一种高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方法，属于微生物发酵领域。利用本发明发酵培养基及方法发酵大肠杆菌重组菌产脯氨酸氨肽酶，菌体密度(OD600)及重组蛋白表达量分别为142和211U/mg。
【专利说明】一种高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方法，属于微生物发 酵领域。
【背景技术】
[0002] 高密度培养（HCDC)即高密度发酵，一般指微生物在液体培养基细胞群体密度超 过常规培养的10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术主要是在用基因 工程菌，尤其是E. coli工程菌的高密度培养。与传统的培养相比，高密度培养具有诸多优 势，主要体现在：（1)较高的生物量；（2)反应体系所需空间减小，投资成本降低；（3)生产 周期变短与成本降低；(4)更加有利于目标产物的分离纯化。尽管高密度培养与传统培养 相比具有上述诸多优势，但是随着菌体培养密度的增加也会带来一些问题，如：（1)菌体培 养密度的上升使得发酵液黏度增加，培养物中溶氧不足；(2)呼吸作用的增强导致CO 2及热 量的积聚；（3)代谢产物对细胞生长的限制性问题；(4)底物浓度对细胞生长可能存在的限 制或抑制问题；（5)生产过程中产物的不稳定性问题；(6)培养过程中一些副产物如乙酸的 积累等；
[0003] 在进行高密度培养的实践过程中，为了避免上述问题的影响，通常会采用适当的 流加补料策略来进行控制。补料策略可根据补料方式的不同分为两类：反馈式补料和非反 馈式补料。
[0004] 反馈补料策略能够在线及时的反应发酵体系中各参数的变化情况，但是微生物生 长过程中极其复杂的细胞与外界环境及细胞之间的交互作用，培养过程中参数的随时变 化，这就对在线检测设备提出了具有高精度、高灵敏度、高可靠性的要求，这无疑限制了反 馈补料策略在大规模工业化生产中的应用。相对于反馈补料策略而言，非反馈补料策略中 绝大都数的过程参数都是离线测定的，这就避免在线检测对的设备的要求，并且下一阶段 的补料可根据上一阶段的测定结果来调节，这就不仅强化了补料的灵活性，而且还有利于 收获更高的目标产物。在非反馈补料策略中，最常用的就是指数流加，通过指数流加可以控 制细胞的比生长速率，从而达到有效控制发酵体系中有害产物乙酸的累积。
[0005] 本发明提供了一种高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的培养基及其应用 方法，提高了菌体密度、蛋白表大量。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种重组大肠杆菌高密度发酵产脯氨酸 氨肽酶的培养基，利用该培养基能有效地获得较高密度菌体量。
[0007] 所述发酵培养基，按g · Γ1计，含有葡萄糖5-7. 5 ;鱼粉蛋白胨17. 5-22. 5 ;酵 母浸膏 27. 5-32. 5 ;Κ2ΗΡ0412· 04-13. 04 ;KH2P04L 81-2. 81 ;灭菌后添加 Mg2+ 至终浓度 5. 〇-7. 5mmol · L \ ρΗ7· 0-7. 4。
[0008] 所述发酵培养基中的葡萄糖需要单独灭菌后与其他成分混合。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基按g · I71计，含有葡萄糖5-6,鱼粉 蛋白胨 18-20,酵母浸膏 28-30, K2HP0412 . 04-12 . 54, KH2P042-2. 31，灭菌后添加 Mg2+ 至终浓 度 5. 0-7. 5mmol · L S ρΗ7· 0-7. 2。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有（g · Γ1):葡萄糖，5 ;鱼粉蛋白 胨，20 ;酵母浸膏，30 ;Κ2ΗΡ04,12 . 54 ;ΚΗ2Ρ04, 2. 31 ;灭菌后添加 Mg2+ 至终浓度 7. 5mmol · L' ρΗ7· 2。 toon] 所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌为宿主，表达了来源于米曲霉的脯氨酸氨肽酶。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌为宿主，以 pET-28a(+)为载体，编码脯氨酸氨肽酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述发酵培养基高密度培养重 组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方法。
[0014] 所述的高密度发酵方法，是将对数期种子以1 %?5 %的接种量，转接到装液量 57-71 %的发酵罐中，通气量和溶氧分别维持在3?5vvm和30%左右（28-32% )，罐压为常 压，搅拌转速为500-1200rpm，发酵温度为36?37°C;当葡萄糖耗尽、溶氧开始迅速回升，进 行补料培养，补料时控制菌体的比生长速率为〇. 15-0. 21Γ1，补料过程中偶联溶氧与转速，控 制溶氧在30%左右；当接种培养18-22h，添加2. 75?3. 25g/L的乳糖进行诱导产酶，酶活 力下降时放罐。
[0015] 所述的高密度发酵方法在补料后用25%的氨水控制pH在7.0左右（pH在 6. 8-7. 2)。
[0016] 所述补料培养采用的补料培养基含有400-500g · Γ1葡萄糖、2. 5-3g · T1MgSCV
[0017] 在本发明的一种实施方式中，将对数期种子以2%的接种量，转接到装液量60% 的培养基中，通气量和溶氧分别维持在3vvm和30 %左右，罐压为常压，搅拌转速为500rpm， 发酵温度为37°C ;当葡萄糖耗尽、溶氧开始迅速回升，进行补料培养，补料时控制菌体的比 生长速率为〇. 21Γ1，补料过程中偶联溶氧与转速，控制溶氧在30%左右；当接种培养至20h 左右，添加3g/L的乳糖进行诱导产酶，酶活力下降时放罐。
[0018] 本发明提供了一种高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的培养基及其应用 方法，提高了菌体密度、蛋白表大量。菌体密度（〇D_)及重组蛋白表达量分别为142和 211U/mg。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1发酵培养基初始pH对菌体生长及重组蛋白表达的影响
[0020] 图2接种量对菌体生长及重组蛋白表达的影响
[0021] 图3装液量对重组蛋白表达的影响
[0022] 图4诱导时机对菌体生长及重组蛋白表达的影响
[0023] 图5乳糖添加量对菌体生长及重组蛋白表达的影响
[0024] 图6诱导时间对菌体生长及重组蛋白表达的影响
[0025] 图7分批发酵过程曲线
[0026] 图8补料-分批发酵过程曲线
【具体实施方式】
[0027] 发酵初始培养基（g · Γ1):鱼粉蛋白胨，12 ;酵母浸膏，24 ;K2HP04,12 . 54 ;KH2P04， 2· 31。ρΗ7· 0。
[0028] 高密度发酵培养基（g·!/1):葡萄糖（115°C单独灭菌），5 ;鱼粉蛋白胨，20 ;酵母浸 膏，30 ;Κ2ΗΡ04,12 . 54 ;ΚΗ2Ρ04,2· 31。灭菌后添加 Mg2+(MgSO4)至终浓度 7. 5mmol .L' ρΗ7· 2。
[0029] 乳糖母液（g · L-1) :200。
[0030] Mg2+ 母液：1. Omol · L、
[0031] 补料培养基：500g · Γ1 葡萄糖，3g · T1MgSO4。
[0032] 大肠杆菌重组菌BL21/pap的构建，是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET_28a(+)为 载体，编码脯氨酸氨肽酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。该重组菌能够高效地可溶性 表达脯氨酸氨肽酶。
[0033] 乙酸含量测定：采用高效液相色谱法测定。
[0034] 还原糖含量测定：3, 5-二硝基水杨酸比色法。
[0035] 脯氨酸氨肽酶活性测定方法：以L-脯氨酸-对硝基苯胺为底物，在50mmol/ LpH7. 5的Tris-HCl缓冲液中加入稀释一定倍数的酶液和底物2. 5mm〇l/L，50°C水浴反应 IOmin,在405nm下测定吸光度。酶活定义：在50°C下，Imin分解L-脯氨酸-对硝基苯胺产 生1 μ M对硝基苯胺所需的酶量为一个酶活单位（IU)。
[0036] 实施例1发酵培养基及发酵条件优化 [0037] (1)发酵培养基优化
[0038] 通过单因素试验确定葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、Mg2+的最佳添加量，并以比酶活为响 应值，以葡萄糖、酵母膏、蛋白胨和Mg 2+作为因数，选用4因数3水平L9(34)正交表进行试 验，确定最佳的产酶培养基为5g/L葡萄糖（115°C单独灭菌）、20g/L胰蛋白胨、30g/L酵母 浸膏、12. 54g/LK2HP04、2. 31g/LKH2P04,灭菌后添加 Mg2+ 至终浓度 L 5mmol · ΙΛ ρΗ7· 2。
[0039] (2)发酵条件优化
[0040] 分别对诱导剂添加量、诱导时机、诱导时间、发酵液初始pH、接种量和装液量进行 优化。结果表明（图1-6):重组菌最佳产酶条件为初始pH7. 2,对数期种子2%，装液量 50mL/250mL，最佳诱导时机为接种后9h，诱导时乳糖终浓度3g ?Ι/1，诱导时间为12h。另外， 在整个发酵过程中，控制培养温度在37°C。
[0041] 实施例2重组菌在7L发酵罐上高密度发酵
[0042] (1)分批发酵
[0043] 在7L镇江东方GBJT-7C型发酵罐中加入4L高密度发酵培养基。灭菌后，加入抗生 素和终浓度为〇. 75mmol吨4的Mg2+。以2%的接种量接入80mL对数期的种子培养物，37°C 培养，维持转速在500rpm和3vvm的通气量。当检测到发酵液中葡萄糖耗尽时，开始加入终 浓度为3g · Γ1的乳糖进行诱导。如图7所示，接种后8h，葡萄糖消耗殆尽，此时添加乳糖 进行诱导，诱导12h后蛋白的表达量达到最高值91. 89U/mg，菌体密度（OD6J达到15.60。
[0044] (2)补料-分批发酵
[0045] 在发酵罐中以分批发酵的方式进行发酵培养时，随着培养时间的推迟，发酵体系 中营养物质开始匮乏。在分批发酵基础上，当发酵液中葡萄糖耗尽，溶氧开始快速升高时， 向发酵液中流加补料培养基。补料培养基的流加策略：指数流加补料，控制比生长速率为 0.21^1,偶联转速与溶氧，维持溶氧为30%。用25%的氨水控制pH在7. O左右。通过指数 补料策略的运用，生物量得到了大幅度的提高，〇D_达到了 142 (DCW = 44. 96g · Γ1)，是分 批发酵的9. 1倍，实现大肠杆菌的高密度培养，比酶活达到211U/mg，是分批发酵的2. 3倍。 [0046] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一种重组大肠杆菌高密度发酵产脯氨酸氨肽酶的培养基，其特征在于，按g ? r1 计，含有葡萄糖5-7. 5,鱼粉蛋白胨17. 5-22. 5,酵母浸膏27. 5-32. 5, K2HP0412 . 04-13 . 04， KH2PO4L 81-2. 81，Mg2+5. 0-7. 5mmol ?厂\ pH7. 0-7. 4。
2. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基按g ? I71计，含有葡萄糖 5-6,鱼粉蛋白胨 18-20,酵母浸膏 28-30，K2HP0412 . 04-12 . 54，KH2P042-2. 31，灭菌后添加 Mg2+ 至终浓度 5. 0-7. 5mmol ? L-1，pH7. 0-7. 2。
3. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基按g ? I71计，含有葡萄 糖5,鱼粉蛋白胨20,酵母浸膏30, K2HP0412 . 54, KH2P042. 31，灭菌后添加Mg2+至终浓度 7. 5mmol ? L \ pH7. 2〇
4. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述Mg2+是MgSO4的Mg2+。
5. -种应用权利要求1所述培养基高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方 法，是将对数期种子以1 %?5 %的接种量，转接到装液量57-71 %的发酵罐中，通气量和 溶氧分别维持在3?5vvm和28-32%，罐压为常压，搅拌转速为500-1200rpm，发酵温度 为36?37°C ;当葡萄糖耗尽、溶氧开始回升，进行补料培养，补料时控制菌体的比生长速 率为0. 15-0. 2h'补料过程中偶联溶氧与转速，控制溶氧在28-32 %左右；当接种培养至 18-22h，添加2. 75?3. 25g/L的乳糖进行诱导产酶，酶活力下降时放罐。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌为宿主， 以pET-28a(+)为载体，表达了核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的编码脯氨酸氨肽酶的基 因。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将对数期种子以2 %的接种量，转接到 装液量60 %的发酵罐中，通气量和溶氧分别维持在3vvm和30 %，罐压为常压，搅拌转速为 500rpm，发酵温度为37°C ;当葡萄糖耗尽、溶氧开始回升，进行补料培养，补料时控制菌体的 比生长速率为0. 21T1，补料过程中偶联溶氧与转速，控制溶氧在30 %;当接种培养至20h，添 加3g/L的乳糖进行诱导产酶，酶活力下降时放罐。
8. 根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述补料培养采用的补料培养基 含有 400-500g ? I71 葡萄糖、2. 5-3g ? I^1MgSCV
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述补料培养采用的补料培养基含有 500g ? L-1 葡萄糖、3g ? I^1MgStV
【文档编号】C12N9/48GK104313002SQ201410541799
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】田亚平, 丁国伟 申请人:江南大学