特异性slgA，也可产生系统性免疫应答，但强度较注射途径弱。这类佐剂较粘膜途 径投递相对安全，即便佐剂存在一定毒性，但在有效剂量时进行粘膜投递仍较为安全，而且 还具有投递简便，无创伤等显著优点。具备注射和粘膜两种免疫途径的新型疫苗佐剂受到 青睐。在不同的免疫途径下，这类佐剂既可诱导出系统免疫应答，也可产生粘膜免疫效果， 既有体液免疫也有细胞免疫。由于菌蜕拥有完好的天然的细菌外壳结构，能同时激发体液 和细胞免疫应答。其菌毛、纤毛等表面黏附结构使之能靶向黏附在特异性的组织，如胃肠道 和呼吸道的黏膜表面，容易被机体吞噬细胞，如PP结（Peyer' s Patches)的M细胞识别捕 获，因而可有效递送疫苗抗原至黏膜表面和诱发相关黏膜免疫应答。
[0006] 目前，国内外研究者关注的焦点是菌蜕作为一种新型疫苗用于预防细菌感染。而 系统性的评价菌蜕的佐剂功能并将其作为佐剂应用于病毒性疫苗的免疫尚未见相关报道。 另外，本发明克服了以往菌蜕制备规模小的瓶颈问题，利用发酵罐大量地制备了沙门氏菌 菌蜕，实现了菌蜕的规模化生产。


【发明内容】

[0007] 本发明的目的之一是提供细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用。
[0008] 其中，所述的细菌菌蜕的佐剂功能主要体现在其能特异性提高病毒疫苗的免疫效 力、提高病毒疫苗的抗体持续期以及病毒疫苗的保护率。
[0009] 在本发明中，所述的菌蜕来自多种细菌，优选地来自沙门氏菌菌株。所述的细菌菌 蜕可经皮下、口、局部、粘膜、肺和/或鼻施用。
[0010] 本发明的目的之二是提供一种细菌菌蜕的规模化制备方法，包括以下步骤：
[0011] (1)构建含有打孔质粒PBV-E的细菌，其中所述的打孔质粒pBV-E是通过将 PhiX174噬菌体的裂解蛋白E基因克隆到pBV-220质粒中得到的；
[0012] (2)将含羧苄青霉素的LB琼脂板上的含有打孔质粒PBV-E的细菌单克隆转接到 含羧苄青霉素的LB液体培养基中，37°C 200rpm振荡培养10-14小时，作为一级种子液；按 5% (v/v)接种量，将一级种子液转接到含羧苄青霉素的LB液体培养基中，37°C 200rpm培 养6小时，作为二级种子液；向发酵罐中加入LB液体培养基进行原位灭菌；按5% (v/v)接 种量，取二级种子液转接到发酵罐中同时加入羧苄青霉素进行发酵；通过程序化控制诱导 前发酵条件：37°C、200rpm、10L空气/分钟，将细菌培养至0D600 = 0· 75?L 0 ;
[0013] (3)升温至42°C诱导E蛋白表达，在诱导2. 5小时的时间点，加入终浓度 150-200 μ g/ml的氯霉素；诱导全程时间为4小时；
[0014] (4)收集菌体，70_90°C处理，冻干。
[0015] 其中，优选的，PhiX174噬菌体的裂解蛋白E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 示。其中，优选的，各步骤中羧苄青霉素的浓度均为100 μ g/ml。
[0016] 其中，优选的，所述的细菌为沙门氏菌菌株，在本发明的一个具体实施例中，所述 的沙门氏菌菌株为沙门氏菌Sm6。
[0017] 将未加佐剂的新城疫灭活苗半成品与所述菌蜕混合，对SPF鸡进行免疫。将未加 佐剂的禽流感灭活疫苗半成品与所述菌蜕混合，对SPF鸡进行免疫。将未加佐剂的2型猪 圆环病毒疫苗半成品与所述菌蜕混合，对猪进行免疫。同时设不添加菌蜕的疫苗作为对照， 结果发现，相较于未添加菌蜕的疫苗，添加菌蜕作为佐剂的疫苗能特异性提高病毒疫苗的 免疫效力、提高病毒疫苗的抗体持续期，并最终提高病毒疫苗的保护率。
[0018] 本发明的有益效果主要体现在：
[0019] 1、本发明提供了细菌菌蜕的大规模制备方法，为菌蜕疫苗的商品化生产奠定了坚 实的基础；
[0020] 2、系统性的评价了菌蜕的佐剂功能，菌蜕能极大的提高病毒性疫苗的免疫效力， 而且菌蜕作为佐剂使用方法简单，可一定程度的降低疫苗的生产成本，对人类和动物病毒 性传染病的防控具有重大意义。

【专利附图】

【附图说明】
[0021] 图1为pBV_E/Sm6的裂解曲线图；
[0022] 图2为Sm6菌蜕扫描电镜图；
[0023] 图3为新城疫血凝抑制抗体效价检测结果；
[0024] 图4为新城疫HI抗体持续期检测结果；
[0025] 图5为禽流感HI抗体持续期检测结果。

【具体实施方式】
[0026] 下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例 仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[0027] 实施例1 :肠炎沙门氏菌菌蜕的规模化制备与鉴定
[0028] (1)含有打孔质粒pBV-E的肠炎沙门氏菌Sm6的构建
[0029] 根据GenBank中噬菌体PhiX174裂解基因 E设计引物：
[0030] Lysise-U(5,-AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3'）
[0031] Lysise-L (5,-AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3,）
[0032] 上、下游引物5'端分别引入了 EcoR I和BamH I限制性酶切位点，由 Invitrogen (上海）公司合成。以噬菌体PhiX174双链DNA为模板扩增裂解基因 E，其核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。PCR扩增反应体系为50 μ L，其中：灭菌的去离子水22 μ L， PrimeSTAR MAX Premix (2 X) 25 μ L ;10μ M 的上下游引物各1 μ L ;PhiX174双链DNAl μ L (含 12.5ng DNA)。扩增的循环参数为：1)94°C 20s，55°C 10s，72°C 20s，30 个循环；2)72°C 5min。PCR产物用0.9%的琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒回收E基因片段。采用 BamH I和EcoR I对E基因片段和pBV-220质粒分别进行双酶切，酶切反应体系如下：E基 因或pBV-220质粒15μ L ;BamH I 2μ L ;EcoR I 2μ L ;10XThermo Scientific FastDigest buffer 5 μ L ;灭菌去离子水26 μ L，总体积50 μ L，37°C水浴lh，胶回收E基因片段及线性 pBV-220 载体。
[0033] 沙门氏菌菌种Sm6系由本研究室自发病鸡群分离得到。以无菌接种环取冻存的于 普通LB平板划线，同时在含氨苄青霉素（Amp)的LB平板划线做对照，37°C温箱培养过夜。 次日挑取生长良好的单个菌落接种于5mL LB液体培养基中37°C振摇培养过夜。取ImL活 化后的培养液加到IOOmL LB液体培养基中，37°C振摇培养2. 5-3h使OD6tltlmi达到0. 4左右。 在无菌条件下将细菌培养物倒入灭菌后冰预冷的离心管中，冰浴l〇min，4°C 1600rpm离心 lOmin，尽弃上清。用IOmL冰预冷的0. IM CaCl2温和悬起细菌沉淀，冰浴放置30min。4°C IlOOrpm离心IOmin后尽弃上清。以4mL冰预冷的0. IM CaCl2溶液再次重悬沉淀，加入终 浓度为15%的灭菌甘油混匀后分装为200 μ 1/管,置于冰块中,加入预冷的连接产物10 μ L 于感受态细胞中。在冰块中冰浴30min，再置42°C热休克90s，热休克后立即冰浴2min，再 加入事先预热到37°C无抗生素的100 μ L LB培养液，37°C摇动培养lh，之后3500rpm离心 3min，弃去多余上清，剩余100 μ L，混勻菌体，取100 μ L均勻涂布于含50 μ g/mL氨节青霉素 的LB平板上，37°C培养12?16h。随机挑取菌落，接种于5mL含50 μ g/mL氨节青霉素的 LB培养基中过夜培养，采用碱裂解法小量提取质粒DNA，分别用PCR和双酶切进行鉴定，所 得阳性克隆，即为pBV-E/Sm6。
[0034] (2)菌蜕的发酵
[0035] 将LB琼脂板（含100 μ g/ml羧苄青霉素）上的含有打孔质粒pBV-E的肠炎沙门 氏菌Sm6单克隆转接到含IOml LB液体培养基（含100 μ g/ml羧苄青霉素）的IOOml三角 瓶中，37°C 200rpm振荡培养过夜（10-14小时），作为一级种子液。按5% (v/v)接种量，将 一级种子液转接到含150ml LB液体培养基（含100 μ g/ml羧苄青霉素）的500ml锥形瓶， 37°C 200rpm培养6小时，作为二级种子液。向15-L发酵罐（BIOSTAT C-15, Sartorius， Germany)中加入IOL pH7. 2的LB液体培养基进行原位灭菌。按5% (v/v)接种量，取二级 种子液转接到发酵罐中同时加入羧苄青霉素至终浓度1〇〇μ g/ml进行发酵。存档以下参 数：温度、流动、搅拌子、？11、？02。通过程序化控制诱导前发酵条件（371：、200印111、1(^空气 /分钟）将细菌培养至对数生长期（0D600 = 0. 75?1. 0)。升温至42°C诱导E蛋白表达， 在诱导2. 5小时的时间点，加入终浓度170 μ g/ml的氯霉素；诱导全程时间为4小时。诱导 前与诱导期间每隔〇. 5小时取IOml发酵样品，检测光密度值，直至光密度不再降低，将样品 涂布LB平板于37°C培养12小时，菌落计数法计算菌蜕浓度。4°C 80000Xg离心10分钟 收集菌体，用pH7. 0的PBS洗涤沉淀两次，将沉淀于70-90°C处理3分钟。按最后冻干所需 的菌蜕浓度，加入相应体积的PBS或冻干保护剂（明胶-蔗糖或脱脂乳），分装于5ml疫苗 瓶，每瓶Iml (含菌蜕5 X IOltlCfu)，使用VirTis GENESIS冻干机将样品冻干48小时。保存 于-20。。。
[0036] (3)裂解曲线绘制与裂解效率测定
[0037] 发酵诱导前与诱导期间每隔0. 5小时取IOml发酵样品，检测光密度值，直至光密 度不再降低，将样品涂布LB平板于37°C培养12小时，菌落计数法计算裂解效率。
[0038] 实验结果：菌落计数表明，含打孔质粒pBV-E的肠炎沙门氏菌Sm6在诱导后1小时 已经开始溶菌，4小时可充分裂解（图1)，裂解效率达到99. 999%
[0039] (4)菌蜕的扫描电镜观察与菌蜕的活菌检测
[0040] 取冻干前的菌蜕，3%戊二醛重悬，4°C固定过夜，乙醇逐级脱水，乙酸戊二酯置换， 干燥后喷金，扫描电镜观察。实验结果如图2,绝大多数细菌菌体呈现空泡状结构，形态完 整，并可见200nm左右的溶菌孔道。
[0041] 取冻干前与冻干后的菌蜕原液，涂布LB平板于37°C培养12小时，结果平板上无菌 落出现，表明所制备的菌蜕无活菌存在。
[0042] 实施例2菌蜕作为新城疫疫苗免疫佐剂的效果
[0043] 鸡新城疫油乳剂灭活苗与未加佐剂的新城疫灭活苗半成品为哈尔滨维科生物技 术开发公司生产。肠炎沙门氏菌菌脱按实施例1方法制备。
[0044] (1)皮下免疫途径检测菌蜕的佐剂效果
[0045] 1)分组处理
[0046] 7日龄SPF X鸟共60只，随机分为4组，每组15只，即试验I组（X鸟新城疫油乳齐IJ 灭活苗组，颈部皮下免疫，〇. 3ml/只）、试验II组（菌蜕疫苗佐剂组，新城疫灭活苗半成品 与菌蜕混合比例为1:2 (体积比），菌蜕为5 X IO9Cfu,颈部皮下免疫，0. 3ml/只）、试验III组 (LPS佐剂组，新城疫灭活苗与100 μ g/ml LPS 1:1混合，颈部皮下免疫，0. 3ml/只）和对照 组（PBS，颈部皮下免疫，0. 3ml/只）。首次免疫日记为第0天，共免疫2次，每次免疫间隔两 周。二免一周（第21天）后对试验鸡只进行滴鼻，点眼，攻新城疫强毒株，每只鸡的攻毒剂 量为IO 5EID5tl。攻毒后每日观察其临床症状，观察15天。计算疫苗的保护率。
[0047] 2)病毒血凝抑制抗体效价与持续期检测
[0048] 于一免二周（第14天）和二免一周（第21天）翅静脉采血，进行血凝（HA)与血 凝抑制（HI)试验。
[0049] HA试验：取96孔"V"形微量反应板，自左至右各孔加50 μ L PBS，于左侧第1孔加 50 μ L NDV鸡胚尿囊液，混匀后，吸50 μ L至第2孔，反复吹打数次后，依次稀释至第11孔， 吸弃去50 μ L，经倍比稀释，鸡胚尿囊液的稀释倍数为21-211，第12孔不加鸡胚尿囊液，作 为对照，然后自左至右向各孔加1 %鸡红细胞悬液50 μ L，振荡混匀，37°C静置25min，观察 结果，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的最高稀释倍数作为鸡胚尿囊液中NDV的 血凝价（HAU)，用log2表示。
[0050] HI试验：按HA试验测出的NDV血凝价除以4即为4单位HAU，按照稀释倍数配制4 单位NDV液。并进行血凝实验，验证4单位抗原，取96孔"V"形微量反应板，自左至右1-10 孔各加50 μ LPBS，11和12孔分别加4单位NDV液和血清对照；第1孔加入50 μ L待检血 清，反复吹吸混匀后，取50 μ L至第2孔混匀，依次稀释至第10孔，吸弃50 μ L，经倍比稀释， 血清的稀释倍数为2^21° ;自第1至第10孔各加50 μ L 4单位NDV液，第12孔加50 μ L血 清，震荡混匀，置37°C温箱作用20min ;自第1至第12孔各加1 %鸡红细胞50 μ L，震荡混 匀，37°C静置20min，以完全抑制凝集的血清最高稀释倍数作为HI滴度，用log2表示。
[0051] 血凝抑制结果表明：试验I组与试验II组均能增强特异的病毒血凝抑制抗体的效 价，且高于试验III组（图3)。
[0052] 二免一周后每周进行翅静脉采血，进行血凝抑制试验。结果表明：直到二免十二周 (第112天），两个实验组都可以保持较高的血凝抑制价效价（图4)。
[0053] 3)新城疫攻毒后各组的保护情况和排毒情况
[0054] 攻毒后，对照组的鸡出现眼观症状：头颈向后或一侧扭转，眼半开或全闭，冠渐变 暗红色，嗉囊内充满液体内容物，倒提时会出现大量酸臭液体流出；从第5天开始死亡，第 10天全部死亡，剖检可见喉头、气管、小肠浆膜粘膜出血，腺胃乳头肿胀、出血。试验III组于 第10天有两只鸡跛行，到15天没有死亡。试验I组、试验II组的鸡无眼观症状，对强毒的 攻击可以达到100 %保护。
[0055] 攻毒后每日观察SPF鸡的健康状况，并在攻毒后第3d、第5d、第7d采集SPF鸡的咽 部拭子和泄殖腔拭子，置于含50%甘油的PBS(含青霉素、链霉素）中，样品液4°C 2000Xg 离心10分钟，取上清以200 μ L/枚的接种剂量接种于9日龄SPF鸡胚，弃掉24小时内死亡 的鸡胚，72小时后收取鸡胚尿囊液，通过HA试验检测判定SPF鸡是否排毒。实验结果表明： 在攻毒后第3d，试验I组和试验III组的咽喉拭子和泄殖腔拭子均检测到排毒，而试验II组 在泄殖腔拭子中未检测到排毒。至第l〇d，试验I组、试验II组在咽喉和泄殖腔均检测不到 排毒，结果如下表1所示。
[0056] 表1新城疫攻毒后的病毒分离结果与病死率
[0057]

【权利要求】
1. 细菌菌蜕在制备病毒性疫苗佐剂中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的细菌菌蜕能特异性提高病毒疫苗的免 疫效力。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的细菌菌蜕能提高病毒疫苗的抗体持续 期。
4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的细菌菌蜕能提高病毒疫苗的保护率。
5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的细菌菌蜕来自多种细菌，优选地来自 沙门氏菌菌株。
6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的细菌菌蜕经皮下、口、局部、粘膜、肺和 /或鼻施用。
7. -种细菌菌蜕的大规模发酵方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 构建含有打孔质粒PBV-E的细菌，其中所述的打孔质粒pBV-E是通过将PhiX174噬 菌体的裂解蛋白E基因克隆到pBV-220质粒中得到的； (2) 将含羧苄青霉素的LB琼脂板上的含有打孔质粒pBV-E的细菌单克隆转接到含羧苄 青霉素的LB液体培养基中，37°C 200rpm振荡培养10-14小时，作为一级种子液；按5% (v/ v)接种量，将一级种子液转接到含羧苄青霉素的LB液体培养基中，37°C 200rpm培养6小 时，作为二级种子液；向发酵罐中加入LB液体培养基进行原位灭菌；按5% (v/v)接种量， 取二级种子液转接到发酵罐中同时加入羧苄青霉素进行发酵；通过程序化控制诱导前发酵 条件：37°C、200rpm、10L空气/分钟，将细菌培养至0D600 = 0? 75?1. 0 ; (3) 升温至42°C诱导E蛋白表达，在诱导2. 5小时的时间点，加入终浓度150-200 y g/ ml的氯霉素；诱导全程时间为4小时； (4) 收集菌体，70-90°C处理，冻干。
8. 如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于PhiX174噬菌体的裂解蛋白E基因的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
9. 如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于各步骤中羧苄青霉素的浓度均为 100 u g/ml〇
10. 如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于所述的细菌为沙门氏菌菌株。
【文档编号】C12N1/21GK104353072SQ201410531678
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月10日 优先权日:2014年10月10日
【发明者】刘思国, 于申业, 司微, 危艳武, 陈利苹 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所