能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶(short-chain dehydrogenase)FribC及应用，所述酶的编码基因为序列1所述的基因序列，或序列2所述的氨基酸序列。所述酶的底物为D-核糖或修饰D-核糖包括5-氟-5-脱氧-D-核糖、4-二氟甲基-5-脱氧-D-核糖和4-三氟甲基-5-脱氧-D-核糖。本发明涉及FribC可以制备成生物催化剂，应用于多种核糖的生物转化；FribC还可以制备用于正电子发射断层扫描(positron emission tomography，PET)的放射性示踪剂。
【专利说明】能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶工程【技术领域】，尤其是一种能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱 氢酶及应用。
【背景技术】
[0002] 核糖在生命过程中有着广泛的作用，此外核糖还是重要的工业原料。将环状 核糖进行脱氢反应变成内酯，内酯可以随之被水解生成链状羧酸结构，有助于其后续 的应用和转化，在制备工业原料和医药中间体中有重大意义。能作用非磷酸化核糖 (non-phosphorylative ribose)的脱氢酶非常罕见，被研究的非常少。之前只有美国 Scripps研究所Bradley Moore教授的研究小组发现的一个在Salinispora tropica的活 性天然产物SalinosporamideA的合成通路中的SalM基因编码的短链脱氢酶。但此酶虽然 对d-核糖有活性，但其主要作用于5-氯-5-脱氧d-核糖（5-chlor〇-5_deoxy-D-Ribose， 5-CIR)，对d-核糖的活性很弱。这点可由其酶动力学实验数据证明，FribC酶对d-核糖底 物的米氏常数K m为19±3mM ;而对5-CIR的Km为0. 02±0. OlmM ;而SalM酶对两种底物的 酶促反应的最大速度（Vmax)几乎相同，造成SalM酶对5-CIR的催化活性比对D-核糖高将 近700倍，不利于D-核糖的生物转化。而对天然D-核糖和修饰核糖的催化保持同样高效 催化效率的短链脱氢酶之前从未有报道。
[0003] 正电子发射断层扫描（positron emission tomography, PET)是近年来发展成熟 的一项医学成像技术，它能够提供三维的和功能运动的图像，是核医学领域最先进的临床 检查影像技术。该技术通过扫描检测被注射入或被吸入的放射物可以产生人体局部或全身 器官图像。
[0004] PET技术是目前唯一的用解剖形态方式进行功能、代谢和受体显像的技术，具有无 创伤性、高灵敏度等特点，是目前临床上用以诊断和指导治疗肿瘤、早期诊断肿瘤和神经退 行性疾病的最佳手段之一。PET扫描需要预先制备放射性示踪剂，长久以来临床做常用的 放射示踪物为氟化葡萄糖（fluoro-D-glucose，FDG)。其应具有以下不足：1)氟化葡萄糖 用化学合成方法制备，成本较高，对环境有污染，需要严格的设备操作和熟悉操作的人员； 2)FDG作为葡萄糖的类似物，能被身体的众多组织部位代谢吸收，造成肿瘤等检测的特异性 不能令人满意。最近的研究趋势一是标记抗体、多肽类、亲和体分子等生物大分子，通过特 异性的结合增强靶向性；而是应用酶反应的方法标记 18F,降低成本，也可以在溶液中制备， 避免了复杂的化学合成。为完成上述目的，需要发明研究一些小分子化合物作为联接物 (linker)，一方面，这些小分子可以应用酶法被 18F标记，一方面，这些小分子其含有特定官 能团能和相关的抗体、多肽类、亲和体分子进行生物耦合。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶及应用，本 发明提供的短链脱氢酶FribC依赖烟氧化型酰胺腺噪呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucle〇tide，NAD+)作为辅因子的酶，能够使D-核糖在内的多种修饰核糖如5-氟-5-脱 氧-D-核糖（5-fluoro_deoxy-D-ribose，5-FDR)脱氢，将其转化生成链状结构的羧酸。
[0006] 本发明实现目的的技术方案如下：
[0007] -种能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶，其特征在于：所述酶的编码基 因为序列1所述的基因序列，或序列2所述的氨基酸序列。
[0008] 而且，所述酶的底物为D-核糖或修饰D-核糖。
[0009] 所述修饰D-核糖为5-氟-5-脱氧-D-核糖、4-二氟甲基-5-脱氧-D-核糖或 4_三氟甲基-5-脱氧-D-核糖。
[0010] 而且，所述酶的最适温度为37°C，最适pH值为7. 8。
[0011] 能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶在核糖的生物转化催化剂的应用。
[0012] 能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶在制备正电子发射断层扫描的放射 性示踪剂中的应用。
[0013] 本发明取得的优点和有益效果是：
[0014] 1、本发明涉及的是应用基因开矿（genome mining)的方法找到一种能够水解核糖 和多种氟代核糖的短链脱氢酶FribC，再通过基因序列优化，基因体外合成，基因克隆方式 得到质粒，将质粒转化进入大肠杆菌原核表达系统高效异源表达，经过制备得到纯化的酶。 应用核磁共振，紫外-可见光谱，质谱等手段，对其进行了鉴定和酶学研究。并将FribC制 备成生物催化剂（biocatalyst)，应用在多种核糖的生物转化（biotransformation)以及 制备用于正电子发射断层扫描的放射性示踪剂中。
[0015] 2、本发明通过紫外-分光光谱测定了其酶学动力学参数，证明了 FribC酶能够水 解核糖，在核糖的生物转化中发挥作用，就其催化活性和催化选择性（selectivity)而言， FribC对D-核糖和5-氟-5-脱氧核糖（5-FDR)没有显著差别。实验还证实，FribC对不同 核糖的端头（anomer)异构体酶有选择性。此外若使用氟代核糖为底物，则酶反应产物可以 作为生物共轭（bioonjugation)的辅基（prosthetic group)和其他下游物质（如多肽，抗 体，亲和体分子affibody等）进行生物共轭交联（bio-conjugation)，以此引入同位素标记 18F。此18F标记物可以作为放射示踪物（radiotracer)用于正电子发射断层扫描（positron emission tomography, PET)〇
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为本发明FribC短链脱氢酶科可以催化的酶反应，FribC可以催化底物A为 D-核糖，B为5-氟-5-脱氧-D-核糖，C为4-三氟甲基-5-脱氧-D-核糖的脱氢反应，形 成内酯（在中括号中的成分），内酯随后被FribC水解生成羧酸产物。
[0017] 图2为本发明ESI-FT-MS检测FribC酶反应产物，其中的质谱图（图2A)，（图2B)， (图2C)对应图1中所列的酶反应A，B，C。箭头所指为相应的酶反应产物的质谱信号，酶反 应产物的结构及其分子量被附在质谱图上。
[0018] 图3为本发明FribC短链脱氢酶的纯化（左图）和质谱-质谱（MS-MS)鉴定（右 图）。FribC能够被很好的纯化，MS-MS鉴定结果证明其蛋白质以及序列的正确性。
[0019] 图4为本发明FribC酶以D-核糖和5-氟-5-脱氧-D-核糖（5-FDR)作为底物得 到的米曼氏酶动力学拟合曲线。
[0020] 图5为本发明核磁共振（NMR)图谱揭不FribC酶对5-氟-5-脱氧-D-核糖的两种 端头异构体（anomer)的选择性。如图可见，5-氟-5-脱氧核糖在酶反应开始之前（图A) 的端头异构体保持大约5:2(β -anomer: a -anomer = 5:2)，反应进行一段时间后（图B)， 产物逐渐积累，反应底物逐渐消耗，但是端头异构体比例保持不变，说明FribC酶对核糖的 两种端头异构体无选择性。
【具体实施方式】
[0021] 下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0022] 本发明提供一种能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶FribC酶，同时提供 该酶在糖的生物转化和放射性物质标记中的应用，具体制备过程如下：
[0023] ⑴应用基因开矿（genome mining)的方法从一种新分离出的陆地链霉菌中获得开 放阅读框（open reading frame，0RF)，并将其翻译后得到蛋白质序列。
[0024] ⑵将DNA编码序列进行设计与优化后，通过体外的化学方法将其合成，
[0025] ⑶将 AGGAGGTAAAACAT 作为核糖结合位点（ribosome binding site，RBS),
[0026] ⑷在酶的 N端加入一个包含有 Met-Ser-Tyr2-His6-Asp-Tyr-Asp-IIe-Pro-Thr 2 的 His-标签（His-tag)。一个TEV蛋白酶位点（Pr0-Val-Phe-Ser-Gly)也被结合到合成基因 中，以便能切割His-标签。
[0027] (5)两个限制性内切酶位点Ncol，EcoRI被分别放在FribC基因的上游和下游。
[0028] (6)将上述合成基因插入有卡那霉素抗性的质粒，构建重组质粒。
[0029] ⑴重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，37°C至OD值为0.6,然后25°C诱导，加入 0. ImM IPTG诱导表达24小时，收集细菌。
[0030] (8)再通过镍柱纯化蛋白质，得到的纯化蛋白经过串联（MS-MS)质谱鉴定。
[0031] ⑶酶学性质研究：对FribC进行酶学研究，发现其是依赖烟氧化型酰胺腺嘌呤二 核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)作为辅因子的酶。能够使D-核糖和 多种修饰D-核糖比如5-氟-5-脱氧-D-核糖（5-fluoro-deoxy-D-ribose，5-FDR)脱氢， 将其转化生成链状结构的羧酸。
[0032] 通过紫外-分光光谱测定了其酶学动力学参数。证明了 FribC酶能够水解核糖，在 核糖的生物转化中发挥作用。并且就其催化活性和催化选择性（selectivity)而言，FribC 对D-核糖和5-氟-5-脱氧-D-核糖（5-FDR)没有显著差别。
[0033] 实验还揭示，FribC对不同核糖的端头（anomer)异构体每有选择性。此外 若使用氟代核糖为底物，则酶反应产物可以作为生物共轭（bio-conjugation)的辅基 (prosthetic group)和其他下游物质（如多肽，抗体，亲和体分子affibody等）进行生物 共轭交联（bio-conjugation)，以此引入同位素标记 18F。此18F标记物可以作为放射示踪物 (radiotracer)用于正电子发身寸断层扫描（positron emission tomography，PET) 〇
[0034] 具体操作过程如下：
[0035] 1、FribC酶序列的测定
[0036] 将在非洲加纳（5° 39' 32. 72"Ν，0° 11' 55. 26"W)分离鉴定的一种新型链霉 菌细菌由英国阿伯丁大学和圣安德鲁斯大学的研究团队分离出来，并进行全基因组测序 (whole genome sequencing)，再通过生物信息学技术（bioinformatics techniques)用 序列已知的酶和已经鉴定过的酶去和从这株链霉菌中的全基因组进行比对，归属假定的酶 (putative enzymes),找到的酶的可能的序列。再通过人为的综合分析（如找到此假定酶 的起始密码子和终止密码子），最终确定开放阅读框，找到FribC的基因，如序列1所述的基 因 ，FribC 酶的氨基酸序列如下：VSPAPELRPGRLSGKSAVVTGAARGIGRATALRFAREGALLTLTDVDGK ALGELAAELTAQGTEPATVA⑶VSVPADAERMIAAAVEAYDRLDVLVANAGILPLIRITDASADDWDHVMAVDGRGM FLTCKFAIERMAAAGGGAIVCLSSISGLAGQAGQSTYGPAKFVATGLTKHLAVEWADRGIRVNAVAPGTIRTDRVRR LPDEPGGAAYLAEIERRHPMGRIGEPDEVAAAIVFLASDEASFVTGAVLPVDGGYLAQ。。
[0037] 2、FribC酶的质粒构建，过量表达和纯化
[0038] 将DNA编码序列的设计与优化后，通过体外的方法将其化学合成，合成和后续 克隆服务提供商为美国DNA2. 0公司（美国DNA2. 0公司坐落于美国加利福尼亚州），将 AGGAGGTAAAACAT作为核糖结合位点（ribosome binding site, RBS)，并在酶的N端加入一 个包含有 Met-Ser-Tyr2-His6-Asp-Tyr-Asp-IIe-Pro-Thr 2 的 His-标签。一个 TEV 蛋白酶 位点（PiO-Val-Phe-Ser-Gly)也被结合到合成基因中，以便能切割His-标签。两个限制性 内切酶位点NcoI和EcoRI被分别放在FribC基因的上游和下游。将上述合成基因插入质 粒,构建重组质粒。
[0039] 重组质粒应用热休克方法转化入大肠杆菌BL21(DE3)。具体为将FribC质粒和大 肠杆菌转化态细胞混合均匀，42°C加热90秒进行转化。将含有FribC质粒的BL21 (DE3) Gold细胞放入含50mg/mL卡那霉素的LB培养基直至在600nm(0D600)的吸光度值达 到0.6左右。将其冷去到室温，加入终浓度为0. ImM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (isopropylthiogalactoside，IPTG)，25°C培养 24 小时。
[0040] 随后将细胞收集、裂解、离心、过滤、再过镍柱，用来将蛋白纯化。结合到镍柱上 的重组蛋白先用含Tris-HCl(20mM，pH8.0)，咪唑（20mM)和NaCl(0. 5M)的缓冲液冲洗， 接着用Tris-HCl (20mM，pH8. 0)，咪唑（50mM)和NaCl (0. 5M)冲洗。重组蛋白最终被含有 Tris-HCl(20mM，pH8. 0)，咪唑（400mM)和NaCl(0. 5M)的缓冲液冲下。随后纯化的蛋白应用 紫外光谱定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)和电喷雾-傅立叶变换-离子回旋共振质 谱（ESI-FT-MS)被用来分析蛋白。
[0041] 3、电喷雾-傅立叶变换-离子回旋共振质谱（ESI-FT-MS)检测酶反应产物
[0042] ESI-FT-MS被用来检测FribC酶催化四种不同底物进行酶反应的产物。酶反应 在 25mM，ρΗ7· 8 的 Tris-HCl 缓冲液中进行。包含有 FribC 酶（0· 625mg/mL)，NAD+(5mM)and MgCl2(IOmM)在不同底物存在的条件下即D-核糖（IOmM) ;5-氟-5-脱氧-D-核糖（IOmM); 4_二氟甲基-5-脱氧-D-核糖（IOmM) ;4_三氟甲基-5-脱-D-核糖（IOmM)，37°C隔夜反 应。反应结束后，体系被加热到90°C持续3分钟，再离心（13000rpm，3min)以除去蛋白，上 清液被用作ESI-FT-MS分析。开始用负离子（negtive ion)模式作为离子源模式，检测核 质比m/s范围为80-1000扫描，最终找到反应产物对应核质比m/s。
[0043] 4. FribC酶动力学实验
[0044] 基于紫外-可见分光光谱法的测定被用来检测FribC酶的活性。酶反应由加入 FribC酶（终浓度0· 26mg/mL)激活，反应体系为Tris-HCl缓冲液（25mM，ρΗ7· 8)，其中加入 5-FDR或D-核糖底物，ImM MgCl2, 2. 5mM氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+)在。加入底 物的浓度为〇· 5 μ M到200 μ Μ。在室温下，300nm to450nm紫外光谱被每隔0· 2分钟记录一 次，一共记录3分钟。在340nm下的增长是由于酶反应消耗NAD+而生成的还原态烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸（NADH)而造成的。
[0045] 在不同底物浓度下的FribC酶反应的最初速度（以NADH生成速度计）可以基于米 氏方程（Michaelis-Menten equation)作图。最终得￥_、1(111、1^和特异性常数（8口6(^1^;^ constant)这些酶动力学常数。
[0046] 表1为FribC酶以D-核糖和5-氟-5-脱氧核糖（5-FDR)作为底物得到的米曼氏 酶动力学参数。
[0047]
【权利要求】
1. 一种能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶，其特征在于：所述酶的编码基因 为序列1所述的基因序列，或序列2所述的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶，其特征在于：所述酶的底物为D-核糖或修饰D-核糖。
3. 根据权利要求2所述的能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶，其特征在于：所述修饰为D-核糖包括5-氟-5-脱氧-D-核糖、4-二氟甲基-5-脱氧-D-核糖或4-三氟 甲基-5-脱氧-D-核糖。
4. 根据权利要求1所述的能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶，其特征在于：所述酶的最适温度为37°C，最适pH值为7.8。
5. 权利要求1所述的能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶在核糖的生物转化 催化剂的应用。
6. 权利要求1所述的能够水解核糖和多种氟代核糖的短链脱氢酶在制备正电子发射 断层扫描的放射性示踪剂中的应用。
【文档编号】C12P7/42GK104404009SQ201410654574
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】马龙, 刁爱坡 申请人:天津科技大学