一种改良的人脐血来源调节性t细胞扩增培养基及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及一种改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基及其使用方法。向RPMI1640培养基中添加占培养基体积10-12％的经肝素抗凝的自体脐带血血浆，CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠，重组人白细胞介素2、2-巯基乙醇、雷帕霉素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、庆大霉素。将分离的细胞悬液接种在U型底的96孔板中，一般每1-2天可以分孔扩增，扩增时间为3-4周。该培养体系中所有试剂均为GMP级别或脐血自体来源，避免动物源性成分带来的风险，可作为第三方无关供者直接用于临床疾病治疗；使用改良培养基扩增的Treg细胞在生长速度，纯度，活性和淋巴细胞抑制功能等方面较传统培养体系更优越，有望作为第三方无关供者调节性T细胞应用于临床疾病治疗。
【专利说明】一种改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及改良的人脐带血来源的⑶4+⑶25+调节性T细胞生产过程中扩增培养基和培养方法。
【背景技术】
[0002]调节性T细胞是一组具有抑制自身免疫反应、阻止损伤性免疫病理发生和维持机体免疫平衡作用的T细胞亚群，可用于预防和治疗免疫排斥、移植物抗宿主病(GVHD)以及自身免疫性疾病。⑶4+⑶25+T细胞是调节性T细胞家族中最主要的一群，由Sakaguchi等[SakaguchiS, SakaguchiN, AsanoM, et al.1mmunologicalself toler-ancemaintainedby activated T cells express1n IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdownof singlemechanismof sel-f toIerancecau-sesvar1us autoimmune disease[J].JImmunol, 1995，155 (3): 1151-1164.]在1995年首先发现，它是IL-2受体的A链，持续表达于抗原诱导的活化T细胞表面，约占正常人外周血⑶4+T细胞的5%?10%。⑶4+⑶25+T细胞通过抑制自身反应性T细胞的活化、增殖，抑制了 B细胞的活化和细胞因子的异常表达，从而维持了机体的免疫平衡，其数量和功能的异常可导致多种自身免疫病的发生。在临床应用中，使用Treg细胞将成为一种很有潜力的预防和治疗上述疾病的干预措施。
[0003]脐血内含有丰富的造血干/祖细胞，自上世纪90年代以来，脐血干细胞移植技术在全世界得到快速发展，世界各国脐血库应运而生，将原本自然流失的脐带血，经分离检测深低温保存，以备临床应用。研究发现脐血中同样也含有Treg细胞，在数量上明显多于成人外周血[GodfreyWR, Spoden DJ, GeYG, et al.Cord blood CD4+CD25+-derivedTregulatorycell linesexpressFoxP3 protein andmanifestpo-tent suppressor funct1n[J].Blood, 2005, 105(2):750-758.]。而且其来源广泛、无创伤性、免疫原性低，使得脐血来源的Treg细胞较成人外周血来源的Treg细胞在细胞治疗过程中具有更多的优势。但是一个脐血单位所分离出的Treg细胞数量远远达不到临床需求的。而且新生儿脐带血细胞是很少受到抗原刺激的初始T细胞，仅少量发育成熟，所以其表达Foxp3比例却远远低于成人外周血[WingK, LindgrenS, KollbergG, et al.CD4Tcellactivat1n bymy-elinoligodendrocyte glycoprotein is suppressed by adult but not cord bloodCD25+Tcells[J].Eur JImmunol，2003，33 (3):579-587.]。所以，如何将幼稚且易于分离的脐带血CD4+CD25+Treg细胞的功能诱导成熟无疑对治疗自身免疫病、变态反应性疾病及抑制同种异体移植排斥等临床应用具有重要意义。Treg仅占脐血(CB)有核细胞总数的5%(〈3X 16 细胞)[Lin SJ, Lu CH, Yan DC, et al.Expans1n of regulatory T cells fromumbilical cord blood and adult peripheral blood CD4+CD25+T cells[J].TmmunolRes.2014 Feb 11.Epub ahead of print]。为满足临床治疗的要求，就需要在短期内大量扩增出纯度高、活性好、功能强、产量稳定的人脐血源性T调节细胞细胞；而在Treg真正大规模用于临床治疗之前还有很多挑战需要克服，目前还没有一种最佳的能大量提供高纯度、有活性、功能强的人脐血源性Treg细胞培养方法，所以如何通过建立优化的能用于临床治疗的最佳Treg培养基成分以及培养方式成为T调节细胞应用最迫切的问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的旨在建立一种改良的能经过长期培养提供有纯度高、活性好、功能强、产量稳定的人脐血来源的调节性T细胞培养基及其使用方法。
[0005]一种改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基，向RPMI1640培养基中添加经肝素抗凝的自体脐带血血浆、⑶3/⑶28抗体共表达的免疫磁珠、重组人白细胞介素2、2_巯基乙醇和雷帕霉素。
[0006]具体是向RPMI1640培养基中添加占培养基体积10_12 %的经肝素抗凝的自体脐带血血浆。培养基中重组人白细胞介素2浓度为500-1000IU/mL、2-巯基乙醇浓度为50-100pmol/L、雷帕霉素浓度为 100_150nmol/L。
[0007]培养基中还含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸、庆大霉素。
[0008]培养基中4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为20-25mmol/L、庆大霉素浓度为10_20 μ g/
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[0009]所述的⑶3/⑶28抗体共表达的免疫磁珠初始添加数量与细胞比例为1:3-1:4，每隔1-2天继代培养一次，继代时CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠数量与细胞比例为1:2。
[0010]所述的改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基的使用方法，包括以下步骤:
[0011]I)用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞，通过⑶25+免疫磁珠阳性分离获得富含⑶4+⑶25+调节性T细胞；
[0012]2)用所述的改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基扩增培养获得的⑶4+⑶25+调节性T细胞。
[0013]上述方法具体是收集⑶4+⑶25+调节性T细胞，每5X 15个细胞用250 μ I含10-12%经肝素抗凝的自体脐带血血浆，800IU/mL重组人白细胞介素2，50 μ M 2-巯基乙醇，10nM雷帕霉素的RPMI1640培养基重悬，按与细胞数比例1:3_1:4加入⑶3/⑶28抗体共表达的免疫磁珠进行培养；3-4天形成细胞集落后，打散细胞用含10-12%经肝素抗凝的自体脐带血血浆，800IU/mL重组人白细胞介素2，50 μ M 2-巯基乙醇，10nM雷帕霉素的RPMI1640培养基，然后进行继代扩增，CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠与细胞的数目比例为1:2 ;以后每隔1-2天继代一次。
[0014]将所述的培养基配制的细胞悬液接种在U型底的96孔板中，置于37°C、5% CO2,95%空气培养箱内培养，细胞在种板后第3-4天，每孔吹打混匀细胞后开始分3-4孔，分孔后细胞数量至少为2 X 15个细胞/孔，用所述的培养基将细胞悬液体积补充至200-250微升/孔进行培养，之后再每1-2天分孔一次(分孔条件与前相同)，培养总时间为3-4周。
[0015]用冷冻保护剂重悬经300rpm，10 min离心的扩增后⑶4+⑶25+调节性T细胞，分装入冷冻管于液氮-196°C保存，所述的冷冻保护剂由10%二甲基亚砜，90%的自体脐带血血浆组成。
[0016]本发明所述的经肝素抗凝的自体脐带血血浆是获取⑶4+⑶25+调节性T细胞时得到的血浆。
[0017]重组人白细胞介素2缩写为rhIL-2 ;
[0018]2-巯基乙醇缩写为2-ME ；
[0019]雷帕霉素英文为Rapamycin ；
[0020]4-羟乙基哌嗪乙磺酸缩写为HEPES。
[0021]本发明优点在于:从脐带血中分离的调节性T细胞有限，在之前扩增体系基础上进行优化，尤其是首次采用经肝素抗凝的自体脐带血血浆作为培养基成分，然后在其他组分的协同作用下，在短时间内能够获得满足临床需求的高质高量的调节性T细胞制品，并在液氮中长期保存，作为第三方无关供者调节性T细胞应用于临床疾病治疗，如移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病等。
[0022]本发明选用的各种原料作用如下:
[0023]重组人白细胞介素2(rhIL_2):为多肽类免疫增强剂。是一种淋巴因子，能刺激T细胞增殖分化，诱导产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，增强自然杀伤(NK)细胞活性，激活产生淋巴因子的杀伤(LAK)细胞和肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)，刺激B细胞增殖分化和分泌抗体，诱导干扰素和多种细胞因子的分泌。
[0024]2-巯基乙醇(2-ME):是一种有机化合物，其化学式为H0CH2CH2SH，它兼具乙二醇(H0CH2CH20H)和乙二硫醇(HSCH2CH2SH)的官能团，为挥发性液体，具有较强烈的刺激性气味。通常用于二硫键的还原，可以作为抗氧化剂使用。
[0025]雷帕霉素(Rapamycin):是一种新型大环内酯类免疫抑制剂。雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由Gl期至S期的进程，从而发挥免疫抑制效应。
[0026]与以往技术相比的有益效果
[0027]I,培养体系中所有试剂均为GMP级别或脐血自体来源,避免动物源性成分带来的风险，可作为第三方无关供者直接用于临床疾病治疗；
[0028]2，使用改良体系扩增的Treg细胞在生长速度，纯度，活性和淋巴细胞抑制功能等方面较传统培养体系更优越。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为普通培养基和本发明改良培养基分别扩增后的人脐血来源调节性T细胞显微镜下图像，放大倍数100X ；
[0030]图2为对照组培养基和本发明改良培养基分别扩增后的人脐血来源调节性T细胞的扩增曲线；
[0031]图3为使用对照组和改良组培养基分别在体外扩增14天的人脐血来源调节性T细胞免疫表型分析；
[0032]图4为使用对照组和改良组培养基分别在体外扩增14天的人脐血来源调节性T细胞对T淋巴细胞的抑制效果；
[0033]图5为冻存及复苏后经Annexin V-PI染色、流式分析人脐血来源调节性T细胞凋亡活性。
【具体实施方式】
[0034]在以下实施例中，本院产科30例正常分娩足月胎儿的脐静脉血，结扎剪断脐带后立即进行脐静脉穿刺采血，肝素抗凝。该实验得到了中南大学湘雅三医院伦理委员会的批准。进行实验时，所采用的操作方法和操作步骤等，都是依据本【技术领域】的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。
[0035]为了更清楚地说明本发明，列举以下实施例，但其对本发明的范围无任何限制。
[0036]所述突光标记的鼠抗人抗体购自美国eB1sciense或BD公司；固定/破膜液及稀释液、固定/破膜缓冲液购自eB1sciense或BD公司；Ficol1-Plus淋巴细胞分离液购自GE生物公司FC500流式细胞仪为美国贝克曼-库尔特公司。分选⑶4+⑶25+调节性T细胞选用 MACS Milteny B1tec 公司的 CD25 Microbeads 11 (human)磁珠分离试剂盒，CD3/0)28抗体共表达的免疫磁珠(0)30)28 Microbeads)购自Invitrogen公司。细胞培养用的培养基和营养因子购自Life technology和Sigma等全球各大生物试剂公司。
[0037]实施例1.脐带血调节性T细胞细胞分离、纯化
[0038]本院产科收集30例正常分娩足月胎儿的脐静脉血，结扎剪断脐带后立即进行脐静脉穿刺米血，肝素抗凝，一般米血量为50-100ml。
[0039]收集至50ml离心管，2500rpm离心10分钟，取上层血浆层(作为本发明培养基成分的脐带血自体血浆)备用，并以3倍体积的PBS稀释下层血细胞层。血细胞重悬后，以1mll.077-1.080g/ml密度的淋巴分离液置于50ml离心管下层，40ml血细胞悬液轻柔加在上层，两层之间有明显界限，20°C，2000-2200rpm离心25分钟，吸取中间云雾层获得单个核细胞。PBS洗涤2次后计数细胞。
[0040]离心收集待分离细胞，每17个细胞用90 μ I的MACs Buffer缓冲液重悬，每17个细胞加入10μ I的CD25 Microbeads II，调整细胞密度至17个/100 μ 1，4°C孵育15分钟。
[0041]每17个细胞用2ml的MACs Buffer缓冲液终止染色，300 X g离心10分钟，，每18个细胞用500 μ I的MACs Buffer缓冲液重悬待用。
[0042]将LS分离柱安装入磁场中，加入Iml MACs Buffer缓冲液X 3次洗柱，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱。
[0043]加入细胞悬液过柱，在重力作用下自然流尽，收集流出分离柱的液体。
[0044]加入MACs Buffer缓冲液3ml X 3次洗柱，在重力作用下自然流尽，继续收集流出分离柱的液体，此液体中所含细胞为CD4+CD25+调节性T细胞。
[0045]将LS分离柱移出磁场，在分离柱下接无菌离心管，往分离柱中加入5ml MACsBuffer缓冲液，用活塞将附在分离柱上的细胞压入离心管中。重复该步骤一遍，计数细胞后300 Xg离心10分钟，得到的细胞为⑶4+⑶25+调节性T细胞。
[0046]实施例2.脐带血调节性T细胞条件性扩增
[0047]1，改良组:收集⑶4+⑶25+调节性T细胞每5 X 15个细胞用250μ I含10-12%自体血浆，800IU/ml IL-2，50uM 2-ME, 10nM Rapamycin 的 RPMI1640 条件培养基重悬，加入与细胞数比例 1:3-1:4 的 CD3CD28 Microbeads。
[0048]培养3-4天形成细胞集落后，打散细胞以用250μ I含10-12%自体血浆，800IU/mlIL-2，50uM 2-ME, 10nM Rapamycin.，与 CD3CD28 Microbeads 的 RPMI1640 条件培养基进行继代分孔扩增，⑶3⑶28 Microbeads与细胞的比例为1: 2，分孔初始时细胞数约为2 X 15个/孔。
[0049]之后再每隔1-2天分孔一次(分孔条件与前相同)，总的扩增时间为3-4周，计数体外扩增7、14、21、28天细胞扩增倍数。
[0050]2，对照组:收集⑶4+⑶25+调节性T细胞每5 X 15个细胞用250μ I含10% -12%FBS,800IU/ml IL-2, 50uM 2-ME, 10nM Rapamycin 的 RPMI1640 条件培养基重悬，加入与细胞数比例 1:3-1:4 的 CD3CD28 Microbeads。
[0051]培养3-4天后形成细胞集落后，打散细胞以用25(^1含10%?85，800几/1111 IL-2，与CD3CD28 Microbeads的RPMI1640条件培养基进行分孔继代扩增，CD3CD28 Microbeads与细胞的比例为1:2。分孔初始时细胞数约为2X 15个/孔.
[0052]之后再每隔3-4天分孔一次(分孔条件与之前相同)，扩增总时间为3-4周，计数体外扩增7、14、21、28天细胞扩增倍数。
[0053]实验结果:改良组脐带血调节性T细胞扩增的速度明显快于对照组，
[0054]实施例3.流式细胞术检测脐带血调节性T细胞细胞表型。
[0055]1.2.1收集使用对照组和改良组培养基在体外扩增14天的⑶4+⑶25+调节性T细胞，用PBS将细胞重悬至2 X 15个细胞/100 μ I。
[0056]1.2.2免疫荧光染色及细胞内因子染色:分别加入⑶4-FITC，⑶4-ΡΕ、CD45-PE-Cy5，CD19_PE_Cy5，CD25_PE_Cy5，HLA-DR-PE, CD62L-PE, GITR-PE, CD127-PE, CD45-RO-PE, CD45-RA-PE-Cy5，CTLA-PE各5-20 μ I至本发明培养的各孔中，充分混匀，4°C避光孵育30min,力口入冷PBS洗漆I次，1600 r/min,离心5min,弃上清，如需细胞内染色，加入新鲜配制的固定/破膜液0.5mL, 4°C避光60min，用固定/破膜缓冲液ImL洗涤I次后100 μ I重悬细胞，之后直接加入Foxp3-PE-Cy7和CTLA-PE各5 μ 1，4°C避光60min,用固定/破膜缓冲液2mL洗涤2次，弃上清，加入0.5mLPBS,充分混匀，4h内上流式细胞仪检测。
[0057]1.2.3 FCM检测采用FC500流式细胞仪进行检测，结果分析应用CellQuest软件。
[0058]实验结果:改良组⑶4+⑶25+双阳细胞比例明显高于对照组(94.79% vs 74% )；改良组⑶127+细胞比例明显低于对照组(2% vs 19.09% );改良组HLA-DR细胞比例明显低于对照组(72.48% vs 24.56% )改良组⑶62L+细胞比例明显低于对照组(31.24% vs27.61% );改良组GITR+细胞比例明显低于对照组(69.99% vs 74.18% );改良组Foxp3+细胞比例与对照组的差异无统计学意义。
[0059]实施例4.脐带血调节性T细胞的淋巴细胞混合实验。
[0060]正常第三者的CD25_Responsor 细胞悬液用 CellTrace?CFSE Cell Proliferat1nKit处理，培养液洗涤3次后用培养液配制细胞悬液作为反应细胞(2X 16个/ml，I X 15个/孔)，经亚致死剂量辐照的正常人的PBMC细胞悬液作为刺激细胞(4 X 16个/ml，4 X 15个/孔)，分别取本发明体外扩增的CD25+T调节细胞悬液与反应细胞以不同比例进行共培养(2 X 106/ml，Treg:Tresp = 1:64，1:32，1:16，1: 8，1: 4，1: 2，1:1)，加入 96 孔培养板，培养体系总体积250 μ I/孔；另设单独刺激细胞孔和单独反应细胞孔，均为三复孔。C02孵葙培养5天，收集细胞后采用FC500流式细胞仪进行检测，根据以下公式计算刺激指数(SI)。
[0061]实验结果:改良组培养的脐带血调节性Treg细胞对于T淋巴细胞的抑制效应明显高于对照组，特别是在Treg细胞数量较少的情况下(Treg=Tresp ^ 1/16)，差异具有统计学意义。
[0062]实施例5.调节性T细胞的冻存与复苏
[0063]冻存:用冷冻保护剂重悬经300g，10 min离心的扩增后调节性T细胞后，分装入2ml冻存管至自动程序降温盒于液氮_196°C保存，所述的冷冻保护剂由10%二甲基亚砜，90%的自体血浆组成。
[0064]复苏:准备37°C温水浴，将液氮-196°C保存的调节性T细胞迅速置于水浴中不停震荡，直至细胞融化成悬液。迅速将细胞加入15ml离心管中，用1640RPMI完全培基洗涤一遍后，Annexin V-PI双染后使用流式细胞术检测脐带血调节性T细胞细胞的凋亡活性。
[0065]实验结果:冻存及复苏后经Annexin V-PI染色、流式分析Treg细胞活率为96.1%，活性较高。
【权利要求】
1.一种改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基，其特征在于，向RPMI1640培养基中添加经肝素抗凝的自体脐带血血浆、⑶3/⑶28抗体共表达的免疫磁珠、重组人白细胞介素2、2_巯基乙醇和雷帕霉素。
2.根据权利要求1所述的改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基，其特征在于，向RPMI1640培养基中添加占培养基体积10-12%的经肝素抗凝的自体脐带血血浆。
3.根据权利要求1所述的改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基，其特征在于，培养基中重组人白细胞介素2浓度为500-1000IU/mL、2-巯基乙醇浓度为50-100pmol/L、雷帕霉素浓度为100-150nmol/L。
4.根据权利要求1所述的改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基，其特征在于，培养基中还含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸、庆大霉素。
5.根据权利要求4所述的改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基，其特征在于，培养基中4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为20-25mmol/L、庆大霉素浓度为10-20 μ g/mL。
6.根据权利要求1所述的改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基，其特征在于所述的CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠初始添加数量与细胞比例为1:3-1:4，每隔1_2天继代培养一次，继代时CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠数量与细胞比例为1:2。
7.权利要求1-6任一项所述的改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基的使用方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞，通过CD25+免疫磁珠阳性分离获得富含⑶4+⑶25+调节性T细胞； 2)用所述的改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基扩增培养获得的CD4+CD25+调节性T细胞。
8.根据权利要求7所述的改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基的使用方法，其特征在于，收集⑶4+⑶25+调节性T细胞，每5X105个细胞用250μ 1含10-12%经肝素抗凝的自体脐带血血浆，800IU/mL重组人白细胞介素2，50 μ Μ 2-巯基乙醇，ΙΟΟηΜ雷帕霉素的RPMI1640培养基重悬，按与细胞数比例1:3-1:4加入⑶3/⑶28抗体共表达的免疫磁珠进行培养；3_4天形成细胞集落后，打散细胞用含10-12%经肝素抗凝的自体脐带血血浆，800IU/mL重组人白细胞介素2，50 μ Μ 2-巯基乙醇，ΙΟΟηΜ雷帕霉素的RPMI1640培养基，然后进行继代扩增，CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠与细胞的数目比例为1:2;以后每隔1_2天继代一次。
9.根据权利要求8所述的改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基的使用方法，其特征在于，将所述的培养基配制的细胞悬液接种在U型底的96孔板中，置于37°C、5% C02、95%空气培养箱内培养，细胞在种板后第3-4天，每孔吹打混匀细胞后开始分3-4孔，分孔后细胞数量至少为2X 105个细胞/孔，用所述的培养基将细胞悬液体积补充至200-250微升/孔进行培养，之后再每1-2天分孔一次，培养总时间为3-4周。
10.根据权利要求7所述的改良的人脐血来源调节性T细胞扩增培养基的使用方法，其特征在于，用冷冻保护剂重悬经300rpm，lOmin离心的扩增后⑶4+⑶25+调节性T细胞，分装入冷冻管于液氮-196°C保存，所述的冷冻保护剂由10%二甲基亚砜，90%的自体脐带血血浆组成。
【文档编号】C12N5/0783GK104357389SQ201410541887
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】王维, 易受南, 马小倩, 张娟 申请人:湖南赛诺生物科技有限责任公司