一种制备bmp-2蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备BMP-2蛋白的方法。本发明提供的制备BMP-2蛋白的方法，包括如下步骤：将种子液接种至发酵培养基，然后按照如下参数进行发酵：37.0℃；溶氧>40％；pH7.0-7.3；起始溶氧>90％；200rpm；起始通气量3.0SLPM；采用补料培养基进行补料；待发酵体系的OD600nm值为9时加入IPTG并使其浓度为1.0mM，然后按如下参数进行诱导发酵4-6小时：37.0℃；溶氧>40％；pH7.20-7.40；BMP-2蛋白如序列表的序列1所示；所述重组菌的制备方法如下：将具有所述BMP-2蛋白的编码基因的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。本发明提供的方法具备产业化价值。
【专利说明】-种制备BMP-2蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备BMP-2蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP)是由骨基质分泌的一种疏 水性蛋白，属于转化生长因子（TGF-β)超家族成员，由Urist等人于1965年首次提出， 1972年定义，并于1982年首次从脱钙骨基质提取物中分离得到。BMP家族包括BMP-1、 BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12 和BMP-14 等，其中BMP-2 具有明显诱导未分化 的成纤维细胞定向分化为成骨细胞的作用并能调节成骨细胞和成软骨细胞的分化，诱导异 位骨形成和促进骨折愈合。BMP-2是骨生成的启动因子，可以加速骨的重建，是骨修复基因 治疗的理想目的基因，是目前唯一能诱导异位成骨的细胞因子，因而成为骨组织工程学研 究中最重要的生长因子。目前，BMP-2已成功地用于治疗骨不连和骨缺损的修复。
[0003]BMP-2的活性形式是二聚体，在成熟肽单链中有七个半胱氨酸残基，形成三个肽链 内二硫键，两条肽链间再通过一个二硫键连接后才具有活性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种制备BMP-2蛋白的方法。
[0005] 本发明提供的制备BMP-2蛋白的方法，包括如下步骤：
[0006] 将种子液按10%的体积比接种至装有发酵培养基的发酵罐，然后按照如下参数进 行第一阶段发酵：
[0007]培养温度：37.(TC;
[0008] 培养阶段溶氧：MO%;
[0009]培养pH:7. 0-7. 3;
[0010] 接种种子液后的起始溶氧：〉90%;
[0011] 接种种子液后的起始转速：200rpm;
[0012] 接种种子液后的起始通气量：3.OSLPM;
[0013] 待发酵体系的OD6tltol值为9时加入IPTG并使其浓度为I. OmM，然后按如下参数进 行第二阶段发酵，第二阶段发酵即诱导发酵：
[0014]诱导温度：37. (TC;
[0015] 诱导发酵阶段溶氧：>40%;
[0016]诱导发酵阶段pH:7. 20-7. 40;
[0017] 诱导发酵时间：4_6小时；
[0018] 包括第一阶段发酵和第二阶段发酵在内的发酵过程中，采用补料培养基进行补 料；
[0019] 所述BMP-2蛋白如序列表的序列1所示；
[0020] 所述种子液为(》6_"值=3. 0-5. 0的重组菌菌液；所述重组菌的制备方法如下：将 具有所述BMP-2蛋白的编码基因的重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组菌；
[0021] 所述发酵培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如 下：1. 0g/100mL胰蛋白胨、0· 5g/100mL酵母粉、0· 5g/100mLNaCl、0.lg/100mLMgS04、 0· 05g/100mLCaCl2、0. 5g/100mLNa2HPO4 和 0· 25g/100mLKH2PO4 ;
[0022] 所述补料培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下： 40g/L甘油、30g/L蛋白胨和15g/L酵母粉。
[0023] 所述BMP-2蛋白的编码基因具体可如序列表的序列2所示。
[0024] 所述重组质粒的制备方法具体如下：将序列表的序列2自5'末端第64-477位核 苷酸所示的双链DNA分子插入载体pET-28a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间，得到重组 质粒。
[0025] 所述方法中，"采用补料培养基进行补料"的方案如下：对于装有3L所述发酵培养 基的5L发酵罐来说，从发酵体系OD6tltlmi = 1. 5开始补料，初始补料速度为2ml/min，每半小 时增加0. 4ml/min，增加至6ml/min后再每半小时减少0. 4ml/min，直至补料速度为0。
[0026] 所述方法中，"采用补料培养基进行补料"的方案如下：对于装有30L所述发酵培 养基的50L发酵罐来说，从发酵体系OD6tltlmi = 1. 5开始补料，初始补料速度为12ml/min，每 半小时增加2. 4ml/min，增加至36ml/min后再每半小时减少2. 4ml/min，直至补料速度为0。
[0027] 所述种子液的制备方法具体如下：挑取所述重组菌的单克隆，接种至种子培养基 中，37°C、220rpm振荡培养至0D600nm值=3. 0-5. 0,即为种子液。
[0028] 所述种子培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下： 1.0g/100mLTyptone、0.5g/100mLYeast和 0.5g/100mLNaCl。
[0029] 所述种子液的OD6cicinm值=4· 0。
[0030] 所述诱导发酵的时间为5小时。
[0031] 所述方法还包括如下步骤：
[0032] (1)完成所述诱导发酵后，收集菌体，用ρΗ8· 0、IM的PBS缓冲液悬浮，加入MgCl2并 使其浓度为1Μ，加入菌体质量的0. 5%的溶菌酶，搅拌30min;然后在4°C下用高压均质机破 壁处理，然后在4°C冰浴条件下用超声波破碎仪超声破碎，然后4°C、12000rpm离心30min， 收集沉淀；
[0033] (2)用包涵体溶解液溶解步骤（1)得到的沉淀，然后在4°C下用高压均质机破壁处 理，然后在4°C冰浴条件下用超声波破碎仪超声破碎，然后4°C、12000rpm离心30min，收集 沉淀；
[0034] 所述包涵体溶解液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为pH8. 5、150mmol/L的Tris-HCl 缓冲液；所述溶质及其浓度如下：5mmol/LEDTA、体积比为2 %的TritonX-100和 2. 5MUera；
[0035] (3)用pH8. 0、IM的PBS缓冲液溶解步骤⑵得到的沉淀，然后在4°C下用高压均 质机破壁处理，然后在4°C冰浴条件下用超声波破碎仪超声破碎，然后4°C、12000rpm离心 30min，收集沉淀。
[0036] 所述步骤（1)中：用高压均质机破壁处理3_5(具体可为4次），每次的参数均 为：工作压力为760bar;用超声波破碎仪超声破碎3-5 (具体可为4次），每次的参数均为： 800W，超声5s，停5s，总时间30min;
[0037] 所述步骤（2)中：用高压均质机破壁处理3-5(具体可为4次），每次的参数均 为：工作压力为760bar;用超声波破碎仪超声破碎3-5 (具体可为4次），每次的参数均为： 800W，超声5s，停5s，总时间30min;
[0038] 所述步骤（3)中：用高压均质机破壁处理3-5(具体可为4次），每次的参数均 为：工作压力为760bar;用超声波破碎仪超声破碎3-5 (具体可为4次），每次的参数均为： 800W，超声5s，停5s，总时间30min。
[0039] 本发明的发明人首先通过摇瓶发酵，初步摸索通过发酵所述重组菌制备BMP-2蛋 白的方法中的各个参数，最佳参数如下：在培养体系的OD6tltlmi值为0. 9时加入IPTG进行诱 导，IPTG浓度为ImM时诱导效果最佳，采用37°C的诱导温度最佳。
[0040] 在摇瓶发酵的基础上，本发明的发明人建立了制备BMP-2蛋白的方法，可以应用 于工业生产，具有遗传背景清楚、使用安全、操作简单、产量高、生产周期短和成本低的优 点，经过连续三批中试规模（5L体积）和三批50L发酵罐的生产，证实本发明提供的方法具 备产业化价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图1为实施例3的步骤一的结果。
[0042] 图2为实施例3的步骤二的结果。
[0043] 图3为实施例3的步骤三的结果。
[0044] 图4为实施例4的结果（方案一）。
[0045] 图5为实施例4的结果（方案二）。
[0046] 图6为实施例4的结果（方案三）。
[0047] 图7为实施例6的结果。
【具体实施方式】
[0048] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0049] 实施例1、重组菌的构建
[0050] 1、将序列表的序列2自5'末端第64-477位核苷酸所不的双链DNA分子插入载体 pET-28a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒。重组质粒中，插入的双链DNA 分子与质粒本身的部分DNA融合，形成序列表的序列2所示的融合基因，表达序列表的序列 1所示的融合蛋白。
[0051]2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组菌。
[0052] 实施例2、种子培养参数的优化（种子培养基的优化）
[0053] 挑取实施例1得到的重组菌的单克隆，接种至种子培养基（分别采用1#培养基、 2#培养基或3#培养基作为种子培养基）中，37°C、220rpm振荡培养，每2小时无菌取样检 测OD6tltlmi 值。
[0054] 1# 培养基：溶剂为水，含I. 0g/100mLTyptone、0. 5g/100mLYeast和 0· 5g/100mL NaCl。
[0055] 2# 培养基：溶剂为水，含I. 0g/100mLTyptone、0. 5g/100mLYeast和I. 0g/100mL NaCl。
[0056] 3# 培养基：溶剂为水，含I.Og/lOOmLTyptoneU.Og/lOOmLYeast、0. 5g/100mL NaCl、0·lg/lOOmLMgSO4 和 0· 05g/100mLCaCl2。
[0057] 米用各个种子培养基进行培养2h、4h或6h后的OD6tltlmi值见表1。
[0058] 表1米用各个种子培养基进行培养2h、4h或6h后的OD6tltlmi值
[0059]
【权利要求】
1. 一种制备BMP-2蛋白的方法，包括如下步骤： 将种子液按10 %的体积比接种至装有发酵培养基的发酵罐，然后按照如下参数进行第 一阶段发酵： 培养温度：37. 0°C ; 培养阶段溶氧：>40% ; 培养 pH :7. 0-7. 3 ; 接种种子液后的起始溶氧：〉90*% ; 接种种子液后的起始转速：200rpm ; 接种种子液后的起始通气量：3. 0SLPM ; 待发酵体系的〇D6(l(lmi值为9时加入IPTG并使其浓度为1. OmM，然后按如下参数进行第 二阶段发酵，第二阶段发酵即诱导发酵： 诱导温度：37. 0°C ; 诱导发酵阶段溶氧：>40 % ; 诱导发酵阶段pH :7. 20-7. 40 ; 诱导发酵时间：4-6小时； 包括第一阶段发酵和第二阶段发酵在内的发酵过程中，采用补料培养基进行补料； 所述BMP-2蛋白如序列表的序列1所不； 所述种子液为(?^^值二3. 0-5. 0的重组菌菌液；所述重组菌的制备方法如下：将具有 所述BMP-2蛋白的编码基因的重组质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组菌； 所述发酵培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下： l.Og/lOOmL 胰蛋白胨、0.5g/100mL 酵母粉、0.5g/100mL NaCl、0.1g/100mL MgS04、 0? 05g/100mL CaCl2、0. 5g/100mL Na2HP04 和 0? 25g/100mL KH2P04 ; 所述补料培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下：40g/L甘 油、30g/L蛋白胨和15g/L酵母粉。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述BMP-2蛋白的编码基因如序列表的序 列2所示。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组质粒的制备方法如下：将序列表的 序列2自5'末端第64-477位核苷酸所示的双链DNA分子插入载体pET-28a(+)的Nde I 和Xho I酶切位点之间，得到重组质粒。
4. 如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，"采用补料培养基 进行补料"的方案如下：对于装有3L所述发酵培养基的5L发酵罐来说，从发酵体系0D6(l(lnm=1. 5开始补料，初始补料速度为2ml/min，每半小时增加0. 4ml/min，增加至6ml/min后再 每半小时减少〇. 4ml/min，直至补料速度为0。
5. 如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，"采用补料培养基进 行补料"的方案如下：对于装有30L所述发酵培养基的50L发酵罐来说，从发酵体系0D6(l(lnm=1. 5开始补料，初始补料速度为12ml/min，每半小时增加2. 4ml/min，增加至36ml/min后 再每半小时减少2. 4ml/min，直至补料速度为0。
6. 如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述种子液的0D6(l(lmi值=4. 0。
7. 如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述诱导发酵的时间为5小时。
8. 如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤： (1) 完成所述诱导发酵后，收集菌体，用PH8. 0、1M的PBS缓冲液悬浮，加入MgCl2并使 其浓度为1M，加入菌体质量的0. 5%的溶菌酶，搅拌30min ;然后在4°C下用高压均质机破壁 处理，然后在4°C冰浴条件下用超声波破碎仪超声破碎，然后4°C、12000rpm离心30min，收 集沉淀； (2) 用包涵体溶解液溶解步骤（1)得到的沉淀，然后在4°C下用高压均质机破壁处理， 然后在4°C冰浴条件下用超声波破碎仪超声破碎，然后4°C、12000rpm离心30min，收集沉 淀； 所述包涵体溶解液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为pH8. 5、150mmol/L的Tris-HCl缓冲 液；所述溶质及其浓度如下：5mmol/L EDTA、体积比为2%的Triton X-100和2. 5MUera ; (3) 用pH8. 0、1M的PBS缓冲液溶解步骤（2)得到的沉淀，然后在4°C下用高压均质机破 壁处理，然后在4°C冰浴条件下用超声波破碎仪超声破碎，然后4°C、12000rpm离心30min， 收集沉淀。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于： 所述步骤（1)中：用高压均质机破壁处理3-5(具体可为4次），每次的参数均为：工作 压力为760bar ;用超声波破碎仪超声破碎3-5(具体可为4次），每次的参数均为：800W，超 声5s，停5s，总时间30min ; 所述步骤（2)中：用高压均质机破壁处理3-5(具体可为4次），每次的参数均为：工作 压力为760bar ;用超声波破碎仪超声破碎3-5(具体可为4次），每次的参数均为：800W，超 声5s，停5s，总时间30min ; 所述步骤（3)中：用高压均质机破壁处理3-5(具体可为4次），每次的参数均为：工作 压力为760bar ;用超声波破碎仪超声破碎3-5(具体可为4次），每次的参数均为：800W，超 声5s，停5s，总时间30min。
【文档编号】C12N15/70GK104357519SQ201410541699
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】张东刚, 杨建军, 彭继学 申请人:烟台正海生物技术有限公司